Transfecção de um clone molecular de rDNA de Naegleria gruberi em trofozoítos de N. gruberi

Summary

Este protocolo descreve uma metodologia para transfectar trofozoítos de Naegleria gruberi com uma construção que é mantida durante a passagem de trofozoítos in vitro, bem como por meio de encistamento e excistamento.

Abstract

Todos os genes ribossômicos dos trofozoítos de Naegleria são mantidos em um elemento circular fechado contendo DNA ribossômico extracromossômico (rDNA) (CERE). Embora pouco se saiba sobre o CERE, uma análise completa da sequência do genoma de três espécies de Naegleria demonstra claramente que não há cistrons de rDNA no genoma nuclear. Além disso, uma única origem de replicação do DNA foi mapeada no N. gruberi CERE, apoiando a hipótese de que o CERE se replica independentemente do genoma nuclear. Esta característica do CERE sugere que pode ser possível usar o CERE projetado para introduzir proteínas estranhas em trofozoítos de Naegleria . Como primeiro passo para explorar o uso de um CERE como vetor em Naegleria, desenvolvemos um protocolo para transfectar N. gruberi com um clone molecular do CERE de N. gruberi clonado em pGEM7zf+ (pGRUB). Após a transfecção, o pGRUB foi prontamente detectado em trofozoítos de N. gruberi por pelo menos sete passagens, bem como por encistamento e excistamento. Como controle, os trofozoítos foram transfectados com o vetor backbone, pGEM7zf+, sem as sequências de N. gruberi (pGEM). O pGEM não foi detectado após a primeira passagem após a transfecção em N. gruberi, indicando sua incapacidade de se replicar em um organismo eucariótico. Esses estudos descrevem um protocolo de transfecção para trofozoítos de Naegleria e demonstram que a sequência de plasmídeo bacteriano em pGRUB não inibe a transfecção e replicação bem-sucedidas do clone CERE transfectado. Além disso, este protocolo de transfecção será fundamental para entender a sequência mínima do CERE que impulsiona sua replicação em trofozoítos, bem como identificar regiões regulatórias na sequência não ribossômica (NRS).

Introduction

O gênero Naegleria contém mais de 45 espécies, embora seja improvável que todos os membros da espécie tenham sido identificados¹. A naegleria pode existir de diferentes formas: como trofozoítos (amebas), como flagelados ou, quando os recursos são severamente limitados, como cistos 1,2,3,4. O gênero Naegleria é reconhecido por sua única espécie particularmente perigosa, Naegleria fowleri, conhecida como 'a ameba comedora de cérebro' (revisada em 1,2....

Protocol

Os detalhes das espécies, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais. A sequência da construção pGRUB de 17.004 pares de bases é fornecida no Arquivo Suplementar 1.

1. Cultura de trofozoítos

1. Descongele os trofozoítos de N. gruberi congelados a 37 °C durante 3 min.
2. Inocular trofozoítos em frascos T25 em peptona/extrato de levedura/ácido nucleico/ácido fólico/hemin.......

Discussion

O protocolo descrito aqui é muito simples, embora cada construção provavelmente exija algum grau de otimização, particularmente da proporção de reagentes de transfecção de DNA, dependendo da natureza da construção e da espécie de Naegleria usada. Testamos apenas um reagente de transfecção disponível comercialmente usando este protocolo, mas é provável que vários outros possam ser eficazes. Dado que um clone completo do CERE é usado, contendo uma origem funcional de replicação e, portanto, re.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bio Rad	161-3102
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	A-7330
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C-4901
Crushed ice
Culture Flasks, T-75	Thermo Scientific	130190
Culture Plate, 6-well	Corning	3506
DNAse	Sigma Aldrich	D-4527
EDTA, 0.5 M	Affymetrix	15694
Electropheresis Gel Apparatus	Amersham Biosciences	80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Ethanol, 100%	Decon Laboratories	2716
Ethidium Bromide	Sigma Aldrich	E-8751
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140
Folic Acid	Sigma Aldrich	F7876-25G
GeneRuler 1 kb Plus Ladder	Thermo Scientific	SM1331
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	UN2789
GoTaq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Heating Block	Thermo Scientific	88871001
Hemacytometer	Hausser Scientific	1483
Hemin	Sigma Aldrich	51280
Iron Chloride	Sigma Aldrich	372870-256
Ligase	NEB	M2200S
Magneisum Chloride	Fisher Scientific	M33-500
Microfuge	Thermo Scientific	MySpin 12
Microscope	Nikon	TMS
N. gruberi	ATCC	30224
Nucleic Acid	Chem Impex Int’l	#01625
Peptone	Gibco	211677
pGEM	Promega	P2251
Potassium Phosphate	Sigma Aldrich	P0662-500G
PowerPac HC Electropharesis Power Supply Unit	Bio Rad	1645052
Sodium Chloride	MCB Reagents	SX0420
Sodium Phosphate, dibasic	Sigma Aldrich	S2554
Tabletop Centrifuge	eppendorf	5415R
Tris, base	Sigma Aldrich	T1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%	Gibco	15250-061
ViaFect Reagent	Promega	E4981
Weigh Scale	Denver Instruments	APX-60
Yeast Extract	Gibco	212750