Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Resumo

Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).

Resumo

Refletância interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma técnica que permite o estudo dos eventos que acontecem na membrana celular, pela imagem seletiva de moléculas fluorescentes que são mais próximos a uma substância de alto índice de refração, como vidro

Protocolo

Parte 1: Dissecção e isolamento de células Bipolar

1. Preparar soluções listadas na Tabela 2; O pH de toques "(externa) de soluções deve ser ajustado para 7,4 com NaOH e do pH da solução interna deve ser ajustado para 7,2 com CsOH. Proteger a solução interna da luz com papel alumínio e mantenha-o a 4 ° C até o uso;
2. Dark-se adaptar um peixinho dourado, pelo menos, 30 minutos antes da dissecção;
3. Enquanto o animal se adapta-escuro, preparar 5 mL de hialuronidase (V tipo hialuronidase, 1100 unidades / mL em baixo Ca ^{2 +} Ringer; Sigma, St. Louis, MO) e 10 mL de L-cisteína (0,5 mg / mL em Ca ^{2 +} baixo) da campainha as soluções e pesar os papaína (pó liofilizado, 40 unidades / mL; Sigma, St. Louis, MO) por 5 mL da solução de digestão;
4. Euthanize o goldfish por decapitação rápida com uma tesoura cirúrgica e destruir o cérebro ea medula espinhal com uma lâmina de bisturi # 11;
5. Remove os olhos, destruindo os músculos extra-oculares com a ajuda de uma pinça # 7 curvas Dumont e cortar o nervo óptico com tesoura de íris;
6. Lugar lâmpada um olho em um pedaço de papel de filtro e punção do limbo escleral com a ponta de uma lâmina de bisturi # 11;
7. Introduzir a lâmina de uma tesoura Vannas dentro do todo perfurado e cortar todo o segmento anterior de distância;
8. Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro em cima do copo restante óptica e exercer alguma pressão, a fim de ter o papel de absorver com humor vítreo;
9. Levante o papel de filtro com a retina ligado a ele e cortar o nervo óptico com um par de tesouras Vannas;
10. Coloque o papel de filtro contendo a retina em um prato de 35 milímetros de plástico cultura com solução de hialuronidase e descolar a retina do papel de filtro com a ajuda de uma pinça # 7 Dumont;
11. Cortar a retina em 4-6 pedaços com metade de uma lâmina de aço carbono industrial único gumes e deixe descansar na solução de hialuronidase por 20 minutos;
12. Enquanto espera por hialuronidase para entrar em vigor, adicionar 5 mL da solução de L-cisteína ao papaína e deixe descansar até que o líquido se torna transparente (aproximadamente 5-10 minutos);
13. Lave os pedaços de retina 3x de baixa Ca ^{2 +} Ringer e deixá-los sentar-se na solução de papaína por 30-35 minutos;
14. Lave os pedaços de retina 3x de baixa Ca ^{2 +} Ringer e armazená-los até o uso a 4 ° C em um prato de cultura 35 milímetros de plástico contendo Ca ^{2 +} baixo de Ringer;
15. Dissociar as células, coloque um pedaço de retina em um tubo de microcentrífuga contendo 500 mL de baixo Ca ^{2 +} Ringer e lentamente triturar a retina pipetando cima e para baixo com uma dissociação de vidro pipeta, cuidadosamente para não produzir quaisquer bolhas de ar. Pipetas dissociação são fabricados por aquecimento até a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro com um bico de Bunsen e ligeiramente dobrá-la com a ajuda de uma pinça anatômica;
16. A placa de células isoladas, adicionando uma gota da suspensão da retina a um home-made câmara de gravação previamente preenchidos com 2 mL de Ca ^{2 +} baixo Ringer. A câmara consiste na metade inferior de uma placa de cultura de 35 mm de plástico com um todo circular no meio e uma lamela de vidro circular de 1,78 do índice de refração (PlanOptik, Alemanha), colado ao fundo com um elastômero de silicone (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI).

Parte 2: Bipolar Carregando Celular e Wash Out

TIRF imagens das vesículas sinápticas é melhor realizado através de um microscópio TIRFM objetivo do tipo com um objetivo NA muito alta e uma câmera sensível. Para nossos experimentos, optamos por usar um 1,65 NA objetivo (x100 Apo O HR, NA 1,65, Olympus, Japão) com um EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). O uso do objectivo NA muito elevado exige a utilização de lamínulas de vidro de alta refração e fluido de imersão (di iodometano com enxofre). Nas nossas condições, luz de excitação está limitado a um campo de decaimento exponencial com um comprimento constante de aproximadamente 50 nm.

