TZ designet eksperimentene. TZ, VD, SB og JP utførte eksperimentene. TZ og VD genererte data og analyserte dataene. TZ og YX skrev manuskriptet. TZ og GG reviderte manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av UPMC Children's Hospital of Pittsburgh.

Detaljene om reagengene, plasmidene og utstyret som ble brukt i studien er oppført i materialtabellen. Sammensetningen av bufferne som brukes er gitt i tilleggsfil 1.
1. Forberedelse av plasmid
<ol><li>Transformer plasmider (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) i E. coli. NOTAT: Enhver E.coli-stamme kan brukes til plasmidamplifikasjon. For noen plasmider kan spesielle kompetente celler som NEB stabil forbedre plasmidutbyttet. De tre plasmidene som brukes i denne protokollen er pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 og pAAV-Cap: pAAV-RC6.</li>
	<li>Dyrk bakterier i LB-medier som inneholder passende selektive antibiotika i optimalt volum ved 37 °C i 16-18 timer. MERK: Når du bruker NEB stabile celler, dyrk ved 30 °C i 18-20 timer.</li>
	<li>Høst plasmid-DNA ved å sentrifugere E. coli. kulturmedium ved 4000 x g, 4 °C, i 15 min.</li>
	<li>Hell forsiktig supernatantvæsken fra sentrifugeflasken i en avfallsbeholder og rens plasmid-DNAet fra pelleten med et storstilt endotoksinfritt plasmidrensesett. NOTAT: Sørg for å helle den sakte og unngå sprut.</li>
	<li>Mål DNA-konsentrasjonen og renheten ved hjelp av et spektrofotometer. NOTAT: Kontroller DNA-renheten ved å sjekke OD260/OD280-forholdet . Forholdet for rent DNA er omtrent 1,8. DNA-konsentrasjonen bør være over 1 μg/μL for det senere ko-transfeksjonstrinnet. Lag bakterielle glyserollagre ved å tilsette 500 μL av nattkulturen til 500 μL 50 % glyserol i en kryovial og oppbevar ved -80 °C.</li>
</ol>2. Forbereder HEK293T celler
<ol><li>Frø HEK293T celler med DMEM-medier med høyt glukoseinnhold som inneholder 10 % FBS til en 10-lags cellefabrikk (CF10) og la cellene vokse i inkubatoren over natten. MERK: Passasjene til 293T-cellene bør være mindre enn 10 for å ha optimale forhold for robust AAV-produksjon. Hvis mulig, ikke tilsett antibiotika til kulturmediet på dette tidspunktet. CF10 har omtrent 42 ganger vekstflaten til en 150 mm cellekulturskål. Frø den samme celletettheten i en 150 mm cellekulturskål for å tillate kontroll av celleveksten under et mikroskop. Forbered 1075 ml cellesuspensjon, tilsett 25 ml cellesuspensjon i en 150 mm skål, og tilsett resten i CF10.</li>
	<li>Sjekk cellesamløpet neste dag før transfeksjonen. NOTAT: Celler bør nå 80%-90% samløp på tidspunktet for transfeksjon ved å observere under et mikroskop.</li>
</ol>3. Trippel-transfeksjon av AAV-plasmider
<ol><li>Beregn mengden av hvert plasmid som trengs (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-serotype) for å ha et 1,2: 1: 1 molart forhold med 2,5-5 mg totalt DNA per CF10. MERK: De tre plasmidenes molare forhold kan være variabelt for optimal transfeksjonseffekt. Det er bedre å teste det i en liten skala før du går over til denne CF10-innstillingen. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 og pAAV-RC6 brukes til å lage AAV6-CMV-GFP-viruset som et eksempel. PEI-kalkulatorformelen er oppført i tabell 1.</li>
	<li>Alikvoter 350 ml OptiMEM i en steril 500 ml flaske.</li>
	<li>Tilsett alle tre plasmid-DNA i flasken som inneholder Opti-MEM. Bland godt.</li>
	<li>Tilsett 15 ml 1 mg/ml polyetylenimin (PEI) løsning (1:3 μg DNA til μg PEI-forhold). Rist OptiMEM/DNA/PEI-blandingen kraftig opp og ned i 30 sekunder. MERK: Det er greit å lage bobler.</li>
	<li>Inkuber blandingen ved romtemperatur i 10-15 minutter. NOTAT: Lengre inkubasjon kan redusere transfeksjonseffektiviteten.</li>
	<li>Tilsett OptiMEM/DNA/PEI-løsningen i 1 L flasken som inneholder 700 ml DMEM lav glukose med 10 mM HEPES og 2 % FBS. Bland godt. MERK: I denne studien viste den lave glukosen i DMEM bedre AAV-vektorproduksjon etter ko-transfeksjon. Tilsetningen av HEPES bidrar til å holde cellene i bedre stand. Bland ved å rotere flasken sakte. Unngå å lage for mange bobler.</li>
