A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Дрожжи деления используются здесь в качестве гетерологичного хозяина для экспрессии бактериальных цитоскелетных белков, таких как FtsZ и MreB, в качестве трансляционных гибридных белков с GFP для визуализации их полимеризации. Кроме того, соединения, влияющие на полимеризацию, идентифицируются с помощью визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа.
Бактериальные цитоскелетные белки, такие как FtsZ и MreB, выполняют важные функции, такие как деление клеток и поддержание их формы. Кроме того, FtsZ и MreB стали важными мишенями для открытия новых противомикробных препаратов. Было разработано несколько анализов для идентификации соединений, нацеленных на связывание нуклеотидов и полимеризацию этих белков цитоскелета, в первую очередь ориентированных на FtsZ. Более того, многие из анализов являются либо трудоемкими, либо дорогостоящими, и выяснение того, являются ли эти белки клеточной мишенью препарата, часто требует нескольких методов. Наконец, токсичность препаратов для эукариотических клеток также представляет проблему. Здесь мы описываем одноэтапный клеточный анализ для обнаружения новых молекул, нацеленных на бактериальный цитоскелет, и минимизации попаданий, которые могут быть потенциально токсичными для эукариотических клеток. Дрожжи деления поддаются высокопроизводительному скринингу, основанному на микроскопии, и визуальный экран может легко идентифицировать любую молекулу, которая изменяет полимеризацию FtsZ или MreB. В нашем анализе используется стандартный 96-луночный планшет, и он полагается на способность бактериальных цитоскелетных белков полимеризоваться в эукариотической клетке, такой как дрожжи деления. Хотя описанные здесь протоколы предназначены для дрожжей деления и используют FtsZ из золотистого стафилококка и MreB из кишечной палочки, они легко адаптируются к другим бактериальным белкам цитоскелета, которые легко собираются в полимеры в любых эукариотических экспрессирующих хозяевах. Описанный здесь метод должен помочь в дальнейшем открытии новых противомикробных препаратов, нацеленных на бактериальные цитоскелетные белки.
Широко распространенная устойчивость почти ко всем антибиотикам, используемым в настоящее время для борьбы с бактериальными инфекциями, создала немедленную потребность в новых категориях антибиотиков. В отчете за 2019 год указано, что устойчивые к антибиотикам инфекции привели к потере 1,27 миллиона жизней, что в общей сложности составило 4,95 миллиона смертей, если учитывать осложнения от резистентных бактериальных инфекций1. Несмотря на то, что антибиотики по-прежнему эффективны в клинической практике, они преимущественно нацелены на узкий спектр клеточных процессов, в первую очередь фокусируясь на клеточной стенке, ДНК и синтезе белка. За по....
1. Экспрессия GFP-меченых белков бактериального цитоскелета у S. pombe
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите Таблицу 1 для получения информации обо всех плазмидах и штаммах, используемых здесь. Пожалуйста, смотрите Таблицу 2 для всех медиа-композиций.......
Установка 96-луночного планшета для скрининга лекарств
Использование S. pombe для экспрессии C-концевого GFP-меченного S. aureus FtsZ из вектора (pREP42), содержащего тиаминовый репрессируемый промотор nmt41средней концентрации, было установлено ранее17, и аналогич.......
Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой серьезную глобальную угрозу здоровью, и существует острая потребность в новых антибиотиках с новыми мишенями. Бактериальный цитоскелет стал привлекательной мишенью для разработки новых антибиотиков, с низкомолекул.......
SMP, SR и AKS признают стипендии, полученные от Национального института научного образования и исследований, Департамент атомной энергии. RS признает внутреннюю финансовую поддержку со стороны Департамента атомной энергии, и эта работа поддерживается за счет исследовательского гранта RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) от Департамента биотехнологии (DBT). Авторы также выражают признательность В. Бадиринатху Конкималле за его комментарии, предложения и обсуждения на протяжении всей разработки протокола.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black | Thermo Scientific™ | 160376 | |
96-well plate | Corning | CLS3370 | |
A22 Hydrochloride | Sigma | SML0471 | Dissolved in DMSO |
Adenine | FormediumTM | DOC0229 | 225 mg/L of media |
Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | |
DMSO | Sigma | 317275 | |
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth) | FormediumTM | PMD0210 | See below for composition |
EDTA | Sigma | EDS-500G | |
epMotion® 96 with 2-position slider | Eppendorf | 5069000101 | |
Histidine | FormediumTM | DOC0144 | 225 mg/L of media |
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | German company | |
Leucine | FormediumTM | DOC0157 | 225 mg/L of media |
Lithium acetate | Sigma | 517992-100G | |
PC190723 | Merck | 344580 | Dissolved in DMSO |
Polyethylene glycol (PEG) | Sigma | 202398 | |
Thiamine | Sigma | T4625 | Filter sterilised |
Tris-Hydrochloride | MP | 194855 | |
Uracil | FormediumTM | DOC0214 | 225 mg/L of media, Store solution at 36°C |
YES (Yeast extract + supplements) Agar | FormediumTM | PCM0410 | See below for composition |
YES (Yeast extract + supplements) Broth | FormediumTM | PCM0310 | See below for composition |
Yeast (S. pombe) media | |||
Yeast extract + supplements (YES) | |||
Composition | g/L | ||
Yeast extract | 5 | ||
Dextrose | 30 | ||
Agar | 17 | ||
Adenine | 0.05 | ||
L-Histidine | 0.05 | ||
L-Leucine | 0.05 | ||
L-Lysine HCl | 0.05 | ||
Uracil | 0.05 | ||
Edinburg minimal medium (EMM) | |||
Composition | g/L | concentration | |
potassium hydrogen phthallate | 3 | 14.7mM | |
Na2HPO4 | 2.2 | 15.5 mM | |
NH4Cl | 5 | 93.5 mM | |
glucose | 2% (w/v) or 20 g/L | 111 mM | |
Salts (stock x 50) | 20 mL/L (v/v) | ||
Vitamins (stock x 1000) | 1 mL/L (v/v) | ||
Minerals (Stock x 10,000) | 0.1 mL/L (v/v) | ||
Salts x 50 | 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) | 52.5 | 0.26 M |
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) | 0.000735 | 4.99 mM | |
50 g/l KCl (0.67 M) | 50 | 0.67 M | |
2 g/l Na2SO4 (14.l mM) | 2 | 14.1 mM | |
Vitamins x 1000 | 1 g/l pantothenic acid | 1 | 4.20 mM |
10 g/l nicotinic acid | 10 | 81.2 mM | |
10 g/l inositol | 10 | 55.5 mM | |
10 mg/l biotin | 0.01 | 40.8 µM | |
Minerals x 10,000 | boric acid | 5 | 80.9 mM |
MnSO4 | 4 | 23.7 mM | |
ZnSO4.7H2O | 4 | 13.9 mM | |
FeCl2.6H2O | 2 | 7.40 mM | |
molybdic acid | 0.4 | 2.47 mM | |
KI | 1 | 6.02 mM | |
CuSO4.5H2O | 0.4 | 1.60 mM | |
citric acid | 10 | 47.6 mM | |
Strains/ Plasmids | |||
Strains | Description | Reference | |
CCD190 | Escherichia coli DH10β | Invitrogen | |
CCDY4 | MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
CCDY340 | CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 | |
CCDY346 | MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-] | Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR) | |
Plasmids | |||
pCCD3 | pREP42-GFP-EcMreB | Srinivasan et al., 2007 | |
pCCD713 | pREP42-SaFtsZ-GFP | Sharma et al., 2023 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved