Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Summary

Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Abstract

Os esferoides tumorais multicelulares são um modelo popular de microagregado de tecido 3D para reproduzir o microambiente tumoral, testar e otimizar terapias medicamentosas e usar bio e nanossensores em um contexto 3D. Sua facilidade de produção, tamanho previsível, crescimento e gradientes de nutrientes e metabólitos observados são importantes para recapitular o microambiente celular semelhante a um nicho 3D. No entanto, a heterogeneidade esferóide e a variabilidade de seus métodos de produção podem influenciar o metabolismo celular geral, a viabilidade e a resposta aos medicamentos. Isso dificulta a escolha da metodologia mais adequada, considerando os requisitos de tamanho, variabilidade, necessidades de biofabricação e uso como modelos de tecidos 3D in vitro em biologia de células-tronco e cânceres. Em particular, a produção de esferoides pode influenciar sua compatibilidade com microscopias quantitativas ao vivo, como imagens metabólicas ópticas, microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM), monitoramento de hipóxia esferóide com nanossensores ou viabilidade. Aqui, uma série de protocolos convencionais de formação de esferóides são apresentados, destacando sua compatibilidade com as microscopias de campo amplo, confocais e de dois fótons ao vivo. A imagem de acompanhamento para análise pipeline com autofluorescência multiplexada FLIM e, usando vários tipos de câncer e esferóides de células-tronco, também é apresentada.

Introduction

Os esferoides multicelulares representam um grupo de modelos de tecidos 3D obtidos pela autoagregação de células e exibindo uma forma esférica. Eles são amplamente utilizados para imitar a interação célula-célula e célula-matriz in vitro e para reproduzir um contexto 3D dentro de uma infinidade de construções derivadas de câncer e células-tronco. Várias técnicas são empregadas para reduzir a ligação celular e promover a agregação. Isso inclui o método de queda suspensa com base na tensão superficial¹; métodos de repelência de fixação celular, como placas de fixação ultrabaixa, micromoldes e micropoços ^2,3

Protocol

1. Geração de esferóides multicelulares

1. Cultura de células
   NOTA: As culturas de células podem ser coletadas na American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich ou outros fornecedores. O ATCC fornece todas as informações de manuseio necessárias, incluindo meios de crescimento preferidos, procedimentos de subcultura, nível de biossegurança, taxa de crescimento e perfis STR. Aqui, 500 células/esferóide da linha celular de câncer de cólon humano HCT116 são usadas no m.......

Discussion

Os esferoides multicelulares estão se tornando um método de escolha nos estudos de microambientes de nicho de tumores e células-tronco, descoberta de medicamentos e desenvolvimento dos 'blocos de construção de tecidos' para biofabricação. A arquitetura interna heterogênea dos esferoides, gradientes de nutrientes e oxigenação podem imitar os de tecidos e tumores in vivo em um ambiente relativamente simplificado e acessível. Com a necessidade de mais transparência metodológica^26,28

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Also available from Sigma
10 mL serological pipets	VWR	612-3700	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
12 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	665-180	Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies.
12 Well Chamber slide, removable	Ibidi	81201	Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others
15 mL centrifuge tubes	Nerbe plus	02-502-3001	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
3D Petri Dish micromolds	Microtissue	Z764000-6EA
6 well cell-culture plates, sterile	Greiner bio-one	657160	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
70% ethanol	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation
Calcein Green-AM	Tebubio	AS-89201	Apply in dilution 1:1000
CellSens Dimension software	Olympus	version 3
Collagen from human placenta, type IV	Sigma	C5533	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Confocal FLIM Microscope	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective
D(+)-Glucose	Merck	8342	Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	For preparation of imaging medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-098	Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM)
Human colon cancer cells HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	version 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	version 4.6.1.27508
L-glutamine	Gibco	25030	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES	VWR	392-0420	Standard growth medium for HCT116 cells
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps	N/A	N/A	Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Neubauer couting chamber	Fisher Scientific	15980396
O2 probes: MMIR1	N/A	N/A	Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water.
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution	Gibco	15140-122	Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100.
Poly-D-lysine	Sigma	P6407-5mg	For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	25535-16-4	Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation
PVDF syringe filter 0.22 µm	Novolab	A35149	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070	Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM)
SphericalPlate 5D 24-well	Kugelmeiers	SP5D-24W
sterile petridish	Greiner bio-one	633181	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
Tissue culture flask (75 cm²)	VWR	734-2313	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma)
Widefield fluorescence inverted microscope	Olympus	N/A	Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water