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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo protocollo descrive una metodologia per trasfettare i trofozoiti di Naegleria gruberi con un costrutto che viene mantenuto per tutta la durata del passaggio dei trofozoiti in vitro, nonché attraverso l'incistamento e l'escissione.

Abstract

Tutti i geni ribosomiali dei trofozoiti di Naegleria sono mantenuti in un elemento circolare chiuso contenente DNA ribosomiale extracromosomico (rDNA) (CERE). Mentre si sa poco sul CERE, un'analisi completa della sequenza del genoma di tre specie di Naegleria dimostra chiaramente che non ci sono cistrroni di rDNA nel genoma nucleare. Inoltre, una singola origine di replicazione del DNA è stata mappata nel CERE di N. gruberi , supportando l'ipotesi che il CERE si replichi indipendentemente dal genoma nucleare. Questa caratteristica del CERE suggerisce che potrebbe essere possibile utilizzare il CERE ingegnerizzato per introdurre proteine estranee nei trofozoiti di Naegleria . Come primo passo nell'esplorazione dell'uso di un CERE come vettore in Naegleria, abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare N. gruberi con un clone molecolare di N. gruberi CERE clonato in pGEM7zf+ (pGRUB). Dopo la trasfezione, pGRUB è stato prontamente rilevato nei trofozoiti di N. gruberi per almeno sette passaggi, nonché attraverso incistamento ed escissione. Come controllo, i trofozoiti sono stati trasfettati con il vettore backbone, pGEM7zf+, senza le sequenze di N. gruberi (pGEM). Il pGEM non è stato rilevato dopo il primo passaggio successivo alla trasfezione in N. gruberi, indicando la sua incapacità di replicarsi in un organismo eucariotico. Questi studi descrivono un protocollo di trasfezione per i trofozoiti di Naegleria e dimostrano che la sequenza plasmidica batterica in pGRUB non inibisce la trasfezione e la replicazione del clone CERE trasfettato. Inoltre, questo protocollo di trasfezione sarà fondamentale per comprendere la sequenza minima del CERE che guida la sua replicazione nei trofozoiti, nonché per identificare le regioni regolatorie nella sequenza non ribosomiale (NRS).

Introduction

Il genere Naegleria contiene oltre 45 specie, anche se è improbabile che tutti i membri della specie siano stati identificati1. La Naegleria può esistere in diverse forme: come trofozoiti (amebe), come flagellati o, quando le risorse sono fortemente limitate, come cisti 1,2,3,4. Il genere Naegleria è noto per la sua specie particolarmente pericolosa, Naegleria fowleri, nota come "l'ameba mangia-cervello" (recensita in 1,2,3,4,5,6,7

Protocol

I dettagli delle specie, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. La sequenza del costrutto pGRUB di 17.004 coppie di basi è fornita nel File supplementare 1.

1. Allevamento di trofozoiti

  1. Scongelare i trofozoiti di N. gruberi congelati a 37 °C per 3 min.
  2. Inoculare i trofozoiti in fiasche T25 in peptone/estratto di lievito/acido nucleico/acido folico/.......

Representative Results

La PCR dei trofozoiti che sono stati trasfettati con pGRUB dimostra che il CERE trasfettato viene rilevato attraverso almeno sette passaggi dei trofozoiti, nonché incistamento ed escisto (Figura 4). I primer utilizzati nella PCR ricottura sia al vettore pGEM che alla sequenza CERE, garantendo così che la PCR non rilevi il CERE nativo. La PCR dopo la trasfezione di pGEM in trofozoiti ha indicato che pGEM era negativo (Figura 4), indicando che il plasmide vuoto .......

Discussion

Il protocollo qui delineato è molto semplice, anche se ogni costrutto richiederà probabilmente un certo grado di ottimizzazione, in particolare del rapporto reagente DNA-trasfezione, a seconda della natura del costrutto e della specie di Naegleria utilizzata. Abbiamo testato solo un reagente di trasfezione disponibile in commercio utilizzando questo protocollo, ma è probabile che molti altri possano essere efficaci. Dato che viene utilizzato un clone a lunghezza intera del CERE, contenente un'origine funziona.......

Acknowledgements

Questi studi sono stati parzialmente finanziati da una sovvenzione del George F. Haddix Fund della Creighton University (KMD). La Figura 1 viene generata in biorender.com e la Figura 3 viene generata in benchling.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBio Rad161-3102
Ammonium AcetateSigma AldrichA-7330
Calcium ChlorideSigma AldrichC-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75Thermo Scientific130190
Culture Plate, 6-wellCorning3506
DNAseSigma AldrichD-4527
EDTA, 0.5 MAffymetrix15694
Electropheresis Gel ApparatusAmersham Biosciences80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mLFisher Scientific05-408-138
Ethanol, 100%Decon Laboratories2716
Ethidium BromideSigma AldrichE-8751
Fetal Bovine SerumGibco26140
Folic AcidSigma AldrichF7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus LadderThermo ScientificSM1331
Glacial Acetic AcidFisher ScientificUN2789
GoTaq Green PCR Master MixPromegaM7122
Heating BlockThermo Scientific88871001
HemacytometerHausser Scientific1483
HeminSigma Aldrich51280
Iron ChlorideSigma Aldrich372870-256
LigaseNEBM2200S
Magneisum ChlorideFisher ScientificM33-500
MicrofugeThermo ScientificMySpin 12
MicroscopeNikonTMS
N. gruberiATCC30224
Nucleic AcidChem Impex Int’l#01625
PeptoneGibco211677
pGEMPromegaP2251
Potassium PhosphateSigma AldrichP0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply UnitBio Rad1645052
Sodium ChlorideMCB ReagentsSX0420
Sodium Phosphate, dibasicSigma AldrichS2554
Tabletop Centrifugeeppendorf5415R
Tris, baseSigma AldrichT1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%Gibco15250-061
ViaFect ReagentPromegaE4981
Weigh ScaleDenver InstrumentsAPX-60
Yeast ExtractGibco212750

References

  1. De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145 (Suppl), S2-S9 (2014).
  2. De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Proto....

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Parole chiave Naegleria gruberiRDNADNA ribosomiale extracromosomicoCERETrasfezionePGRUBPGEM7zfTrofozoitiIncistamentoEscistoReplicazioneNRS

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