	<li>Ta CF10 ut av inkubatoren og støvsug mediet ut i en avfallsbeholder. MERK: Legg ned CF10 på overflaten av hetten og løft gradvis den ene siden opp, støvsug sakte ut mediet uten å løsne cellene.</li>
	<li>Tilsett transfektantblandingen forsiktig til CF10. Sørg for at alle ti lagene er dekket med media. MERK: Tilsett 25 ml transfektantblanding i 150 mm fatet. Overvåk cellene daglig til høsten. Tilsett den gjenværende transfektantblandingen i CF10 ved å helle sakte. Roter CF10 veldig forsiktig og sørg for likt volum for hvert lag.</li>
	<li>Sett CF10 tilbake i inkubatoren i 72-96 timer. MERK: Kontroller 150 mm skjermparabolen for å bestemme når AAV-vektorene skal høstes. Når cellene blir veldig lett løsnet med full last av AAV, er det på tide å høste.</li>
</ol>4. Høsting av AAV-vektorer
<ol><li>Høst viruset 3-4 dager etter transfeksjon ved å riste CF10 kraftig. Hell mediet i de 250 ml koniske rørene og snurr ned viruset ved 4000 x g i 20 minutter ved 4 °C. NOTAT: For AAV6-serotypen som brukes i denne protokollen, vil 80 % AAV forbli for det meste bundet til cellulært materiale i pelleten. Og de 20 % AAV ble skjult i media. Disse proporsjonene kan variere for andre AAV-serotyper.</li>
	<li>Filtrer klaret supernatant med 0,45 μm filterenhet og lagre den for nedbør.</li>
	<li>Skyll CF10 med 500 ml DPBS 1x-buffer og sentrifuger ved 4000 x g i 20 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Kast supernatanten ved hjelp av et vakuumsystem og en aspirerende pipette. Tilsett 20 ml AAV-lysebuffer per CF10 ved -80 °C til rensing. NOTAT: Overfør AAV-lysat til et 50 ml konisk rør for senere AAV-ekstraksjon.</li>
	<li>Ta ut den filtrerte supernatanten, tilsett 40 % PEG-2.5 M NaCl-løsning for en endelig konsentrasjon på 8 % PEG, og inkuber i et kjølerom på en orbital rotator i minst 3 timer eller over natten. NOTAT: For 100 ml supernatant, tilsett 25 ml 40 % PEG-2.5 M NaCl-løsning.</li>
	<li>Utfelt viruset ved sentrifugering ved 4000 x g i 30 minutter ved 4 °C. NOTAT: Overfør blandingen til 250 ml koniske rør for sentrifugering.</li>
	<li>Aspirer for å fjerne supernatant og tilsett 5-10 ml AAV HEPES resuspenderingsbuffer for å suspendere pellets. Overfør til et 50 ml konisk rør for å fortsette nedstrømsrensingen, eller oppbevar den ved -80 °C.</li>
</ol>5. AAV-utvinning
<ol><li>Tin viruspelleten i et 37 °C vannbad i 10-15 minutter med en shaker. NOTAT: Virvel AAV-lysatet for å smelte helt.</li>
	<li>Frys i -80 °C 100 % etanolbad i 20-30 min. NOTAT: Alternativt kan frysesyklusen gjøres med et kaldt 100 % etanolbeger omgitt av tørris.</li>
	<li>Utfør frysing/tining 3-4 ganger, og virvel i mellom om nødvendig. NOTAT: Denne syklusen kan settes på pause ved frysetrinnet. Oppbevar AAV-lysatet ved -80 °C til nedstrømsarbeidet.</li>
	<li>Tin AAV-lysat (fra trinn 5.3) og resuspendert AAV (fra trinn 4.7)" i et 37 °C vannbad i 10-15 minutter med en shaker og virvel. NOTAT: Sørg for å smelte helt og bland det.</li>
	<li>Tilsett benzonasenuklease (250 enheter/μL) til AAV-lysat og resuspendert AAV for en endelig konsentrasjon på 50 enheter/ml. Vortex løsningen.</li>
	<li>Inkuber i et 37 °C vannbad med risting i 30 min. NOTAT: Ta ut 10 % natriumdeoksycholatalikvoter i et vannbad for å gi tid til å oppløses, varmes opp og blandes grundig.</li>
	<li>Tilsett 10 % natriumdeoksykolat for en endelig konsentrasjon på 0,5 % og inkuber ved 37 °C med en shaker på i 30 minutter. MERK: Natriumdeoksykolat ble brukt for å forbedre AAV-frigjøring fra cellene.</li>
	<li>Fordel den rå AAV-løsningen i 2 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 14 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Overfør supernatanten til et 50 ml konisk rør. MERK: Bruk en 1 ml pipette til å overføre supernatanten. Kast pellets.</li>
	<li>Tilsett en like stor mengde kloroform og trekk ut AAV ved å virvle i 1-2 min. NOTAT: Løsningen skal bli ugjennomsiktig, hvit, melkeaktig.</li>
	<li>Overfør den melkeaktige løsningen til 2 ml sentrifugerør og fordel jevnt. Sentrifuger ved 14 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Pipetterer forsiktig ut det øverste rosa laget og overfør det i et nytt 50 ml konisk rør. NOTAT: Ikke forstyrr kloroform-/proteinlagene.</li>
	<li>Mål det endelige volumet med en pipette. I henhold til det rå AAV-PEG-sulfatvolumdiagrammet (tabell 2), bland passende volumer på 50 % (NH4)2SO4 og 40 % PEG-løsning. Virvel i 2 min.</li>
	<li>Overfør blandingen til 2 ml sentrifugerør for å fordele jevnt. Sentrifuger ved 14 000 x g i 10 minutter ved 4 °C</li>
	<li>Samle opp det nederste laget ved å bruke en 22 G kanyle og en 3 ml sprøyte. Samle AAV i et 50 ml konisk rør og oppbevar det ved 4 °C for senere ultrasentrifugering av jodixanolgradienter.</li>
</ol>6. AAV-rensing ved iodixanol gradient ultrasentrifugering
<ol><li>Forbered jodixanolgradientene ferskt før du laster AAV i henhold til antall ultrasentrifugerør som brukes (tabell 3). MERK: Fenolrødt ble brukt til å observere lagene.</li>
	<li>Legg hver løsning over i et rund polypropylen ultrasentrifuge hurtigforseglingsrør sakte ved hjelp av en 10 ml sprøyte festet med en 16 G lang nål. Unngå bobler.</li>
	<li>Tilsett forsiktig opptil 17 ml AAV-oppløsning på toppen av gradienten med en 22 G sprøyte. Bruk AAV-dialysebuffer for å fylle på røret. NOTAT: Tilsett AAV-løsningen ved å legge dråper mot veggen i ultrasentrifugerøret. Ikke forstyrr gradientlagene.</li>
	<li>Forsegl ultrasentrifugerørene med en elektrisk forsegler. NOTAT: Balanser rørene før du sender dem til ultrasentrifuge med ±0.2 g forskjell.</li>
	<li>Sentrifuger ved 350 000 x g i 2 timer i en Ti70-rotor ved 4 °C.</li>
	<li>Fjern rørene forsiktig fra rotoren og plasser dem i ultrasentrifugerørstativet. MERK: Pass på at gradientene ikke forstyrres.</li>
	<li>Samle AAV-brøker ved å følge trinnene nedenfor:<ol><li>Stabiliser røret på en stativholder.</li>
		<li>Punkter ultrasentrifugerørene litt under 40%-60%-grensesnittet med en 19 G nål festet til en 10 ml sprøyte. MERK: Åpningen av nålen skal være opp, vendt mot 40 % gradient.</li>
		<li>Stikk et hull i toppen av røret med en 16 G nål.</li>
		<li>Samle opptil 5 ml per rør. Unngå å samle opp proteinforurensningen ved 25%-40% grensesnittet.</li>
		<li>Gjenta for hvert ultrasentrifugerør. NOTAT: Overfør AAV-fraksjonene til et 50 ml konisk rør.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Andre runde iodixanol gradienter ultrasentrifugering
MERK: Dette trinnet er valgfritt. Dette trinnet er å redusere det tomme AAV-forholdet for en full AAV-kapsid av høyere kvalitet.
<ol><li>Fortynn AAV >1:1 med AAV-dialysebuffer. MERK: AAV samlet inn fra den første runden med ultrasentrifugering var på 40 % jodiksanollag. Den bør fortynnes med minst 50% for å kunne legges på toppen av 30% jodixanollaget.</li>
	<li>Legg hver oppløsning (tabell 4) over i et ultrasentrifugerør ved hjelp av en 16 G nål og fest sakte en 10 ml sprøyte. Unngå bobler.</li>
	<li>Tilsett forsiktig 20 ml fortynnet AAV-oppløsning på toppen av gradienten med en 22 G sprøyte. Bruk AAV-dialysebuffer for å fylle på røret.</li>
	<li>Gjenta trinnene 6.4 til 6.7.</li>
</ol>8. AAV-dialyse og konsentrasjon
<ol><li>Overfør AAV-viruset til dialysekassetten ved hjelp av en ny 18 G kanyle og 10 ml sprøyte. Injiser viruset sakte inn i kassetten og fjern luft fra den.</li>
	<li>Legg en rørestang i begeret som inneholder AAV-dialysebuffer og legg den på en røreplate.</li>
	<li>Sett dialysekassetten inn i dialysebufferen med en flytebøye. Rør ved 4 °C. Bytt 2-3 ganger AAV-dialysebufferen. NOTAT: Bruk nok buffer til at kassetten kan flyte og utføre bufferbyttet. Dekk begeret med aluminiumsfolie.</li>
	<li>Bruk en 10 ml sprøyte festet med en 18 G nål til å samle viruset fra kassetten inn i en sentrifugalfilterenhet.</li>
	<li>Sentrifuger ved 4,000 x g i 15-30 min ved 4 °C. NOTAT: Skyll AAV med AAV-dialysebuffer 2-3 ganger. Konsentrer AAV til ~200 μL gjenværende er på toppen av filteret.</li>
	<li>Samle den konsentrerte AAV fra filterenheten. Skyll filteret med ytterligere 300 μL AAV-dialysebuffer og overfør det til den konsentrerte AAV-en.</li>
	<li>Filtrer viruset gjennom et 0,22 μm sprøytefilter ved hjelp av en 1 ml tuberkulin luer slip-sprøyte. For å sikre minst mulig volumtap, bruk 10 ml sprøyten til å skyve luft gjennom filteret 2-3 ganger.</li>
	<li>Oppbevar det rensede AAV-viruset ved 4 °C midlertidig for titrering. NOTAT: Titrer viruset, alikvoten og oppbevar ved -80 °C innen 1 uke.</li>
</ol>9. AAV-virustitrering
MERK: TaqMan kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) ble brukt til å titrere renset AAV.
<ol><li>Behandle AAV-vektorer med DNase I og inkuber ved 37 °C i 30 minutter, og inkuber deretter ved 95 °C i 10 minutter. NOTAT: Som et eksempel på 10 μL reaksjon brukes 2 μL AAV-virusprøve, 1 μL DNase, 1 μL DNasebuffer og 6 μL H2O. Det kan utføres i en termosyklist med PCR-rør.</li>
	<li>Forbered primersettene rettet mot AAV-innsatsområdet. MERK: Mål kan være promotøren, transgenet og reporteren i AAV-konstruksjonen. Primere er oppført i tabell 5.</li>
	<li>Forbered DNA-plasmidstandarder (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 og 0,0001 pg/μL) og en negativ kontroll (H2O).</li>
	<li>Forbered qPCR-masterblandingen, inkludert primere, i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	<li>Plasser standardene og prøvene i tre eksemplarer på en PCR-plate. Tilsett qPCR-blandingen i standardene og prøvene. Forsegl platen og utfør qPCR-reaksjonen i henhold til produsentens instruksjoner. NOTAT: Reaksjonsforholdene avhenger av materialene/reagensene og instrumentet. Raske og konvensjonelle PCR-sykluser er aktuelt.</li>
	<li>Beregn AAV-virustiter. NOTAT: Prøvekonsentrasjonen i denne protokollen er 1/10 fortynning fra originalprøvene.</li>
	<li>Alikvoter AAV-viruset i 1,5 ml rør og oppbevar ved 4 °C i opptil en måned og oppbevar ved -80 °C på lang sikt. NOTAT: Unngå fryse-/tinesykluser for lagring. Når det brukes til in vivo-eksperimenter , må du ikke bruke tining over to ganger alikvoter.</li>
</ol>10. Kvalitetskontroll av AAV
NOTAT: AAV-virus ble karakterisert for renhet av SDS-PAGE sølvflekk ved bruk av en SDS-PAGE-gel og farget ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig fargesett.
<ol><li>Denaturer 3 x 109 vg AAV-virusprøve med Laemmli-buffer. MERK: Bruk et AOV-referansevirus som kontroll. AAV6-CMV-GFP-referanse full kapsid brukes.</li>
	<li>Legg den denaturerte AAV på en 4%-20% gradient SDS-PAGE-gel og kjør på 180 V i 50 minutter.</li>
	<li>Fjern gelen fra elektroforeseplaten. Beis gelen med et sølvfargesett i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	<li>Sjekk AAV-kapsidproteinene VP1, VP2 og VP3. MERK: Rent AAV-virus inneholder bare VP1-, VP2- og VP3-kapsidprotein. Hvis ikke rene, vil andre proteinbånd være synlige på gelen. MERK: Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) av negativt farget rekombinante AAV-virioner ble utført for å vurdere morfologisk integritet og full/tomt forhold.</li>
	<li>Plukk opp et EM-gitter med en pinsett og sett deg ned på benken med den blanke siden av rutenettet vendt opp.</li>
	<li>Pipetter 5 μL AAV-prøve på risten og la den tørke ved fordampning. NOTAT: Fortynn AAV om nødvendig. 1012 vg/ml er en gjennomsnittlig titer. Det kan ta 30-60 minutter å tørke risten.</li>
	<li>Vask gitteret ved pipettering, dråpe for dråpe, med ca. 200 μL H2O på gitteret.</li>
	<li>Fjern overflødig vann ved å sakte plassere et kromatografipapir vertikalt ved siden av rutenettet.</li>
	<li>Pipetter 5 μL 2% uranylacetatløsning på gitteret. Ruk i 5 min og vek av som nevnt ovenfor. La risten tørke.</li>
	<li>Visualiser AAV-partiklene under et transmisjonselektronmikroskop (ved 50 000 ganger forstørrelse). Virale kapsider med et viralt genom vil fremstå som homogene hvite sekskanter, mens tomme kapsider vil fremstå som sekskanter med en hvit kant, men et mørkt senter.</li>
	<li>Tell tilfeldig minst 100 partikler for å bestemme den omtrentlige prosentandelen av full vs. tomme AAV-partikler.</li>
</ol>

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

<ol>
	<li>Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+recombinant+adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+for+gene+transfer.">Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer.</a> BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).</li><li>Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+targeted+adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+for+human+gene+therapy.">Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy.</a> Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).</li><li>Bilal, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+large-scale+Adeno-Associated+Virus+(AAV)+production.">Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production.</a> Curr Protoc. 3 (5), e757 (2023).</li><li>Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+adeno-associated+viral+vector+serotype-9+carrying+the+human+survival+motor+neuron+gene.">Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene.</a> Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Publisher+Correction:+Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).</li><li>Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+discovery+of+novel+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14 (2012).</li><li>Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+purification+of+AAV+and+delivery+to+the+pancreas+by+intraductal+administration.">Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).</li><li>Berns, K. I., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy+for+human+liver+diseases.">Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases.</a> Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).</li><li>Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+band+centrifugation+for+the+separation+and+quantification+of+empty+and+full+AAV+particles.">Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+observation+of+the+recombinant+adeno-associated+virus+2+using+transmission+electron+microscopy+and+atomic+force+microscopy.">Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy.</a> Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ-formable,+dynamic+crosslinked+poly+(ethylene+glycol)+carrier+for+localized+adeno-associated+virus+infection+and+reduced+off-target+effects.">In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects.</a> Commun Biol. 6 (1), 508 (2023).</li><li>Sena-Esteves, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+fully+packaged+virions+in+column-purified+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+preparations+by+iodixanol+gradient+centrifugation+followed+by+anion-exchange+column+chromatography.">Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638 (2020).</li><li>Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+avian+encephalomyelitis+virus+by+ultracentrifugation+in+a+nonlinear+cesium+chloride+gradient.">Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient.</a> Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).</li></ol>

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Her introduseres en teknisk avansert protokoll for storskala produksjon av AAV-vektorer med høyt titer og høy kvalitet ved hjelp av en cellefabrikkplattform (CF10), noe som representerer en betydelig forbedring i forhold til konvensjonelle cellekulturskålmetoder. Bruken av cellefabrikker forenkler prosessen med å dyrke store mengder celler, noe som letter produksjonen av AAV-virus mer effektivt1. Ved å optimalisere kulturforholdene, spesielt med DMEM med lav glukose supplert med 10 mM HEPES og 2 % FBS, ble en betydelig forbedret virusproduksjon bekreftet, noe som indikerer den avgjørende rollen til det cellulære miljøet i virusutbyttet.
Den reviderte renseprotokollen, som kombinerer AAV fra både cellepellets og kulturmedier, tar for seg det vanlige problemet med lave virusutbytter og urenheter sett i mange eksisterende protokoller. Trinnene med kloroformekstraksjon og vandig tofasepartisjonering fjerner effektivt de fleste proteinforurensninger, med AAV som forblir løselig i ammoniumsulfatfasen. Forbedringen i både utbyttet og renheten til AAV-vektorer ved bruk av PEG/vandig tofasepartisjonering kombinert med jodixanolgradient ultrasentrifugering, i motsetning til tradisjonelle gradient ultrasentrifugeringsmetoder, kan tilskrives forbedret initial separasjon med PEG/vandig tofasepartisjonering, raffinert renhet med iodixanol gradient ultrasentrifugering og reduksjon i forurensningco-rensing 12. For det første forbedrer innføringen av PEG/vandig tofasepartisjonering før ultrasentrifugering betydelig den innledende separasjonen av AAV-partikler fra cellulært rusk og andre forurensninger. PEG, en polymer med høy molekylvekt, når den blandes med en vandig løsning, skaper to distinkte faser13. AAV-vektorer har en tilbøyelighet til å fortrinnsvis dele seg inn i en av disse fasene (vanligvis den PEG-rike fasen), mens mange forurensninger og urenheter er delt inn i de andre13. Denne selektive partisjoneringen konsentrerer effektivt AAV-partiklene og fjerner en betydelig del av urenheter selv før ultrasentrifugering, og øker dermed utbyttet og reduserer forurensningsbelastningen som kommer inn i ultrasentrifugeringstrinn13. For det andre foredler iodixanol gradient ultrasentrifugering renheten til AAV-vektorer ytterligere. Jodixanol, et ikke-ionisk, iso-osmolart gradientmedium, gir mulighet for en mer skånsom og kontrollert separasjon sammenlignet med tradisjonelle CsCl-gradienter14. I denne gradienten migrerer AAV-partikler til en posisjon i gradienten som tilsvarer deres flytende tetthet14. Viktigere er at denne prosessen er effektiv for å skille fulle AAV-kapsider (som inneholder den genetiske nyttelasten) fra tomme kapsider (som mangler genetisk materiale), som er en avgjørende determinant for vektorkvalitet. Iodixanols iso-osmolare natur bevarer også integriteten til AAV-kapsidene bedre enn hyperosmolare midler som CsCl, noe som potensielt kan føre til høyere utbytter av intakte, funksjonelle vektorer14. Til slutt kan tradisjonelle ultrasentrifugemetoder, spesielt de som bruker CsCl-gradienter, noen ganger samrense forurensninger som har lignende flytetettheter som AAV-vektorer15. Ved å bruke PEG-partisjonering som et foreløpig trinn, reduseres belastningen av slike forurensninger kraftig før ultrasentrifugering13. Denne reduksjonen i forurensningsbelastning betyr at jodixanolgradienten kan fungere mer effektivt og selektivt ved rensing av AAV-vektorer, noe som fører til høyere renhet15.
Renheten og kvaliteten til AAV-vektorene vurderes grundig gjennom sølvfarging og TEM11. Observasjonen av tre hovedbånd som tilsvarer AAV-kapsidproteinene VP1, VP2 og VP3, med en renhet som overstiger 90 %, indikerer egnetheten til disse AAV-vektorene for in vivo-bruk . TEM-analysen for å bestemme forholdet mellom fullt og tomt kapsid er spesielt avgjørende, da en høy andel tomme kapsider kan føre til redusert genleveringseffektivitet og potensielle immunresponser11. Selv om denne kvalitetskontrollen er viktig, øker den prosessuelle kompleksiteten og kan kreve ytterligere teknisk ekspertise.
Avslutningsvis tilbyr protokollen betydelige tekniske fremskritt i produksjonen av AAV-vektorer, spesielt når det gjelder skalerbarhet og renhet. Imidlertid kan kompleksiteten knyttet til renseprosessen og behovet for spesialisert utstyr og ekspertise fortsatt være en mindre begrensning for bruken i visse forskningsmiljøer. Ytterligere foredling og forenkling av disse teknikkene kan gjøre denne tilnærmingen mer tilgjengelig og allment anvendelig innen genterapiforskning.

Adeno-assosierte virus (AAV)-vektorer har blitt et uunnværlig verktøy i genterapiforskning, og tilbyr en unik kombinasjon av effekt og sikkerhet for genlevering1. Tradisjonelle metoder for å generere AAV-er i laboratoriemiljøer har vært sentrale for å fremme vår forståelse og anvendelse av genterapi2. Imidlertid viser disse metodene, selv om de er grunnleggende, visse begrensninger og utfordringer, spesielt når det gjelder utbytte, tidseffektivitet og kvaliteten på vektorene som produseres, spesielt forholdet mellom fulle og tomme partikler3.
Den konvensjonelle prosedyren for AAV-produksjon involverer først og fremst transfeksjon av HEK293-celler4. Denne prosessen, vanligvis utført i cellekulturskåler, krever at cellene transfekteres med et plasmid som inneholder genet av interesse sammen med hjelperplasmid og AAV-kapsidplasmid 5,6. Etter transfeksjon produserer cellene AAV-partikler, som deretter høstes og renses 5,6. Renseprosessen involverer ofte ultrasentrifugering, et kritisk trinn for å oppnå AAV-vektorer med høy renhet7. Ultrasentrifugering, spesielt ved bruk av cesiumklorid (CsCl) eller jodiksanolgradient, er en standardmetode for å skille AAV-partikler fra cellulært rusk og andre urenheter8. Dette trinnet er avgjørende for å oppnå ønsket renhet og konsentrasjon av AAV-vektorer, noe som direkte påvirker deres effektivitet i genlevering8. Til tross for den utbredte bruken har tradisjonell ultrasentrifugering sine ulemper. For eksempel kan utbyttet av AAV-vektorer fra denne metoden være variabelt og ofte lavt, noe som gir betydelige utfordringer når det er behov for store mengder høytitervektorer, spesielt for in vivo-studier eller stordyrmodeller9.
Et annet kritisk aspekt ved AAV-vektorkvalitet er forholdet mellom fulle og tomme partikler10. AAV-preparater inneholder ofte en blanding av disse partiklene; Imidlertid inneholder bare de fulle partiklene det terapeutiske genetiske materialet. Tilstedeværelsen av en høy andel tomme partikler kan redusere effektiviteten av genlevering betydelig10. Vurdering og optimalisering av forholdet mellom fulle og tomme partikler er derfor en nøkkelparameter for å evaluere effektiviteten til AAV-vektorer. Tradisjonelle metoder, selv om de er i stand til å produsere AAV-vektorer, sliter ofte med å kontrollere dette forholdet konsekvent, noe som fører til variasjoner i vektorstyrke10.
Her presenteres en unik metode, som effektiviserer prosessen med å generere AAV-vektorer med høyt utbytte og høy renhet ved hjelp av en cellefabrikkplattform fri for bruk av arbeidskrevende HEK293T cellekulturer i celleskåler, og integrerer polyetylenglykol/vandig tofasepartisjonering med jodixanolgradient ultrasentrifugering. AAV-vektorens renhet bekreftes via SDS-PAGE og sølvfarging, og full-til-tomt partikkelforhold bestemmes ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), som oppfyller kvalitetsstandardene for in vivo-studier 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T/17 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.01217.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>324506-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Henke-Ject syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% pluronic F68 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>24-040-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% Precast Protein Gels</td>
			<td>biorad</td>
			<td>4561094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% PEG solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1458-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6 reference full capsids</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>RS-AAV6-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;PES Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Cassettes, 10 K MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI66810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-569-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10567022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF300-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9732-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nest Biofactory 10 chamber</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>771302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-DJ</td>
			<td>Cell BioLab</td>
			<td>VPK-420-DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-RC6</td>
			<td>Cell BioLab</td>
			<td>VPK-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdDeltaF6</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI Max</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>49553-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.07242.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickSeal tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9144589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1162245000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a streamlined and standardized procedure for generating high-titer, high-quality adeno-associated virus vectors utilizing a cell factory platform

