Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.

Abstract

ספרואידים סרטניים רב-תאיים הם מודל מיקרו-אגרגטים תלת-ממדי פופולרי לשחזור מיקרו-סביבה של גידולים, בדיקה ואופטימיזציה של טיפולים תרופתיים ושימוש בביו-חיישנים וננו-חיישנים בהקשר תלת-ממדי. קלות הייצור שלהם, גודלם הצפוי, הצמיחה ושיפועי החומרים המזינים והמטבוליטים שנצפו חשובים כדי לשחזר את המיקרו-סביבה התאית דמוית הנישה התלת-ממדית. עם זאת, הטרוגניות ספרואידית ושונות של שיטות הייצור שלהם יכולות להשפיע על חילוף החומרים הכולל בתאים, על הכדאיות ועל התגובה לתרופות. זה מקשה על בחירת המתודולוגיה המתאימה ביותר, בהתחשב בדרישות בגודל, שונות, צרכים של ייצור ביולוגי, ושימוש כמו מודלים תלת ממדיים של רקמות במבחנה בביולוגיה של תאי גזע וסרטן. בפרט, ייצור ספרואידים יכול להשפיע על התאמתם למיקרוסקופיות חיות כמותיות, כגון דימות מטבולי אופטי, מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM), ניטור היפוקסיה ספרואידית באמצעות ננו-חיישנים, או כדאיות. כאן מוצגים מספר פרוטוקולים קונבנציונליים להיווצרות ספרואידים, המדגישים את התאמתם למיקרוסקופים חיים של שדה רחב, קונפוקלי ושני פוטונים. הדמיית המעקב לצנרת הניתוח עם FLIM אוטופלואורסצנטי מרובה, ותוך שימוש בסוגים שונים של סרטן וכדורי תאי גזע, מוצגת גם כן.

Introduction

ספרואידים רב-תאיים מייצגים קבוצה של מודלים תלת-ממדיים של רקמות המתקבלות על ידי צבירה עצמית של תאים ומציגים צורה כדורית. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות אינטראקציה בין תאים ומטריצות תאים במבחנה ולשחזר הקשר תלת-ממדי בתוך מספר רב של מבנים שמקורם בסרטן ובתאי גזע. מספר טכניקות משמשות כדי להפחית את התקשרות התא ולקדם את הצבירה. אלה כוללים את שיטת התלייה-טיפה המסתמכת על מתח פני השטח1; שיטות דוחות התקשרות תאים כגון לוחות התקשרות נמוכים במיוחד, תבניות מיקרו ומיקרו-בארות 2,3; גישה מבוססת גלים אקוסטיים4; שיטות צבירה המושרות על ידי זרימה (צלוחיות ספינר, ביוריאקטור וה....

Protocol

1. דור של ספרואידים רב תאיים

  1. תרבית תאים
    הערה: ניתן לאסוף תרביות תאים מאוסף תרביות הסוג האמריקאי (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich או ספקים אחרים. ATCC מספק את כל מידע הטיפול הנדרש, כולל מדיית גידול מועדפת, נהלי תת-תרבות, רמת בטיחות ביולוגית, קצב צמיחה ופרופילי STR. כאן, 500 תאים/ספרואיד של קו תאי סרט?.......

Representative Results

בחירת שיטת היווצרות הספרואידים המתאימה
שיטת היווצרות הספרואידים שנבחרה יכולה להשפיע מאוד על גודלם, צורתם, צפיפות התא, הכדאיות והרגישות של הספרואידים לתרופות (איור 2). בעבר, הושוו ההשפעות של מספר רב של תפוקות גבוהות (SphericalPlate 5D, מיקרו-תבניות מיוצרות במעבדה ותבניות .......

Discussion

ספרואידים רב-תאיים הופכים לשיטת בחירה במחקרים של מיקרו-סביבות נישה של גידולים ותאי גזע, גילוי תרופות ופיתוח "אבני הבניין של הרקמות" לייצור ביולוגי. הארכיטקטורה הפנימית ההטרוגנית של הספרואידים, שיפועים של חומרים מזינים וחמצון יכולים לחקות את אלה של רקמות in vivo וגידולים בסביבה פשוטה ונ?.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי קרן המחקר המיוחדת (BOF) של אוניברסיטת גנט (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), קרן המחקר פלנדריה (FWO, I001922N) והאיחוד האירופי, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN מס '101073507.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAGibco25300-054Also available from Sigma
10 mL serological pipetsVWR612-3700Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterileGreiner bio-one665-180Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removableIbidi81201Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubesNerbe plus02-502-3001Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromoldsMicrotissueZ764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterileGreiner bio-one657160Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanolChemLabCL02.0537.5000
BiofloatSarstedt83.3925.400Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AMTebubioAS-89201Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension softwareOlympusversion 3
Collagen from human placenta, type IVSigmaC5533For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM MicroscopeLeica MicrosystemsN/AStellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-GlucoseMerck8342Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-freeSigma-AldrichD5030-10X1LFor preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270-098Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)Gibco15630-080Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116ATCC
ImageJNIHversion 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)Leica Microsystemsversion 4.6.1.27508
L-glutamineGibco25030Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206AmsbioAMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPESVWR392-0420Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stampsN/AN/AProvided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaClChemlabCL00.1429.100
Neubauer couting chamberFisher Scientific15980396
O2 probes: MMIR1N/AN/AFull characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110
v1
PBSFisher scientificGibco18912014Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solutionGibco15140-122Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysineSigmaP6407-5mgFor the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium IodideSigma-Aldrich25535-16-4Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µmNovolabA35149Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-wellKugelmeiersSP5D-24W
sterile petridishGreiner bio-one633181Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )VWR734-2311Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)VWR734-2313Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plateVWR10062-900Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure AgaroseInvitrogen (Life Technologies)16500-500Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscopeOlympusN/AInverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water

References

Explore More Articles

2103DFLIM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved