ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

Summary

במאמר זה, אנו מתארים שיטות שונות ליצירת ספרואידים רב-תאיים לביצוע מעקב אחר מיקרוסקופ תאים חיים מרובי פרמטרים. באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM), אוטופלואורסצנטיות תאית, צבעי צביעה וננו-חלקיקים, מודגמת הגישה לניתוח מטבוליזם של תאים, היפוקסיה ומוות תאי בסרטן תלת-ממדי חי (3D) ובספרואידים שמקורם בתאי גזע.

Abstract

ספרואידים סרטניים רב-תאיים הם מודל מיקרו-אגרגטים תלת-ממדי פופולרי לשחזור מיקרו-סביבה של גידולים, בדיקה ואופטימיזציה של טיפולים תרופתיים ושימוש בביו-חיישנים וננו-חיישנים בהקשר תלת-ממדי. קלות הייצור שלהם, גודלם הצפוי, הצמיחה ושיפועי החומרים המזינים והמטבוליטים שנצפו חשובים כדי לשחזר את המיקרו-סביבה התאית דמוית הנישה התלת-ממדית. עם זאת, הטרוגניות ספרואידית ושונות של שיטות הייצור שלהם יכולות להשפיע על חילוף החומרים הכולל בתאים, על הכדאיות ועל התגובה לתרופות. זה מקשה על בחירת המתודולוגיה המתאימה ביותר, בהתחשב בדרישות בגודל, שונות, צרכים של ייצור ביולוגי, ושימוש כמו מודלים תלת ממדיים של רקמות במבחנה בביולוגיה של תאי גזע וסרטן. בפרט, ייצור ספרואידים יכול להשפיע על התאמתם למיקרוסקופיות חיות כמותיות, כגון דימות מטבולי אופטי, מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים (FLIM), ניטור היפוקסיה ספרואידית באמצעות ננו-חיישנים, או כדאיות. כאן מוצגים מספר פרוטוקולים קונבנציונליים להיווצרות ספרואידים, המדגישים את התאמתם למיקרוסקופים חיים של שדה רחב, קונפוקלי ושני פוטונים. הדמיית המעקב לצנרת הניתוח עם FLIM אוטופלואורסצנטי מרובה, ותוך שימוש בסוגים שונים של סרטן וכדורי תאי גזע, מוצגת גם כן.

Introduction

ספרואידים רב-תאיים מייצגים קבוצה של מודלים תלת-ממדיים של רקמות המתקבלות על ידי צבירה עצמית של תאים ומציגים צורה כדורית. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות אינטראקציה בין תאים ומטריצות תאים במבחנה ולשחזר הקשר תלת-ממדי בתוך מספר רב של מבנים שמקורם בסרטן ובתאי גזע. מספר טכניקות משמשות כדי להפחית את התקשרות התא ולקדם את הצבירה. אלה כוללים את שיטת התלייה-טיפה המסתמכת על מתח פני השטח¹; שיטות דוחות התקשרות תאים כגון לוחות התקשרות נמוכים במיוחד, תבניות מיקרו ומיקרו-בארות ^2,3; גישה מבוססת גלים אקוסטיים⁴; שיטות צבירה המושרות על ידי זרימה (צלוחיות ספינר, ביוריאקטור וה....

Protocol

1. דור של ספרואידים רב תאיים

1. תרבית תאים
   הערה: ניתן לאסוף תרביות תאים מאוסף תרביות הסוג האמריקאי (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich או ספקים אחרים. ATCC מספק את כל מידע הטיפול הנדרש, כולל מדיית גידול מועדפת, נהלי תת-תרבות, רמת בטיחות ביולוגית, קצב צמיחה ופרופילי STR. כאן, 500 תאים/ספרואיד של קו תאי סרט?.......

Discussion

ספרואידים רב-תאיים הופכים לשיטת בחירה במחקרים של מיקרו-סביבות נישה של גידולים ותאי גזע, גילוי תרופות ופיתוח "אבני הבניין של הרקמות" לייצור ביולוגי. הארכיטקטורה הפנימית ההטרוגנית של הספרואידים, שיפועים של חומרים מזינים וחמצון יכולים לחקות את אלה של רקמות in vivo וגידולים בסביבה פשוטה ונ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water