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Questo protocollo descrive una metodologia per trasfettare i trofozoiti di Naegleria gruberi con un costrutto che viene mantenuto per tutta la durata del passaggio dei trofozoiti in vitro, nonché attraverso l'incistamento e l'escissione.
Tutti i geni ribosomiali dei trofozoiti di Naegleria sono mantenuti in un elemento circolare chiuso contenente DNA ribosomiale extracromosomico (rDNA) (CERE). Mentre si sa poco sul CERE, un'analisi completa della sequenza del genoma di tre specie di Naegleria dimostra chiaramente che non ci sono cistrroni di rDNA nel genoma nucleare. Inoltre, una singola origine di replicazione del DNA è stata mappata nel CERE di N. gruberi , supportando l'ipotesi che il CERE si replichi indipendentemente dal genoma nucleare. Questa caratteristica del CERE suggerisce che potrebbe essere possibile utilizzare il CERE ingegnerizzato per introdurre proteine estranee nei trofozoiti di Naegleria . Come primo passo nell'esplorazione dell'uso di un CERE come vettore in Naegleria, abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare N. gruberi con un clone molecolare di N. gruberi CERE clonato in pGEM7zf+ (pGRUB). Dopo la trasfezione, pGRUB è stato prontamente rilevato nei trofozoiti di N. gruberi per almeno sette passaggi, nonché attraverso incistamento ed escissione. Come controllo, i trofozoiti sono stati trasfettati con il vettore backbone, pGEM7zf+, senza le sequenze di N. gruberi (pGEM). Il pGEM non è stato rilevato dopo il primo passaggio successivo alla trasfezione in N. gruberi, indicando la sua incapacità di replicarsi in un organismo eucariotico. Questi studi descrivono un protocollo di trasfezione per i trofozoiti di Naegleria e dimostrano che la sequenza plasmidica batterica in pGRUB non inibisce la trasfezione e la replicazione del clone CERE trasfettato. Inoltre, questo protocollo di trasfezione sarà fondamentale per comprendere la sequenza minima del CERE che guida la sua replicazione nei trofozoiti, nonché per identificare le regioni regolatorie nella sequenza non ribosomiale (NRS).
Il genere Naegleria contiene oltre 45 specie, anche se è improbabile che tutti i membri della specie siano stati identificati1. La Naegleria può esistere in diverse forme: come trofozoiti (amebe), come flagellati o, quando le risorse sono fortemente limitate, come cisti 1,2,3,4. Il genere Naegleria è noto per la sua specie particolarmente pericolosa, Naegleria fowleri, nota come "l'ameba mangia-cervello" (recensita in 1,2,3,4,5,6,7
I dettagli delle specie, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. La sequenza del costrutto pGRUB di 17.004 coppie di basi è fornita nel File supplementare 1.
1. Allevamento di trofozoiti
La PCR dei trofozoiti che sono stati trasfettati con pGRUB dimostra che il CERE trasfettato viene rilevato attraverso almeno sette passaggi dei trofozoiti, nonché incistamento ed escisto (Figura 4). I primer utilizzati nella PCR ricottura sia al vettore pGEM che alla sequenza CERE, garantendo così che la PCR non rilevi il CERE nativo. La PCR dopo la trasfezione di pGEM in trofozoiti ha indicato che pGEM era negativo (Figura 4), indicando che il plasmide vuoto .......
Il protocollo qui delineato è molto semplice, anche se ogni costrutto richiederà probabilmente un certo grado di ottimizzazione, in particolare del rapporto reagente DNA-trasfezione, a seconda della natura del costrutto e della specie di Naegleria utilizzata. Abbiamo testato solo un reagente di trasfezione disponibile in commercio utilizzando questo protocollo, ma è probabile che molti altri possano essere efficaci. Dato che viene utilizzato un clone a lunghezza intera del CERE, contenente un'origine funziona.......
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse finanziari.
Questi studi sono stati parzialmente finanziati da una sovvenzione del George F. Haddix Fund della Creighton University (KMD). La Figura 1 viene generata in biorender.com e la Figura 3 viene generata in benchling.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Bio Rad | 161-3102 | |
Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | A-7330 | |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C-4901 | |
Crushed ice | |||
Culture Flasks, T-75 | Thermo Scientific | 130190 | |
Culture Plate, 6-well | Corning | 3506 | |
DNAse | Sigma Aldrich | D-4527 | |
EDTA, 0.5 M | Affymetrix | 15694 | |
Electropheresis Gel Apparatus | Amersham Biosciences | 80-6052-45 | |
Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Eppendorf Tubes, 2 mL | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
Ethanol, 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
Ethidium Bromide | Sigma Aldrich | E-8751 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | |
Folic Acid | Sigma Aldrich | F7876-25G | |
GeneRuler 1 kb Plus Ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific | UN2789 | |
GoTaq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
Heating Block | Thermo Scientific | 88871001 | |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Hemin | Sigma Aldrich | 51280 | |
Iron Chloride | Sigma Aldrich | 372870-256 | |
Ligase | NEB | M2200S | |
Magneisum Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
Microfuge | Thermo Scientific | MySpin 12 | |
Microscope | Nikon | TMS | |
N. gruberi | ATCC | 30224 | |
Nucleic Acid | Chem Impex Int’l | #01625 | |
Peptone | Gibco | 211677 | |
pGEM | Promega | P2251 | |
Potassium Phosphate | Sigma Aldrich | P0662-500G | |
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit | Bio Rad | 1645052 | |
Sodium Chloride | MCB Reagents | SX0420 | |
Sodium Phosphate, dibasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
Tabletop Centrifuge | eppendorf | 5415R | |
Tris, base | Sigma Aldrich | T1503-1KG | |
Trypan Blue, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
ViaFect Reagent | Promega | E4981 | |
Weigh Scale | Denver Instruments | APX-60 | |
Yeast Extract | Gibco | 212750 |
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