A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.
ספרואידים סרטניים רב-תאיים הם מודל מיקרו-אגרגטים תלת-ממדי פופולרי לשחזור מיקרו-סביבה של גידולים, בדיקה ואופטימיזציה של טיפולים תרופתיים ושימוש בביו-חיישנים וננו-חיישנים בהקשר תלת-ממדי. קלות הייצור שלהם, גודלם הצפוי, הצמיחה ושיפועי החומרים המזינים והמטבוליטים שנצפו חשובים כדי לשחזר את המיקרו-סביבה התאית דמוית הנישה התלת-ממדית. עם זאת, הטרוגניות ספרואידית ושונות של שיטות הייצור שלהם יכולות להשפיע על חילוף החומרים הכולל בתאים, על הכדאיות ועל התגובה לתרופות. זה מקשה על בחירת המתודולוגיה המתאימה ביותר, בהתחשב בדרישות בגודל, שונות, צרכים של ייצור ביולוגי, ושימוש כמו מודלים תלת ממדיים של רקמות במבחנה בביולוגיה של תאי גזע וסרטן. בפרט, ייצור ספרואידים יכול להשפיע על התאמתם למיקרוסקופיות חיות כמותיות, כגון דימות מטבולי אופטי, מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM), ניטור היפוקסיה ספרואידית באמצעות ננו-חיישנים, או כדאיות. כאן מוצגים מספר פרוטוקולים קונבנציונליים להיווצרות ספרואידים, המדגישים את התאמתם למיקרוסקופים חיים של שדה רחב, קונפוקלי ושני פוטונים. הדמיית המעקב לצנרת הניתוח עם FLIM אוטופלואורסצנטי מרובה, ותוך שימוש בסוגים שונים של סרטן וכדורי תאי גזע, מוצגת גם כן.
ספרואידים רב-תאיים מייצגים קבוצה של מודלים תלת-ממדיים של רקמות המתקבלות על ידי צבירה עצמית של תאים ומציגים צורה כדורית. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות אינטראקציה בין תאים ומטריצות תאים במבחנה ולשחזר הקשר תלת-ממדי בתוך מספר רב של מבנים שמקורם בסרטן ובתאי גזע. מספר טכניקות משמשות כדי להפחית את התקשרות התא ולקדם את הצבירה. אלה כוללים את שיטת התלייה-טיפה המסתמכת על מתח פני השטח1; שיטות דוחות התקשרות תאים כגון לוחות התקשרות נמוכים במיוחד, תבניות מיקרו ומיקרו-בארות 2,3; גישה מבוססת גלים אקוסטיים4; שיטות צבירה המושרות על ידי זרימה (צלוחיות ספינר, ביוריאקטור וה....
1. דור של ספרואידים רב תאיים
בחירת שיטת היווצרות הספרואידים המתאימה
שיטת היווצרות הספרואידים שנבחרה יכולה להשפיע מאוד על גודלם, צורתם, צפיפות התא, הכדאיות והרגישות של הספרואידים לתרופות (איור 2). בעבר, הושוו ההשפעות של מספר רב של תפוקות גבוהות (SphericalPlate 5D, מיקרו-תבניות מיוצרות במעבדה ותבניות .......
ספרואידים רב-תאיים הופכים לשיטת בחירה במחקרים של מיקרו-סביבות נישה של גידולים ותאי גזע, גילוי תרופות ופיתוח "אבני הבניין של הרקמות" לייצור ביולוגי. הארכיטקטורה הפנימית ההטרוגנית של הספרואידים, שיפועים של חומרים מזינים וחמצון יכולים לחקות את אלה של רקמות in vivo וגידולים בסביבה פשוטה ונ?.......
אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי קרן המחקר המיוחדת (BOF) של אוניברסיטת גנט (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), קרן המחקר פלנדריה (FWO, I001922N) והאיחוד האירופי, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN מס '101073507.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Also available from Sigma |
10 mL serological pipets | VWR | 612-3700 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
12 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 665-180 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies. |
12 Well Chamber slide, removable | Ibidi | 81201 | Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others |
15 mL centrifuge tubes | Nerbe plus | 02-502-3001 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
3D Petri Dish micromolds | Microtissue | Z764000-6EA | |
6 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 657160 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
70% ethanol | ChemLab | CL02.0537.5000 | |
Biofloat | Sarstedt | 83.3925.400 | Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation |
Calcein Green-AM | Tebubio | AS-89201 | Apply in dilution 1:1000 |
CellSens Dimension software | Olympus | version 3 | |
Collagen from human placenta, type IV | Sigma | C5533 | For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
Confocal FLIM Microscope | Leica Microsystems | N/A | Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective |
D(+)-Glucose | Merck | 8342 | Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM) |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free | Sigma-Aldrich | D5030-10X1L | For preparation of imaging medium |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-098 | Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use. |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM) |
Human colon cancer cells HCT116 | ATCC | ||
ImageJ | NIH | version 1.54f | |
Leica Application Suite X (LAS X) | Leica Microsystems | version 4.6.1.27508 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100. |
Lipidure-CM5206 | Amsbio | AMS.52000034GB1G | |
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES | VWR | 392-0420 | Standard growth medium for HCT116 cells |
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps | N/A | N/A | Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University |
NaCl | Chemlab | CL00.1429.100 | |
Neubauer couting chamber | Fisher Scientific | 15980396 | |
O2 probes: MMIR1 | N/A | N/A | Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1 |
PBS | Fisher scientific | Gibco18912014 | Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water. |
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution | Gibco | 15140-122 | Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100. |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5mg | For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | 25535-16-4 | Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation |
PVDF syringe filter 0.22 µm | Novolab | A35149 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM) |
SphericalPlate 5D 24-well | Kugelmeiers | SP5D-24W | |
sterile petridish | Greiner bio-one | 633181 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Tissue culture flask (25 cm² ) | VWR | 734-2311 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Tissue culture flask (75 cm²) | VWR | 734-2313 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
U-bottom 96-well plate | VWR | 10062-900 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies |
Ultrapure Agarose | Invitrogen (Life Technologies) | 16500-500 | Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma) |
Widefield fluorescence inverted microscope | Olympus | N/A | Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved