将 Naegleria gruberi rDNA 的分子克隆转染到 N. gruberi 滋养体中

Summary

该方案描述了一种转染 Naegleria gruberi 滋养体的方法，该方法的构建体在 体外传代滋养体中以及通过包埋和脱囊保持。

Abstract

Naegleria trophozoites 的所有核糖体基因都维持在封闭的环状染色体外核糖体 DNA （rDNA） 含元件 （CERE） 中。虽然对 CERE 知之甚少，但对三种 Naegleria 物种的完整基因组序列分析清楚地表明，核基因组中没有 rDNA cistrons。此外，在 N. gruberi CERE 中已绘制出单一的 DNA 复制起点，支持 CERE 独立于核基因组进行复制的假设。CERE 的这一特性表明，有可能使用工程化的 CERE 将外源蛋白质引入 Naegleria 滋养体。作为探索在 Naegleria 中使用 CERE 作为载体的第一步，我们开发了一种方案，用克隆到 pGEM7zf + （pGRUB） 中的格鲁伯猪笼草 CERE 的分子克隆转染格鲁伯猪笼草。转染后，pGRUB 在 N. gruberi 滋养体中很容易检测到至少 7 次传代，以及通过包封和脱囊。作为对照，用骨架载体 pGEM7zf + 转染滋养体，而不转染 N. gruberi 序列 （pGEM）。转染到 N. gruberi 后第一次传代后未检测到 pGEM，表明其无法在真核生物体中复制。这些研究描述了 Naegleria 滋养体的转染方案，并证明 pGRUB 中的细菌质粒序列不会抑制转染的 CERE 克隆的成功转染和复制。此外，该转染方案对于理解驱动其在滋养体中复制的 CERE 的最小序列以及识别非核糖体序列 （NRS） 中的调节区域至关重要。

Introduction

Naegleria 属包含超过 45 个物种，尽管不太可能确定该物种的所有成员¹。Naegleria 可以以不同的形式存在：作为滋养体（变形虫），作为鞭毛，或者，当资源严重受限时，作为包囊 1,2,3,4。Naegleria 属因其一种特别危险的物种 Naegleria fowleri 而得到认可，被称为“食脑变形虫”（1,2,3,4,5,6,7），这是导致几乎普遍致命的原发性阿米巴脑膜脑炎的原因。

Naegleria 在位于核....

Protocol

本研究中使用的物种、试剂和设备的详细信息列在 材料表中。 补充文件 1 中提供了 17,004 个碱基对 pGRUB 构建体的序列。

1. 滋养体的培养

1. 将冷冻的 N. gruberi 滋养体在 37 °C 下解冻 3 分钟。
2. 将滋养体接种到修饰蛋白胨/酵母提取物/核酸/叶酸/血红素中的 T25 培养瓶中，其中含有 10% 胎牛血清 （PYNFH） 培养基和 2% 缓冲液?.......

Discussion

此处概述的方案非常简单，尽管每种构建体都可能需要一定程度的优化，特别是 DNA 转染试剂比例，具体取决于构建体的性质和所使用的 Naegleria 物种。我们只测试了一种使用此方案的市售转染试剂，但其他几种可能有效。鉴于使用了 CERE 的全长克隆，包含复制的功能起点，因此可以自主复制，因此该构建体具有所有必要的真核复制机制。如果要将部分克隆插入 pGEM 载体中，如果转染克隆不.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750