A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.
Os esferoides tumorais multicelulares são um modelo popular de microagregado de tecido 3D para reproduzir o microambiente tumoral, testar e otimizar terapias medicamentosas e usar bio e nanossensores em um contexto 3D. Sua facilidade de produção, tamanho previsível, crescimento e gradientes de nutrientes e metabólitos observados são importantes para recapitular o microambiente celular semelhante a um nicho 3D. No entanto, a heterogeneidade esferóide e a variabilidade de seus métodos de produção podem influenciar o metabolismo celular geral, a viabilidade e a resposta aos medicamentos. Isso dificulta a escolha da metodologia mais adequada, considerando os requisitos de tamanho, variabilidade, necessidades de biofabricação e uso como modelos de tecidos 3D in vitro em biologia de células-tronco e cânceres. Em particular, a produção de esferoides pode influenciar sua compatibilidade com microscopias quantitativas ao vivo, como imagens metabólicas ópticas, microscopia de imagem de fluorescência ao longo da vida (FLIM), monitoramento de hipóxia esferóide com nanossensores ou viabilidade. Aqui, uma série de protocolos convencionais de formação de esferóides são apresentados, destacando sua compatibilidade com as microscopias de campo amplo, confocais e de dois fótons ao vivo. A imagem de acompanhamento para análise pipeline com autofluorescência multiplexada FLIM e, usando vários tipos de câncer e esferóides de células-tronco, também é apresentada.
Os esferoides multicelulares representam um grupo de modelos de tecidos 3D obtidos pela autoagregação de células e exibindo uma forma esférica. Eles são amplamente utilizados para imitar a interação célula-célula e célula-matriz in vitro e para reproduzir um contexto 3D dentro de uma infinidade de construções derivadas de câncer e células-tronco. Várias técnicas são empregadas para reduzir a ligação celular e promover a agregação. Isso inclui o método de queda suspensa com base na tensão superficial1; métodos de repelência de fixação celular, como placas de fixação ultrabaixa, micromoldes e micropoços 2,3
1. Geração de esferóides multicelulares
Escolhendo o método apropriado de formação de esferoides
O método de formação de esferóides selecionado pode influenciar muito o tamanho, a forma, a densidade celular, a viabilidade e a sensibilidade aos medicamentos dos esferoides (Figura 2). Anteriormente, os efeitos de vários métodos de alto rendimento (SphericalPlate 5D, micromoldes feitos em laboratório e moldes MicroTissue) e os métodos de baixa fixação de 'rendimento médio' (placas de 96 poços revest.......
Os esferoides multicelulares estão se tornando um método de escolha nos estudos de microambientes de nicho de tumores e células-tronco, descoberta de medicamentos e desenvolvimento dos 'blocos de construção de tecidos' para biofabricação. A arquitetura interna heterogênea dos esferoides, gradientes de nutrientes e oxigenação podem imitar os de tecidos e tumores in vivo em um ambiente relativamente simplificado e acessível. Com a necessidade de mais transparência metodológica26,28
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Fundo Especial de Pesquisa (BOF) da Universidade de Ghent (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fundação de Investigação da Flandres (FWO, I001922N) e União Europeia, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN n.º 101073507.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Also available from Sigma |
10 mL serological pipets | VWR | 612-3700 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
12 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 665-180 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning and other companies. |
12 Well Chamber slide, removable | Ibidi | 81201 | Also available from Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific and others |
15 mL centrifuge tubes | Nerbe plus | 02-502-3001 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
3D Petri Dish micromolds | Microtissue | Z764000-6EA | |
6 well cell-culture plates, sterile | Greiner bio-one | 657160 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
70% ethanol | ChemLab | CL02.0537.5000 | |
Biofloat | Sarstedt | 83.3925.400 | Commercial available coated 96-well plate for spheroid formation |
Calcein Green-AM | Tebubio | AS-89201 | Apply in dilution 1:1000 |
CellSens Dimension software | Olympus | version 3 | |
Collagen from human placenta, type IV | Sigma | C5533 | For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
Confocal FLIM Microscope | Leica Microsystems | N/A | Stellaris 8 Falcon inverted microscope with white-light laser, HyD X detectors, climate / T control chamber (OkoLab), 25x/0.95 W objective |
D(+)-Glucose | Merck | 8342 | Prepare 1 M stock solution, 1:100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM) |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phenol red-, glucose-, pyruvate- and glutamine-free | Sigma-Aldrich | D5030-10X1L | For preparation of imaging medium |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-098 | Also available from Sigma. Needs to be heat-inactivated before use. |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 10 mM) |
Human colon cancer cells HCT116 | ATCC | ||
ImageJ | NIH | version 1.54f | |
Leica Application Suite X (LAS X) | Leica Microsystems | version 4.6.1.27508 | |
L-glutamine | Gibco | 25030 | Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100. |
Lipidure-CM5206 | Amsbio | AMS.52000034GB1G | |
McCoy's 5A, need addition of 1 mM Sodium Pyruvate and 10 mM HEPES | VWR | 392-0420 | Standard growth medium for HCT116 cells |
micro-patterned 3D-printed PDMS stamps | N/A | N/A | Provided by the Centre for Microsystems Technology, Professor Dr. Jan Vanfleteren, Ghent University |
NaCl | Chemlab | CL00.1429.100 | |
Neubauer couting chamber | Fisher Scientific | 15980396 | |
O2 probes: MMIR1 | N/A | N/A | Full characterization, validation and some applications can be found at: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1 |
PBS | Fisher scientific | Gibco18912014 | Dissolve PBS tablet in 500 mL of distilled water. |
Pen Strep :Penicillin (10,000 U/mL) / streptomycin (10,000 μg/mL) 100x solution | Gibco | 15140-122 | Also available from Sigma. Apply in dilution 1:100. |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407-5mg | For the preparation of 0.07 mg/mL Collagen and 0.03 mg/mL Poly-D-lysine coated microscopy dishes |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | 25535-16-4 | Cell death staining, use 1 µg/mL at 1h incubation |
PVDF syringe filter 0.22 µm | Novolab | A35149 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | Dilution 1/100 for preparation of imaging medium (final concentration 1mM) |
SphericalPlate 5D 24-well | Kugelmeiers | SP5D-24W | |
sterile petridish | Greiner bio-one | 633181 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Tissue culture flask (25 cm² ) | VWR | 734-2311 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
Tissue culture flask (75 cm²) | VWR | 734-2313 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, VWR and other companies |
U-bottom 96-well plate | VWR | 10062-900 | Similar products are also available from Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one and other companies |
Ultrapure Agarose | Invitrogen (Life Technologies) | 16500-500 | Other types of Agarose such as Agarose low melting point (A-9414, Sigma), Agarose for routine use (A-9539, Sigma) |
Widefield fluorescence inverted microscope | Olympus | N/A | Inverted fluorescence microscope IX81, with motorised Z-axis control, CoolLED pE4000 (16 channels, 365-770 nm), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS camera, glass warming plate Okolab, CellSens Dimension v.3 software and air objectives 4x/0.13 UPlanFLN and 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Optional, for high-resolution imaging) 60x/1.0 LUMPLFLN water |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved