שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

Summary

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

חלבוני שלד חיידקיים כגון FtsZ ו- MreB מבצעים פונקציות חיוניות כגון חלוקת תאים ושמירה על צורת התא. יתר על כן, FtsZ ו-MreB התגלו כמטרות חשובות לגילוי אנטי-מיקרוביאלי חדש. מספר בדיקות פותחו כדי לזהות תרכובות המכוונות לקשירת נוקלאוטידים ופילמור של חלבונים ציטו-שלד אלה, בעיקר בהתמקדות ב- FtsZ. יתר על כן, רבים מהבדיקות הן מייגעות או עתירות עלויות, וכדי לברר אם חלבונים אלה הם המטרה התאית של התרופה נדרשים לעתים קרובות שיטות מרובות. לבסוף, גם רעילות התרופות לתאים אאוקריוטים מהווה בעיה. במאמר זה אנו מתארים בדיקה חד-שלבית המבוססת על תאים כדי לגלות מולקולות חדשות המכוונות לשלד ציטוקלטון חיידקי ולמזער פגיעות שעלולות להיות רעילות לתאים איקריוטים. שמרי ביקוע מקובלים על מסכים בעלי תפוקה גבוהה המבוססים על מיקרוסקופיה, ומסך חזותי יכול לזהות בקלות כל מולקולה שמשנה את פילמור FtsZ או MreB. הבדיקה שלנו משתמשת בלוח 96 בארות סטנדרטי ומסתמכת על היכולת של חלבוני השלד הציטו-שלד החיידקיים להתפלמר בתא אאוקריוטי כגון שמרי הביקוע. בעוד שהפרוטוקולים המתוארים כאן הם עבור שמרי ביקוע ומשתמשים ב-FtsZ מ-Staphylococcus aureus וב-MreB מ-Escherichia coli, הם ניתנים להתאמה בקלות לחלבונים ציטו-שלדיים חיידקיים אחרים שמתאספים בקלות לפולימרים בכל פונדקאי ביטוי אאוקריוטי. השיטה המתוארת כאן אמורה לסייע בגילוי נוסף של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים המכוונים לחלבוני שלד חיידקיים.

Introduction

העמידות הנרחבת כמעט לכל האנטיביוטיקות המשמשות כיום למאבק בזיהומים חיידקיים יצרה צורך מיידי בקטגוריות חדשות של אנטיביוטיקה. דו"ח משנת 2019 הצביע על כך שזיהומים עמידים לאנטיביוטיקה גרמו לאובדן חייהם של 1.27 מיליון בני אדם, מה שתרם למספר כולל של 4.95 מיליון מקרי מוות כאשר לוקחים בחשבון סיבוכים של זיהומים חיידקיים עמידים¹. בעוד שהוא עדיין יעיל בפרקטיקה הקלינית, ארסנל האנטיביוטיקה הנוכחי מכוון בעיקר לספקטרום צר של תהליכים תאיים, בעיקר התמקדות בדופן התא, דנ"א וסינתזה של חלבונים. במהלך חצי המאה האחרונה, פחות מ -30 חלבונים נוצלו באופן מסחרי כמטרות לפיתוח אנטי בקטריאלים חדשים ^2,3. טווח מוגבל זה ....

Protocol

1. ביטוי חלבוני שלד חיידקי המתויגים GFP ב-S. pombe

הערה: ראה טבלה 1 למידע על כל הפלסמידים והזנים המשמשים כאן. ראה טבלה 2 עבור כל הרכבי המדיה.

1. בצע שיבוט של E. coli MreB עם היתוך Gfp N-terminal (GFP-MreB) ו- S. aureus FtsZ הנושא GFP מסוף C (SaFtsZ-GFP) לתוך וקטור ביטוי

Discussion

עמידות מיקרוביאלית (AMR) היא איום בריאותי עולמי רציני, ויש צורך דחוף באנטיביוטיקה חדשה עם מטרות חדשות. שלד הציטו-שלד החיידקי התגלה כיעד אטרקטיבי לפיתוח אנטיביוטיקה חדשה, עם מעכבי מולקולות קטנות של חלבון חלוקת התא FtsZ, כגון TXA709, שכבר נמצא בשלב I של ניסויים קליניים³⁰. מספר שיטות פותח.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023