Retina Bipolar Hücreler TIRF Mikroskopi Görüntüleme ekzositoz

Özet

Bu video, etiket ve görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi kullanılarak goldfish retina bipolar hücreleri tek sinaptik vezikül ekzositoz ve ticareti nasıl göstermek.

Özet

Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu, cam gibi yüksek bir kırılma indisi maddeye yakın floresan moleküllerin seçici görüntüleme, hücre zarı meydana gelen olayların çalışma sağlayan bir tekniktir

Protokol

Bölüm 1: Diseksiyon ve Bipolar Hücre İzolasyonu

1. Tablo 2'de listelenen çözümler hazırlayın; zilleri 'pH (harici) çözümleri NaOH ile 7.4' e ayarlanmış olmalı ve iç çözüm pH 7.2 CsOH ile ayarlanabilir olmalıdır. Iç çözüm alüminyum folyo ile ışıktan korumak ve tutmak 4 ° C kullanana kadar;
2. Diseksiyon önce en az 30 dakika için bir Japon balığı Karanlık uyum;
3. (Sigma, St Louis, MO tip V hiyalüronidaz düşük Ca ^{2 +} ringer, 1100 adet / ml) ve L-sistein (0.5 mg / ml, 10 ml hayvan koyu adapte ederken, 5 ml hiyalüronidaz hazırlamak düşük Ca ^{2 +} ringer) çözümleri ve papain tartmak (liyofilize toz, 40 adet / ml, 5 ml sindirim çözüm Sigma, St Louis, MO);
4. Cerrahi makas ile hızlı dekapitasyon goldfish Euthanize ve # 11 neşter bıçağı ile beyin ve omurilik yok;
5. # 7 kavisli Dumont forseps yardımı ile ekstra oküler kaslar yok ve iris makası ile optik sinir kesme gözleri çıkarın;
6. Filtre kağıdı ve delinme skleral limbus # 11 neşter bıçak ucu ile bir parça bir göz ampul;
7. Delinmiş bütün içinde vannas makas bir çift bıçak tanıtmak ve hemen tüm anterior segment kesebilirsiniz;
8. Kalan optik fincan filtre kağıdı küçük bir parça koyun ve kağıt vitreus mizah ile emmek için bazı baskı;
9. Ona bağlı retina ile filtre kağıdı kaldırın ve bir par vannas makas ile optik sinir kesmek;
10. # 7 Dumont cımbız yardımı ile filtre kağıdı retina kapalı hiyalüronidaz çözüm ve soyulma ile 35 mm plastik kültür çanak retina içeren filtre kağıdı yerleştirin;
11. Retinanın bir endüstriyel karbon çelik tek ağızlı bıçak yarısı 4-6 parçalar halinde kesin ve 20 dakika boyunca hiyalüronidaz bir çözüm bekletin;
12. Yürürlüğe girmesi hiyalüronidaz için beklerken, L-sistein çözüm papain 5 ml ekleyin ve sıvı şeffaf hale gelinceye kadar (yaklaşık 5-10 dakika) oturup izin;
13. Düşük Ca ^{2 +} Ringer 3x retinanın adet yıkayın ve bunları 30-35 dakika papain çözüm bekletin;
14. Düşük Ca ^{2 +} Ringer 3x retinanın adet yıkayın ve kullanana kadar saklayabilirsiniz 4 ° C düşük Ca ² içeren 35 mm plastik kültür çanak ⁺ Ringer;
15. Hücreleri ayırmak, düşük Ca ^{2 +} Ringer 500 ml içeren bir mikrosantrifüj tüp içinde retinanın bir parça koydu ve yavaş yavaş hava kabarcığı üretmek için dikkatli bir şekilde, bir bardak disosiasyon pipet ile yukarı ve aşağı pipetleme retina çiğnemek . Bunsen beki ile bir bardak Pasteur pipeti ucu ısınma ve anatomik forseps yardımı ile hafif bükme Disosiyasyon pipetler fabrikasyon;
16. Plate izole hücreler retina süspansiyon, daha önce 2 ^mL düşük ^Ca 2 + ringer ile dolu bir ev yapımı kayıt odasına bir damla ekleyerek. Odanın ortasında dairesel bir bütün ile 35 mm plastik kültür çanağı ve bir silikon elastomer (Sylgard 184 altına yapıştırılmış 1.78 refraktif indeks cam (PlanOptik Almanya) dairesel bir lamel alt yarısında oluşur; Dow Corning Midland).

Bölüm 2: Bipolar Hücre Yükleme ve Out yıkayın

Sinaptik veziküllerin TIRF görüntüleme en iyi şekilde, çok yüksek bir NA nesnel ve duyarlı bir kamera, objektif bir tip TIRFM mikroskop kullanılarak gerçekleştirilir. Deneyler için, bir EMCCD (Cascade 512B, Roper Bilimsel, Tucson, AZ) ile 1.65 NA objektif (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Japonya) kullanmayı tercih. Çok yüksek NA objektif kullanımı, yüksek kırılma cam lamelleri ve daldırma sıvısı (kükürt ile di-iodomethane) kullanımını zorunlu kılmaktadır. Koşullar altında, yaklaşık 50 nm sabit bir uzunluk ile uyarma ışık katlanarak çürüyen bir alanda sınırlıdır.

1. Mikroskop objektif yüksek kırılma indisi sıvı (M serisi, refraktif indeksi = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) bir damla ekleyin;
2. Mikroskop objektif üstüne dikkatlice kayıt odasına yerleştirin ve dikkatli bir şekilde toprak elektrot ve odasına superfusion çıkış borusu monte;
3. Kamara, hücreleri lavabo ve alt uymak için izin mikroskopta 10-20 dakika oturup;
4. Bu arada, 1mm Trolox ® ((±)- 6-hidroksi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-karboksilik asit 5 ml hazırlamak; Sigma, St Louis, MO), yüksek K ⁺ ringer çözüm . Eriyene kadar sonikasyon;
5. Düşük Ca ^{2 +} ringer 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St Louis, MO): ADVASEP-7 yıkama solüsyonu 15 mL hazırlayın. ADVASEP-7 kullanımı isteğe bağlıdır ve istenirse atlanabilir unutmayın;
6. Superfusion li Temizleeşya ve eklemek ADVASEP-7 yıkama solüsyonu, düşük Ca ^{2 +} ringer ve kontrolü zil sesi superfusion sistemi;
7. Ince duvarlı borosilikat cam (TEFE, Sarasota, FL Kwik-Fil ® TW150-3) pipetler yükleme çekin. Puffer pipet dirençler 1.5-2.5 M aralığı;
8. Çözümleri; FM1-43 ® (Invitrogen, Carlsbad, CA - (4 (dibutylamino) styryl) piridinium dibromür, "özel paketleme" N-(3-triethylammoniumpropyl) -4) hazırlayın. Birincisi, bir flakon FM1-43 (100 mg) ® 160 mcL distile su ekleyerek 1 mM stok olun. Bu stok, bir haftaya kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Sonra FM1-43 5 mcL eklemek ® 1 ml yüksek K ⁺ ringer + 1mm Trolox ®. Çözüm alüminyum folyo ile ışıktan koruyun ve 4 tutmak ° C kullanana kadar;
9. Mikroskop parlak bir alan ışığı açın ve sağlam bipolar hücreleri aramak. Biraz nöronlar odasının altına sıkıca bağlı olduğundan emin olmak için dokunun mikroskop;
10. Superfusion kalem yakın ilgi hücreye yerleştirin ve sürekli düşük Ca ^{2 +} ringer hazırlık serpmek;
11. Odanın lambalarını kapatın ve kırmızı uzun geçiren filtre (yani RG630; Schott, Almanya) FM boya uyarma en aza indirmek için optik yol;
12. 10 mcL FM boya çözüm ile doldurun mikromanipülatör bir yükleme pipet pipet montajı ve basınç olmadan, yüklemek istediğiniz bipolar hücre aynı odak düzlemli kadar hazırlanması üzerine pipet düşük. En az iki elektrot tutucu olduğundan emin olun: FM boya için kullanılan bir başka hücre içi bir çözüm kontamine olabilir yama sıkma için kullanılır, ya da değildir;
13. Akson terminalinden yaklaşık 10 mikron mesafe kirpi açılış Pozisyon, superfusion sistemi kapatın ve 10 saniye boyunca boya çözüm pipet basınç çevirerek puff;
14. 30 saniye bekleyin, pipet hareket ettirmeden, basınç kapatın ve;
15. Superfusion çevirin ve 5 dakika ADVASEP-7 çözüm odasının banyo. Bu arada, banyo kirpi pipet kaldırmak;
16. 5 dakika sonra, düşük Ca ^{2 +} ringer geçmek ve 25-30 dakika süreyle odasının serpmek aşırı boya atılmasına izin verir.

