Дрожжи деления как платформа для антибактериального скрининга лекарств, нацеленных на белки цитоскелета бактерий

Summary

Дрожжи деления используются здесь в качестве гетерологичного хозяина для экспрессии бактериальных цитоскелетных белков, таких как FtsZ и MreB, в качестве трансляционных гибридных белков с GFP для визуализации их полимеризации. Кроме того, соединения, влияющие на полимеризацию, идентифицируются с помощью визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа.

Abstract

Бактериальные цитоскелетные белки, такие как FtsZ и MreB, выполняют важные функции, такие как деление клеток и поддержание их формы. Кроме того, FtsZ и MreB стали важными мишенями для открытия новых противомикробных препаратов. Было разработано несколько анализов для идентификации соединений, нацеленных на связывание нуклеотидов и полимеризацию этих белков цитоскелета, в первую очередь ориентированных на FtsZ. Более того, многие из анализов являются либо трудоемкими, либо дорогостоящими, и выяснение того, являются ли эти белки клеточной мишенью препарата, часто требует нескольких методов. Наконец, токсичность препаратов для эукариотических клеток также представляет проблему. Здесь мы описываем одноэтапный клеточный анализ для обнаружения новых молекул, нацеленных на бактериальный цитоскелет, и минимизации попаданий, которые могут быть потенциально токсичными для эукариотических клеток. Дрожжи деления поддаются высокопроизводительному скринингу, основанному на микроскопии, и визуальный экран может легко идентифицировать любую молекулу, которая изменяет полимеризацию FtsZ или MreB. В нашем анализе используется стандартный 96-луночный планшет, и он полагается на способность бактериальных цитоскелетных белков полимеризоваться в эукариотической клетке, такой как дрожжи деления. Хотя описанные здесь протоколы предназначены для дрожжей деления и используют FtsZ из золотистого стафилококка и MreB из кишечной палочки, они легко адаптируются к другим бактериальным белкам цитоскелета, которые легко собираются в полимеры в любых эукариотических экспрессирующих хозяевах. Описанный здесь метод должен помочь в дальнейшем открытии новых противомикробных препаратов, нацеленных на бактериальные цитоскелетные белки.

Introduction

Широко распространенная устойчивость почти ко всем антибиотикам, используемым в настоящее время для борьбы с бактериальными инфекциями, создала немедленную потребность в новых категориях антибиотиков. В отчете за 2019 год указано, что устойчивые к антибиотикам инфекции привели к потере 1,27 миллиона жизней, что в общей сложности составило 4,95 миллиона смертей, если учитывать осложнения от резистентных бактериальных инфекций¹. Несмотря на то, что антибиотики по-прежнему эффективны в клинической практике, они преимущественно нацелены на узкий спектр клеточных процессов, в первую очередь фокусируясь на клеточной стенке, ДНК и синтезе белка. За по....

Protocol

1. Экспрессия GFP-меченых белков бактериального цитоскелета у S. pombe

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите Таблицу 1 для получения информации обо всех плазмидах и штаммах, используемых здесь. Пожалуйста, смотрите Таблицу 2 для всех медиа-композиций.......

Discussion

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой серьезную глобальную угрозу здоровью, и существует острая потребность в новых антибиотиках с новыми мишенями. Бактериальный цитоскелет стал привлекательной мишенью для разработки новых антибиотиков, с низкомолекул.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023