TZ תכנן את הניסויים. TZ, VD, SB ו-JP ביצעו את הניסויים. TZ ו-VD הפיקו נתונים וניתחו את הנתונים. TZ ו-YX כתבו את כתב היד. TZ ו-GG תיקנו את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי בית החולים לילדים UPMC בפיטסבורג.

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

<ol>
	<li>Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+recombinant+adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+for+gene+transfer.">Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer.</a> BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).</li><li>Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+targeted+adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+for+human+gene+therapy.">Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy.</a> Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).</li><li>Bilal, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+large-scale+Adeno-Associated+Virus+(AAV)+production.">Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production.</a> Curr Protoc. 3 (5), e757 (2023).</li><li>Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+adeno-associated+viral+vector+serotype-9+carrying+the+human+survival+motor+neuron+gene.">Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene.</a> Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Publisher+Correction:+Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).</li><li>Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+discovery+of+novel+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14 (2012).</li><li>Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+purification+of+AAV+and+delivery+to+the+pancreas+by+intraductal+administration.">Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).</li><li>Berns, K. I., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy+for+human+liver+diseases.">Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases.</a> Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).</li><li>Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+band+centrifugation+for+the+separation+and+quantification+of+empty+and+full+AAV+particles.">Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+observation+of+the+recombinant+adeno-associated+virus+2+using+transmission+electron+microscopy+and+atomic+force+microscopy.">Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy.</a> Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ-formable,+dynamic+crosslinked+poly+(ethylene+glycol)+carrier+for+localized+adeno-associated+virus+infection+and+reduced+off-target+effects.">In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects.</a> Commun Biol. 6 (1), 508 (2023).</li><li>Sena-Esteves, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+fully+packaged+virions+in+column-purified+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+preparations+by+iodixanol+gradient+centrifugation+followed+by+anion-exchange+column+chromatography.">Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638 (2020).</li><li>Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+avian+encephalomyelitis+virus+by+ultracentrifugation+in+a+nonlinear+cesium+chloride+gradient.">Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient.</a> Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).</li></ol>

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

כאן, פרוטוקול מתקדם מבחינה טכנית לייצור בקנה מידה גדול של וקטורי AAV באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים (CF10) מוצג, המייצג שיפור משמעותי לעומת שיטות צלחת תרבית תאים קונבנציונליות. השימוש במפעלי תאים מפשט את תהליך טיפוח כמויות גדולות של תאים, ומקל על ייצור נגיפי AAV בצורה יעילה יותר1. כמו כן, על ידי אופטימיזציה של תנאי התרבית, במיוחד עם DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10 mM HEPES ו 2% FBS, ייצור ויראלי משופר באופן משמעותי אושר, המציין את התפקיד המכריע של הסביבה התאית בתפוקת הנגיף.
פרוטוקול הטיהור המתוקן, המשלב AAV הן מכדורי תאים והן ממדיות תרבית, מטפל בבעיה הנפוצה של תפוקת וירוסים נמוכה וטומאה הנראית בפרוטוקולים קיימים רבים. השלבים של מיצוי כלורופורם וחלוקה דו-פאזית מימית מסירים ביעילות את רוב מזהמי החלבון, כאשר AAV נשאר מסיס בשלב האמוניום גופרתי. ניתן לייחס את השיפור הן בתפוקה והן בטוהר של וקטורי AAV באמצעות חלוקה דו-פאזית PEG/מימית בשילוב עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול, בניגוד לשיטות אולטרה-צנטריפוגות מסורתיות של שיפוע, להפרדה ראשונית משופרת עם חלוקה דו-פאזית PEG/מימית, טוהר מזוקק עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול והפחתה בטיהור משותף של מזהמים12. ראשית, הכנסת חלוקה דו-פאזית PEG/מימית לפני אולטרה-צנטריפוגה משפרת באופן משמעותי את ההפרדה הראשונית של חלקיקי AAV מפסולת תאית ומזהמים אחרים. PEG, פולימר בעל משקל מולקולרי גבוה, כאשר הוא מעורבב עם תמיסה מימית, יוצר שני שלבים נפרדים13. לווקטורים AAV יש נטייה להתחלק באופן מועדף לאחד השלבים הללו (בדרך כלל השלב העשיר ב-PEG), בעוד שמזהמים וזיהומים רבים מחולקיםל-13 האחרים. חלוקה סלקטיבית זו מרכזת ביעילות את חלקיקי ה-AAV ומסירה חלק ניכר מהזיהומים עוד לפני האולטרה-צנטריפוגה, ובכך מגדילה את התפוקה ומפחיתה את עומס המזהמים הנכנס לשלב13 של האולטרה-צנטריפוגה. שנית, אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול מעדנת עוד יותר את הטוהר של וקטורי AAV. יודיקסנול, תווך שיפוע איזו-אוסמולרי לא יוני, מאפשר הפרדה עדינה ומבוקרת יותר בהשוואה לשיפועי CsCl מסורתיים14. בשיפוע זה, חלקיקי AAV נודדים למיקום בשיפוע המתאים לצפיפות הציפה שלהם14. חשוב לציין, תהליך זה יעיל בהפרדת קפסידים AAV מלאים (המכילים את המטען הגנטי) מקפסידים ריקים (חסרי חומר גנטי), שהוא גורם מכריע באיכות הווקטור. אופיו האיזו-אוסמולרי של יודיקסנול גם שומר על שלמות הקפסידים AAV טוב יותר מאשר סוכנים היפראוסמולרים כמו CsCl, מה שעשוי להוביל לתפוקה גבוהה יותר של וקטורים שלמים ופונקציונליים14. לבסוף, שיטות אולטרה-צנטריפוגות מסורתיות, במיוחד אלה המשתמשות בשיפועי CsCl, יכולות לפעמים לטהר במשותף מזהמים בעלי צפיפות ציפה דומה לווקטורים AAV15. על ידי שימוש במחיצות PEG כשלב מקדים, העומס של מזהמים כאלה מופחת באופן משמעותי לפני אולטרה-צנטריפוגה13. הפחתה זו בעומס המזהמים פירושה ששיפוע היודיקסנול יכול לעבוד בצורה יעילה וסלקטיבית יותר בטיהור וקטורי AAV, מה שמוביל לטוהר גבוה יותר15.
הטוהר והאיכות של וקטורי AAV מוערכים בקפדנות באמצעות צביעת כסף ו- TEM11. התצפית של שלושה פסים עיקריים המתאימים לחלבוני קפסיד AAV VP1, VP2 ו- VP3, עם טוהר העולה על 90%, מצביעה על התאמתם של וקטורי AAV אלה לשימוש in vivo . ניתוח TEM לקביעת יחס קפסיד מלא לריק הוא חיוני במיוחד, שכן שיעור גבוה של קפסידים ריקים יכול להוביל ליעילות מופחתת של העברת גנים ולתגובות חיסוניות פוטנציאליות11. בדיקת איכות זו, למרות שהיא חיונית, מוסיפה למורכבות הפרוצדורלית ועשויה לדרוש מומחיות טכנית נוספת.
לסיכום, הפרוטוקול מציע התקדמות טכנית משמעותית בייצור וקטורים AAV, במיוחד במונחים של מדרגיות וטוהר. עם זאת, המורכבויות הקשורות לתהליך הטיהור והצורך בציוד ומומחיות מיוחדים עשויים עדיין להוות מגבלה קלה ליישומו במסגרות מחקר מסוימות. חידוד נוסף ופישוט של טכניקות אלה יכול להפוך גישה זו לנגישה יותר וישימה באופן נרחב בתחום המחקר של ריפוי גנטי.

וקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) הפכו לכלי חיוני במחקר ריפוי גנטי, ומציעים שילוב ייחודי של יעילות ובטיחות להעברת גנים1. שיטות מסורתיות ליצירת AAVs בסביבות מעבדה היו מרכזיות בקידום ההבנה והיישום שלנו של ריפוי גנטי2. עם זאת, שיטות אלה, למרות שהן בסיסיות, מציגות מגבלות ואתגרים מסוימים, במיוחד במונחים של תפוקה, יעילות זמן ואיכות הווקטורים המיוצרים, בעיקר היחס בין חלקיקים מלאים לריקים3.
ההליך הקונבנציונלי לייצור AAV כולל בעיקר טרנספקציה של תאי HEK2934. תהליך זה, המתבצע בדרך כלל בצלחות תרבית תאים, דורש מהתאים להיות נגועים בפלסמיד המכיל את הגן המעניין יחד עם פלסמיד עוזר ופלסמיד קפסיד AAV 5,6. לאחר ההדבקה, התאים מייצרים חלקיקי AAV, אשר לאחר מכן נקצרים ומטוהרים 5,6. תהליך הטיהור כולל לעתים קרובות אולטרה-צנטריפוגה, שלב קריטי בהשגת וקטורי AAV בעלי טוהר גבוה7. אולטרה-צנטריפוגה, במיוחד באמצעות צזיום כלוריד (CsCl) או שיפוע יודיקסנול, היא שיטה סטנדרטית להפרדת חלקיקי AAV מפסולת תאית וזיהומים אחרים8. שלב זה חיוני להשגת הטוהר והריכוז הרצויים של וקטורי AAV, אשר משפיע ישירות על יעילותם בהעברת גנים8. למרות השימוש הנרחב שלה, אולטרה צנטריפוגה מסורתית יש חסרונות שלה. לדוגמה, התפוקה של וקטורי AAV משיטה זו יכולה להיות משתנה ולעתים קרובות נמוכה, מה שמציב אתגרים משמעותיים כאשר יש צורך בכמויות גדולות של וקטורים בעלי טיטר גבוה, במיוחד עבור מחקרי in vivo או מודלים של בעלי חיים גדולים9.
היבט קריטי נוסף של איכות וקטור AAV הוא היחס בין חלקיקים מלאים לריקים10. תכשירי AAV מכילים לעתים קרובות תערובת של חלקיקים אלה; עם זאת, רק החלקיקים המלאים מכילים את החומר הגנטי הטיפולי. נוכחות של שיעור גבוה של חלקיקים ריקים יכולה להפחית באופן משמעותי את היעילות של העברת גנים10. הערכה ואופטימיזציה של היחס בין חלקיקים מלאים לריקים היא אפוא פרמטר מפתח בהערכת היעילות של וקטורי AAV. שיטות מסורתיות, בעוד שהן מסוגלות לייצר וקטורי AAV, מתקשות לעתים קרובות לשלוט ביחס זה באופן עקבי, מה שמוביל לשינויים בעוצמה הווקטורית10.
כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים ללא שימוש בתרביות תאי HEK293T עתירות עבודה בצלחות תאים, תוך שילוב פוליאתילן גליקול/חלוקה דו-פאזית מימית עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול. טוהר וקטור AAV מאושר באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף, ויחס החלקיקים המלא לריק נקבע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), העומד בתקני האיכות של מחקרי in vivo 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T/17 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.01217.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>324506-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Henke-Ject syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% pluronic F68 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>24-040-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% Precast Protein Gels</td>
			<td>biorad</td>
			<td>4561094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% PEG solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1458-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6 reference full capsids</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>RS-AAV6-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;PES Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Cassettes, 10 K MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI66810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-569-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10567022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF300-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9732-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nest Biofactory 10 chamber</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>771302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-DJ</td>
			<td>Cell BioLab</td>
			<td>VPK-420-DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-RC6</td>
			<td>Cell BioLab</td>
			<td>VPK-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdDeltaF6</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI Max</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>49553-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.07242.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickSeal tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9144589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1162245000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a streamlined and standardized procedure for generating high-titer, high-quality adeno-associated virus vectors utilizing a cell factory platform

מחקר פרה-קליני בריפוי גנטי, במיוחד במודלים של מכרסמים ובעלי חיים גדולים, מחייב ייצור של וקטורי AAV בעלי תפוקה וטוהר גבוהים. גישות מסורתיות במעבדות מחקר כוללות לעתים קרובות שימוש נרחב בצלחות תרבית תאים לגידול תאים HEK293T, תהליך שיכול להיות מייגע ובעייתי כאחד. כאן מוצגת שיטה פנימית ייחודית, המפשטת תהליך זה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים ספציפית (או מחסניות תאים, CF10). שילוב של פוליאתילן גליקול/חלוקה דו-פאזית מימית עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול משפר הן את התפוקה והן את הטוהר של וקטורי AAV שנוצרו. טוהר וקטורי ה-AAV מאומת באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף, בעוד שהיחס בין חלקיקים מלאים לריקים נקבע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM). גישה זו מציעה פלטפורמה יעילה לייצור וקטורי AAV בתפוקות גבוהות, יחד עם שיטת טיהור משופרת כדי לענות על דרישות האיכות למחקרי in vivo .

Adeno-associated virus (AAV) vectors have become an indispensable tool in gene therapy research, offering a unique combination of efficacy and safety for gene delivery1. Traditional methods for generating AAVs in laboratory settings have been pivotal in advancing our understanding and application of gene therapy2. However, these methods, while foundational, exhibit certain limitations and challenges, especially in terms of yield, time efficiency, and the quality of the vectors produced, notably the ratio of full to empty particles3.
The conventional procedure for AAV production primarily involves the transfection of HEK293 cells4. This process, typically conducted in cell culture dishes, requires the cells to be transfected with a plasmid containing the gene of interest along with helper plasmid&#160;and AAV capsid plasmid5,6. Following transfection, the cells produce AAV particles, which are then harvested and purified5,6. The purification process often involves ultracentrifugation, a critical step in obtaining high-purity AAV vectors7. Ultracentrifugation, particularly using cesium chloride (CsCl) or iodixanol gradient, is a standard method for separating AAV particles from cellular debris and other impurities8. This step is crucial for achieving the desired purity and concentration of AAV vectors, which directly impacts their efficacy in gene delivery8. Despite its widespread use, traditional ultracentrifugation has its drawbacks. For example, the yield of AAV vectors from this method can be variable and often low, which poses significant challenges when large quantities of high-titer vectors are needed, particularly for in vivo studies or large animal models9.
Another critical aspect of AAV vector quality is the ratio of full to empty particles10. AAV preparations often contain a mixture of these particles; however, only the full particles contain the therapeutic genetic material. The presence of a high proportion of empty particles can significantly reduce the efficiency of gene delivery10. Assessing and optimizing the ratio of full to empty particles is thus a key parameter in evaluating the efficacy of AAV vectors. Traditional methods, while capable of producing AAV vectors, often struggle to control this ratio consistently, leading to variations in vector potency10.
Here, a unique method is presented, which streamlines the process of generating high-yield and high-purity AAV vectors using a cell factory platform free from using labor-intensive HEK293T cell cultures in cell dishes, integrating polyethylene glycol/aqueous two-phase partitioning with iodixanol gradient ultracentrifugation. The AAV vector purity is confirmed via SDS-PAGE and silver staining, and the full-to-empty particle ratio is determined using transmission electron microscopy (TEM), meeting the quality standards for in vivo studies11.

Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production

הליך יעיל וסטנדרטי ליצירת וקטורי וירוסים הקשורים באדנו באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה תוך שימוש בפלטפורמת מפעל תאים

בפרוטוקול מפורט זה, שלב אחר שלב, מודגמת פלטפורמה סטנדרטית לייצור וירוס AAV איכותי ואיכותי עם CF10 במסגרת מעבדת מחקר בקנה מידה גדול. בהשוואה לצלחות קונבנציונליות של תרביות תאים, CF10 מספק דרך נוחה לתרבית כמויות גדולות של תאים ולייצר וירוס AAV (איור 1). מספר תנאי תרבית נבדקו כדי לקבוע אם תאים בסביבה אופטימלית יכולים לקדם ייצור ויראלי. DMEM דל גלוקוז בתוספת HEPES של 10 mM ו- 2% FBS הראה את ייצור ה- AAV הטוב ביותר.
מספר פרוטוקולים נבדקו כדי לטהר AAVs. לרוב ההליכים יש תפוקת וירוסים נמוכה וטומאה של קפסידים AAV. כאן פותח פרוטוקול טיהור מתוקן, המשלב את ה-AAV הן מכדוריות התאים והן ממדיית התרבית (איור 2). מצאנו ש-80% מה-AAV היה בתאים, ועוד 20% מה-AAV היה בתרבית, שהופרשו מהתאים. שני חלקי AAV טופלו ב- DNase כדי להסיר את ה- DNA החופשי. נתרן דאוקסיכולאט שימש לשחרור נוסף של AAV מהתאים. לאחר מכן הופקו AAV עם מיצוי כלורופורם ואחריו חלוקה דו-פאזית מימית. צעדים אלה אפשרו להסיר את רוב מזהמי החלבון. AAV נשאר מסיס בשלב האמוניום גופרתי.
שאר המזהמים הוסרו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה לא רציפה של יודיקסנול (איור 3A). השיפוע סייע גם בהסרת הקפסידים הריקים של AAV, במיוחד בסבב השני של אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול.
טוהר נגיף ה-AAV נקבע על ידי כתמי כסף. כאשר התקבלו שלושה פסים עיקריים המתאימים לחלבון קפסיד AAV, VP1, VP2 ו-VP3, עם טוהר של יותר מ-90%, וירוס ה-AAV התאים לשימוש in vivo (איור 3B). TEM (איור 3C) ניגש ליחס הקפסיד המלא לקפסיד הריק של AAV (איור 3C). רק קפסיד מלא עם תוספת טרנסגן יאפשר ביטוי של טרנסגן ברקמת היעד. חלק גבוה של הקפסיד הריק יכול גם לגרום לתגובה חיסונית לקפסיד AAV. בדיקות איכות אלה נחוצות עבור כל וירוס AAV המיוצר ומטוהר לפני השימוש.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig01.jpg"> איור 1: המחשה סכמטית של ייצור AAV על-ידי HEK293T תאים בשיטת טרנספקציה משולשת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig02.jpg"> איור 2: המחשה סכמטית של טיהור AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig03.jpg"> איור 3: טיהור AAV על-ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול ואימות טוהר נגיף AAV. (A) שכבות שיפוע יודיקסנול ומיקום המחט לקציר. (B) ג'ל מייצג להערכת תכולת הקפסיד וטוהרו. M: סמן מולקולרי; R: התייחסות AAV6 קפסיד מלא; S1: קפסיד AAVDJ תוצרת בית עם סיבוב אחד של אולטרה-צנטריפוגה; S2: קפסיד AAVDJ תוצרת בית עם שני סבבים של אולטרה-צנטריפוגה; S3: קפסיד AAV6 תוצרת בית. (C) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים של AAV. וירוס שנאסף לאחר טיהור. קפסידים נגיפיים המכילים גנום ויראלי מופיעים כמשושים לבנים הומוגניים, בעוד שקפסידים ריקים מופיעים כמשושים בעלי שפה לבנה אך מרכז כהה. סרגל קנה מידה: 100 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: מחשבון PEI עבור אריזות AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%201%20TZ%20edit.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: תרשים נפח גולמי AAV-PEG-סולפט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%202%20TZ%20edit.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 3: הכנת שיפוע יודיקסנול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%203%20TZ%20edit.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 4: הכנת שיפוע יודיקסנול סיבוב שני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%204%20TZ%20edit.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 5: פריימרים לטיטרציה AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%205%20TZ%20edit.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: הרכבי המאגרים ששימשו למחקר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production at JoVE.com

ככל שתחום הריפוי הגנטי ממשיך להתפתח, יש צורך הולך וגובר בשיטות חדשניות שיכולות להתמודד עם אתגרים אלה. כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמה של מפעל תאים, העומדים בתקני האיכות למחקרי in vivo .

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. ...

פרויקט זה נועד לספק פרוטוקול נואל לייצור בקנה מידה גדול של וקטורי וירוסים הקשורים באדנו בעלי טיטר גבוה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים ותנאים תרבותיים אופטימליים. תהליך הטיהור המתוקן משלב AEV משני שברי התאים ואת תג ההענקה הדו-שלבי, ואחריו הארטיפיקציה ההדרגתית שלנו משיגה תפוקה וטוהר מעולים. למרות ההתקדמות האחרונה, נותרו כמה אתגרים במעבדות המחקר האקדמיות.אלה כוללים אופטימיזציה של תנאי תרבית ניתנים להרחבה, שימוש בתאים אחרים, הפחתת אחוז הפלפסידים הריקים ואיזון תפוקת הנגיפים עם טוהר. בהשוואה לטכניקות אחרות, הפרוטוקול שלנו מציע מדרגיות באמצעות מפעלי תאים, תפוקה מוגברת עם תנאי תרבית אופטימליים, וטוהר וקטור וירוס משופר הקשור באדנו באמצעות תהליך טיהור דו-שלבי של noelle. פרוטוקול מדרגי זה עם טוהר נגיפי מעולה הקשור באדנו סלל את הדרך למחקרים פרה-קליניים גדולים יותר במעבדות המחקר האקדמיות.פוטנציאל להוביל לפיתוח בטוח ויעיל יותר של ריפוי גנטי הודות לשיפור איכות הווקטור.

הליך יעיל וסטנדרטי ליצירת וקטורי וירוסים הקשורים באדנו באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה תוך שימוש בפלטפורמת מפעל תאים

Abstract