Bölüm 3: Patch Sıkma ve TIRFM Görüntüleme

1. Hazırlık yıkama, kalın duvarlı borosilikat cam (Sutter Instrument Company, Novato, CA B150-86-10) yama pipetler çekin. Patch pipet dirençleri 8-10 M aralığı;
2. Yıkayın tamamlandıktan sonra, akson terminaline görüş alanının merkezinde yer;
3. Mikromanipülatör monte iç çözüm 7μL bir yama pipet ile doldurun, hava kabarcıkları, mont, erimiş diş balmumu (Kerr Corporation, Orange, CA Sabit Wax) ile pipet kurtulmak için pipet dokunun;
4. Pipet basınç açın ve pipet hazırlanması üzerine yavaş yavaş daha düşük. Amplifikatör pipet direnci ve doğru pipet uzaklıklar ilgili amplifikatör kontrolleri ile kapasitans ve kontrol edin;
5. Ringer kontrol superfusion geçin. Pipet ve hücre arasında bir gigaseal oluşturmak için, hücre gövdesi karşı elektrot ucu hafifçe dokunun ve hafifçe elektrot negatif basınç uygularken pipet basınç kapatmak;
6. Kapatılmış olsa da, amplifikatör "tam hücreli" modunu seçin ve potansiyeli -60 mV tutan hücre ayarlamak;
7. Tüm akson terminali kapsayan görüntüleme yazılımı ile ilgi bir bölge seçin, parlak bir alan ışığı kapatın ve kısaca (30 ms) 488 nm lazer terminal açığa TIRF görüntüleme için doğru bir odak düzlemli bulmak;
8. Pipet biraz negatif basınç uygularken amplifikatör "zap" komutunu kullanarak hücre içine break;
9. Sinaptik veziküllerin hücre kapasitans ve seri direnç, doğru ve daha sonra ise ilgi gerilim protokolü uygulamak görüntüleme hareketi. Bu gerilim protokol kamera kare hızı ile senkronize olması için bu aşamada önemlidir. Bizim durumumuzda, her bir kare 30 ms uzun, voltaj değişiklikleri meydana gelen bu değeri (yani, her 300 ms veya 10 kare) katları;
10. Kurtarma için izin denemeleri arasında en az 40 saniye bekleyin;
11. 561 nm lazer açarken sinaptik şeritler konumunu kontrol etmek, fotoğraf çekmek.

Şekil 1: deney düzeneği. 488 nm lazer (mavi) amacı, arka odak düzlemi çevre odaklı ve cam sulu ortamda arayüzü ulaştığında toplam iç yansıma uğrar. Yansıyan ışın tarafından üretilen elektromanyetik alan Bott yakın sinaptik veziküller içine yüklenen fluorofor heyecanlandıran(yeşil) floresan cam odasının om. Floresan ışık, daha sonra gözlemci göz (tasvir) veya CCD kamera yönlendirilir. Patch-sıkma görüntülü hücrelerinin membran potansiyeli aynı anda kontrol edilir. Bu yaklaşım, gelen sinyalleri (membran voltaj) ve nöronal çıkışı (ekzositoz) arasındaki ilişki çalışma sağlar.

Şekil 2: Tipik bir sonuç. Sol: izole bir Japon balığı bipolar hücre parlak alan görüntü. Üst sağ: bipolar hücre akson terminaline sinaptik veziküllerin TIRF görüntü FM 1-43 yüklü ® ve 488 nm lazer (FM boya) ile görüntülenmiş. Sağ alt: 561 nm lazer ile yama hücre ve görüntüleme akson terminaline sonra aynı terminal görüntüsü. Synaptic şeritler rodamin tabanlı RIBEYE bağlayıcı peptid (Rpep_rhod) tarafından etiketlenir.

Tablo 1: Belirli Reaktifler ve Ekipmanları.

Isim	Tip	Üretici	Katalog	Yorum
-	Hava Tablo	Newport Corporation'ın	-	-
IX70	Ters Mikroskop	Olympus	-	Tungsten lamba ve parlak bir alan için TIRF lateral açılış portu ile donatılan
TH4-100	Lamba Güç Kaynağı	Olympus	-	-
FF498_581-DI01	Dikroik Filtre	Semrock	-	-
NF01-405_488_568	Emisyon Filtre	Semrock	-	-
Apo x100 O İK	Nesnel	Olympus	-	NA 1.65
RG630	Kırmızı Cam Filtresi	Schott	-	-
-	488 nm Lazer	Tutarlı	-	Minimum güç kullanımı
-	Panjur	Uniblitz	-	-
VMM-D1	Deklanşör Sürücü	Uniblitz	-	-
-	561 nm Lazer	Melles Griot	-	-
-	Panjur	Uniblitz	-	-
VMM-D3	Deklanşör Sürücü	Uniblitz	-	-
Perfüzyon basıncı Kiti	Superfusion Sistemi	Bilimsel otomatikleştirin	09-04	-
Perfüzyon Kalem	Superfusion Sistemi	Bilimsel otomatikleştirin	-	-
Valvelink 8	Superfusion Sistemi Kontrolörü	Bilimsel otomatikleştirin	-	-
Cascade 512B	EM CCD Kamera	Roper Bilimsel	-	-
Metamorph 7.1	Görüntüleme Yazılımı	Moleküler Cihazlar	-	-
EPC-9	Yama Kelepçe Amplifikatör	Heka Elektronik	-	-
Nabız	Amplifikatör Yazılım	Heka Elektronik	-	-
MP-285	Mikromanipülatör	Sutter Enstrüman	-	-
-	Elektrod tutucu	Heka Elektronik	-	1.5 mm cam, 2 adet için
Kwik-Fil ® TW150-3	Borosilikat Kılcal Cam	TEFE	-	Filament olmadan
B150-86-10	Borosilikat Kılcal Cam	Sutter Enstrüman	-	Filament ile
P-97	Mikroelektrod Çektirme	Sutter Enstrüman	-	3x3 kutusunda filament ve çevre bölmesi ile donatılmış
-	Basınç Vakum Hava Pompası	Thomas Bilimsel	7893B05	Pipetler için oda ve aşırı basınç sıvı kaldırmak için bir vakum yaratır.
MatLab R2008a	Analiz Yazılımı	MathWorks	-	-
353001	35 mm Plastik Kültür Yemekleri	Şahin	-	-
-	Yüksek Kırılma Endeksli Camı	PlanOptik	-	Kırılma indisi 488 nm = 1.78
M Serisi	Yüksek Refraktif İndeks Sıvı	Cargille Labs	-	Kırılma indeksi = 1.78
Sylgard 184	Silikon Elastomer Kiti	Dow Corning	-	-
Glutatyon	Tripeptide	Merck Kimyasallar		Ücretsiz RADİKAl çöpçü
Hyaluronidase	Enzim	Sigma	H6254	Tip V
L-sistein	Amino Asit	Fluka	30090	Papain etkinleştirir
Papain	Enzim	Fluka	76220	From carica papaya
Trolox ®	Çözünen vitamin E	Sigma	56510	Serbest radikal temizleyicisidir
ADVASEP-7	Sülfonatlı B-siklodekstrin Türev	Sigma	A3723	FM 1-43 azaltır ® eşiğe
FM 1-43 ®	Floresan Boya	Invitrogen	T35356	"Özel ambalaj"
Sabit Wax	Pipet Kaplama Agent	Kerr Corporation'ın	-	Pipet kapasitans azaltır

Tablo 2: Bu Çalışmasında Kullanılan Fizyolojik Çözümler.

Madde	Düşük Ca 2 + Ringer	Kontrol Ringer	Yüksek K + Ringer	İç Çözüm
NaCl	120 mm	120 mm	97.5 mM	-
KCl	2.5 mM	2.5 mM	25 mM	-
MgCl 2	1 mM	1 mM	1 mM	4 mM
CaCl 2	0.5 mM	2.5 mM	2.5 mM	-
Hepes	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
EGTA	0.75 mM	-	-	0.5 mM
Glikoz	10 mM	10 mM	-	-
Glutatyon	2 mM	2 mM	-	1 mM
CH 3 STK 3 S *	-	-	-	100 mM
TEACl	-	-	-	10 mM
ATP-Mg	-	-	-	10 mM
GTP-Li	-	-	-	1 mM
Rpep-rhod **	-	-	-	5 mM
Hacim	200 mL	100 mL	5 mcL	100 mcL

* Sezyum methanesulfonate.
** RIBEYE bağlayıcı peptid: rodamin + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1997,75).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Işık mesafe ile katlanarak düşer bu yana 2); objektif tip TIRF mikroskopi avantajları 1), böylece ışık-odak en aza indirmek amacı, odak düzlemi içinde dar bir bölgeye uyarma ışık kısıtlayarak mükemmel optik kesit sağladığı floresan yoğunluğunda bir değişiklik olarak, dikey yönde hareket izlenebilir; 3) yüksek sayısal açıklık hedefi ^1,5 ile verimli bir ışık toplama .

Bu tekniğin en önemli dezavantajı, elektron mikroskobu ile ultra ince bölümüne eşdeğerdir hücre yüzeyi, 100 ve m...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.