Preklinisk genterapiforskning, spesielt i gnagere og store dyremodeller, nødvendiggjør produksjon av AAV-vektorer med høyt utbytte og renhet. Tradisjonelle tilnærminger i forskningslaboratorier innebærer ofte utstrakt bruk av cellekulturskåler for å dyrke HEK293T celler, en prosess som kan være både arbeidskrevende og problematisk. Her presenteres en unik intern metode, som forenkler denne prosessen med en spesifikk cellefabrikk (eller cellestabler, CF10) plattform. En integrasjon av polyetylenglykol/vandig tofasepartisjonering med jodixanolgradient ultrasentrifugering forbedrer både utbyttet og renheten til de genererte AAV-vektorene. Renheten til AAV-vektorene verifiseres gjennom SDS-PAGE og sølvfarging, mens forholdet mellom fulle og tomme partikler bestemmes ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Denne tilnærmingen tilbyr en effektiv cellefabrikkplattform for produksjon av AAV-vektorer med høye utbytter, kombinert med en forbedret rensemetode for å møte kvalitetskravene til in vivo-studier .

Adeno-associated virus (AAV) vectors have become an indispensable tool in gene therapy research, offering a unique combination of efficacy and safety for gene delivery1. Traditional methods for generating AAVs in laboratory settings have been pivotal in advancing our understanding and application of gene therapy2. However, these methods, while foundational, exhibit certain limitations and challenges, especially in terms of yield, time efficiency, and the quality of the vectors produced, notably the ratio of full to empty particles3.
The conventional procedure for AAV production primarily involves the transfection of HEK293 cells4. This process, typically conducted in cell culture dishes, requires the cells to be transfected with a plasmid containing the gene of interest along with helper plasmid&#160;and AAV capsid plasmid5,6. Following transfection, the cells produce AAV particles, which are then harvested and purified5,6. The purification process often involves ultracentrifugation, a critical step in obtaining high-purity AAV vectors7. Ultracentrifugation, particularly using cesium chloride (CsCl) or iodixanol gradient, is a standard method for separating AAV particles from cellular debris and other impurities8. This step is crucial for achieving the desired purity and concentration of AAV vectors, which directly impacts their efficacy in gene delivery8. Despite its widespread use, traditional ultracentrifugation has its drawbacks. For example, the yield of AAV vectors from this method can be variable and often low, which poses significant challenges when large quantities of high-titer vectors are needed, particularly for in vivo studies or large animal models9.
Another critical aspect of AAV vector quality is the ratio of full to empty particles10. AAV preparations often contain a mixture of these particles; however, only the full particles contain the therapeutic genetic material. The presence of a high proportion of empty particles can significantly reduce the efficiency of gene delivery10. Assessing and optimizing the ratio of full to empty particles is thus a key parameter in evaluating the efficacy of AAV vectors. Traditional methods, while capable of producing AAV vectors, often struggle to control this ratio consistently, leading to variations in vector potency10.
Here, a unique method is presented, which streamlines the process of generating high-yield and high-purity AAV vectors using a cell factory platform free from using labor-intensive HEK293T cell cultures in cell dishes, integrating polyethylene glycol/aqueous two-phase partitioning with iodixanol gradient ultracentrifugation. The AAV vector purity is confirmed via SDS-PAGE and silver staining, and the full-to-empty particle ratio is determined using transmission electron microscopy (TEM), meeting the quality standards for in vivo studies11.

Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production

En strømlinjeformet og standardisert prosedyre for generering av adeno-assosierte virusvektorer av høy titer og høy kvalitet ved hjelp av en cellefabrikkplattform

I denne detaljerte trinnvise protokollen demonstreres en standardisert plattform for å lage AAV-virus av høy titer og høy kvalitet med CF10 i et storskala forskningslaboratorium. Sammenlignet med konvensjonelle cellekulturskåler, gir CF10 en praktisk måte å dyrke store mengder celler og produsere AAV-virus (figur 1). Flere dyrkningsforhold ble testet for å avgjøre om celler i et optimalt miljø kan fremme virusproduksjon. En DMEM med lavt glukoseinnhold supplert med 10 mM HEPES og 2 % FBS viste den beste AAV-produksjonen.
Flere protokoller ble testet for å rense AAV-er. De fleste prosedyrer har lavt virusutbytte og urenhet av AAV-kapsider. Her ble en revidert renseprotokoll utviklet, som kombinerer AAV fra både cellepellets og kulturmedier (figur 2). Vi har funnet at 80 % av AAV var i cellene, og ytterligere 20 % av AAV var i kulturmediet, som ble skilt ut fra cellene. Begge deler av AAV ble behandlet med DNase for å fjerne det frie DNA. Natriumdeoksykolat ble brukt til å frigjøre AAV ytterligere fra cellene. AAV-er ble deretter ekstrahert med kloroformekstraksjon etterfulgt av en vandig tofasepartisjon. Disse trinnene gjorde det mulig å fjerne de fleste proteinforurensninger. AAV forblir løselig i ammoniumsulfatfasen.
De resterende forurensningene ble fjernet med en diskontinuerlig jodixanolgradient ultrasentrifugering (figur 3A). Gradienten var også nyttig for å fjerne de tomme AAV-kapsidene, spesielt med den andre runden med iodixanol gradient ultrasentrifugering.
Renheten til AAV-viruset ble bestemt av sølvfarging. Når tre hovedbånd tilsvarende AAV-kapsidprotein, VP1, VP2 og VP3, med en renhet større enn 90 % ble oppnådd, var AAV-viruset egnet for in vivo-bruk (figur 3B). AAV-forholdet mellom full kapsid og tom kapsid ble tilgjengelig av TEM (figur 3C). Bare et fullt kapsid med en transgeninnsats ville tillate ekspresjon av transgen i det målrettede vevet. En høy del av det tomme kapsiden kan også indusere en immunrespons på AAV-kapsiden. Disse kvalitetskontrollene er nødvendige for hvert AAV-virus som produseres og renses før bruk.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk illustrasjon av AAV-produksjonen ved hjelp av HEK293T celler trippeltransfeksjonsmetode. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig01large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig02.jpg"> Figur 2: Skjematisk illustrasjon av AAV-rensingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig03.jpg"> Figur 3: AAV-rensing ved jodixanolgradient ultrasentrifugering og AAV-virusrenhetsverifisering. (A) Iodixanol-gradientlag og nålens posisjon for høsting. (B) Representativ gel som vurderer kapsidinnhold og renhet. M: molekylær markør; R: referanse AAV6 full kapsid; S1: egenprodusert AAVDJ-kapsid med en runde ultrasentrifugering; S2: egenprodusert AAVDJ-kapsid med to runder med ultrasentrifugering; S3: egenprodusert AAV6-kapsid. (C) Elektronmikroskopibilde av AAV. Virus samlet etter rensing. Virale kapsider som inneholder et viralt genom vises som homogene hvite sekskanter, mens tomme kapsider vises som sekskanter med en hvit kant, men et mørkt senter. Målestokk: 100 nm. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig03large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: PEI-kalkulator for AAV-emballasje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%201%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 2: Rå AAV-PEG-sulfat volumdiagram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%202%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 3: Fremstilling av jodixanolgradient. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%203%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 4: Utarbeidelse av andre runde jodixanolgradient. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%204%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 5: AAV-titreringsprimere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%205%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tilleggsfil 1: Sammensetninger av bufferne som ble brukt til studien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production at JoVE.com

Etter hvert som feltet genterapi fortsetter å utvikle seg, er det et økende behov for innovative metoder som kan møte disse utfordringene. Her presenteres en unik metode som effektiviserer prosessen med å generere AAV-vektorer med høy avkastning og høy renhet ved hjelp av en cellefabrikkplattform, som oppfyller kvalitetsstandardene for in vivo-studier .

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. ...

Dette prosjektet tar sikte på å gi en noelle-protokoll for storskala produksjoner av adeno-assosierte virusvektorer med høy titer og høy renhet ved bruk av en cellefabrikkplattform og optimaliserte kulturelle forhold. Den reviderte renseprosessen kombinerer AEV fra begge cellefraksjoner og ansettelsesmerket tofasebegjæring, etterfulgt av vår gradientartifisering som oppnår overlegent utbytte og renhet. Til tross for nylige fremskritt, gjenstår noen utfordringer i akademiske forskningslaboratorier.Disse inkluderer optimalisering av skalerbare kulturforhold, bruk av andre celler, reduksjon av prosentandelen tomme kapsider og balansering av virusutbyttet med renhet. Sammenlignet med andre teknikker tilbyr protokollen vår skalerbarhet via cellefabrikker, økt utbytte med optimaliserte kulturforhold og forbedret adeno-assosiert virusvektorrenhet gjennom en noelle to-trinns renseprosess. Denne skalerbare protokollen med overlegen adeno-assosiert viral renhet banet vei for større prekliniske studier i de akademiske forskningslaboratoriene.Potensielt ledende for sikrere og mer effektiv genterapiutvikling på grunn av forbedret vektorkvalitet.

En strømlinjeformet og standardisert prosedyre for generering av adeno-assosierte virusvektorer av høy titer og høy kvalitet ved hjelp av en cellefabrikkplattform

Abstract