טרנספקציה של שיבוט מולקולרי של Naegleria gruberi rDNA לתוך N. gruberi Trophozoites

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להעברת טרופוזואיטים Naegleria gruberi עם מבנה הנשמר לאורך טרופוזואיטים חולפים במבחנה, כמו גם באמצעות אנציסטמנט והתרגשות.

Abstract

כל הגנים הריבוזומליים של Naegleria trophozoites נשמרים ב-DNA ריבוזומלי חוץ-כרומוזומלי סגור (rDNA) המכיל יסוד (CERE). בעוד שמעט ידוע על CERE, ניתוח רצף גנום מלא של שלושה מיני Naegleria מראה בבירור כי אין rDNA cistrons בגנום הגרעיני. יתר על כן, מקור DNA יחיד של שכפול מופה ב- N. gruberi CERE, מה שתומך בהשערה כי CERE משתכפל ללא תלות בגנום הגרעיני. מאפיין CERE זה מצביע על כך שייתכן שניתן יהיה להשתמש ב- CERE מהונדס כדי להחדיר חלבונים זרים לטרופוזואיטים Naegleria . כצעד הראשון בחקר השימוש ב-CERE כווקטור בנגלריה, פיתחנו פרוטוקול להעתקת N. gruberi עם שיבוט מולקולרי של N. gruberi CERE המשובט לתוך pGEM7zf+ (pGRUB). לאחר הטרנספקציה, pGRUB זוהה בקלות ב- N. gruberi trophozoites במשך שבעה קטעים לפחות, כמו גם באמצעות אנציסטמנט והתרגשות. כביקורת, טרופוזואיטים הודבקו בווקטור עמוד השדרה, pGEM7zf+, ללא רצפי N. gruberi (pGEM). pGEM לא זוהה לאחר המעבר הראשון לאחר טרנספקציה לתוך N. gruberi, מה שמצביע על חוסר יכולתו להשתכפל באורגניזם אאוקריוטי. מחקרים אלה מתארים פרוטוקול טרנספקציה עבור Naegleria trophozoites ומראים כי רצף פלסמיד חיידקי ב- pGRUB אינו מעכב העברה ושכפול מוצלחים של שיבוט CERE הנגוע. יתר על כן, פרוטוקול טרנספקציה זה יהיה קריטי להבנת הרצף המינימלי של CERE המניע את השכפול שלו בטרופוזואיטים, כמו גם בזיהוי אזורים רגולטוריים ברצף הלא ריבוזומלי (NRS).

Introduction

הסוג Naegleria מכיל מעל 45 מינים, אם כי לא סביר שכל בני המין זוהו¹. Naegleria יכול להתקיים בצורות שונות: כמו trophozoites (אמבות), כמו flagellates, או, כאשר המשאבים מוגבלים מאוד, כמו ציסטות 1,2,3,4. הסוג Naegleria מוכר בזכות מין אחד מסוכן במיוחד, Naegleria fowleri, המכונה "אמבה אוכלת מוח" (נסקר ב-1,2,3,4,5,6,7), שהיא הגורם לדלקת קרום המוח האמבית הראשונית הקטלנית כמעט באופן אוניברסלי.

Protocol

פרטי המינים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים. הרצף של מבנה pGRUB של 17,004 זוגות בסיסים מסופק בקובץ משלים 1.

1. טיפוח trophozoites

1. הפשירו טרופוזואיטים קפואים של N. gruberi בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות.
2. יש לחסן את הטרופוזואיטים .......

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט מאוד, אם כי סביר להניח שכל מבנה ידרוש מידה מסוימת של אופטימיזציה, במיוחד של יחס מגיב DNA-transfection, בהתאם לאופי המבנה והמין של Naegleria בשימוש. בדקנו רק מגיב טרנספקציה אחד זמין מסחרית באמצעות פרוטוקול זה, אך סביר להניח שכמה אחרים עשויים להיות יעילים. בהתחשב בכך שי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750