1. Adicionar uma gota de líquido de alta índice de refração (série M, índice de refração = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) para a objetiva do microscópio;
2. Coloque a câmara de gravação cuidadosamente em cima da objetiva do microscópio e cuidadosamente montagem eletrodo terra e tubo de saída para superfusão câmara;
3. Deixe câmara de sentar-se no microscópio por 10-20 minutos para permitir que as células a afundar e aderir ao fundo;
4. Nesse meio tempo, preparar 5 mL de uma trolox 1mM ® ácido ((±)- 6-hidroxi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxílico; Sigma, St. Louis, MO solução) em alta K ⁺ Ringer . Sonicate até à dissolução;
5. Prepare 15 mL de solução ADVASEP-7 lavagem: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) em baixo Ca ^{2 +} Ringer. Note-se que ADVASEP-7 uso é opcional e pode ser omitido, se desejar;
6. Purgar o li superfusãones e adicione solução ADVASEP-7 de lavar roupa, Ca ^{2 +} baixo toque e controle de campainha para o sistema superfusão;
7. Puxar carga pipetas de paredes finas de vidro de borosilicato (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Resistências Puffer pipeta estão na faixa de 1,5-2,5 mohms;
8. Prepare o FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryl) pyridinium dibrometo ", embalagens especiais"; Invitrogen, Carlsbad, CA) soluções. Primeiro, faça um estoque de 1 mm, adicionando 160 mL de água destilada para um frasco (100 mg) de FM1-43 ®. Este estoque pode ser mantido a 4 ° C por até uma semana. Em seguida, adicionar 5 mL de FM1-43 ® a 1 mL de alto K ⁺ + Ringer 1mM trolox ®. Proteger a solução da luz com papel alumínio e mantenha-o a 4 ° C até o uso;
9. Ligue o microscópio de luz brilhante em campo e procurar células intactas bipolar. Ligeiramente toque no microscópio para se certificar de que os neurônios estão firmemente ligado ao fundo da câmara;
10. Posição da caneta superfusão próximo à célula de interesse e de forma contínua perfundir a preparação com baixo Ca ^{2 +} Ringer;
11. Desligue as luzes da sala e adicionar um longo vermelho filtro passa (isto é, RG630, Schott, Alemanha) para o caminho óptico para minimizar a excitação do corante FM;
12. Preencha uma pipeta de carga com 10 mL da solução corante FM, montar a pipeta na micromanipulador e inferior da pipeta sobre o preparo, sem sobrepressão até que esteja no mesmo plano focal como a célula bipolar você deseja carregar. Certifique-se de ter pelo menos dois titulares eletrodo: o utilizado para o corante FM não pode ser usado para patch clamping, ou então ele pode contaminar a solução intracelular;
13. Posição da abertura do soprador a uma distância de cerca de 10 mM do terminal axônio, por sua vez o sistema superfusão off e puff a solução corante por 10 segundos girando a sobrepressão pipeta sobre;
14. Vire a sobrepressão fora e, sem mover a pipeta, aguarde 30 segundos;
15. Vire o superfusão e tomar banho na câmara em ADVASEP-7 solução por 5 minutos. Nesse meio tempo, retire a pipeta puffer do banho;
16. Depois de cinco minutos, mude para baixo Ca ^{2 +} campainha e perfundir a câmara por 25-30 minutos para permitir a remoção de corante em excesso.

Parte 3: Patch de fixação e TIRFM Imagem

1. Enquanto a preparação é lavar para fora, puxe pipetas patch da espessura de paredes de vidro de borosilicato (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Resistências remendo pipeta estão na faixa de 80-10 mohms;
2. Depois de lavar estiver concluída, coloque o axônio terminal no centro do campo de visão;
3. Preencha uma pipeta patch com 7μL de solução interna, toque a pipeta para se livrar de bolhas de ar, revestimento da pipeta com cera dental fundido (cera pegajosa; Kerr Corporation, Orange, CA) e montá-la na micromanipulador;
4. Vire a sobrepressão pipeta sobre e inferior a pipeta lentamente sobre a preparação. Verifique a resistência da pipeta no amplificador e deslocamentos pipeta correto e capacitância com os controles do amplificador respectivos;
5. Mudar o superfusão para controlar Ringer. Para criar um gigaseal entre a pipeta ea célula, ligeiramente tocar a ponta do eletrodo contra o corpo da célula e ligue a sobrepressão pipeta off, enquanto gentilmente a aplicação de pressão negativa para o eletrodo;
6. Enquanto fechado, escolha "toda célula" modo no amplificador e definir a cela potencial de -60 mV;
7. Escolha uma região de interesse com o software de imagem que engloba o axônio terminal inteiro, ligar a luz de campo claro off e, por breves instantes, expondo (30 ms) do terminal para o laser nm 488, encontrar o plano certo para TIRF focal de imagem;
8. Invadir a célula usando o "zap" comando do amplificador ao aplicar pressão ligeiramente negativa para a pipeta;
9. Correto para capacitância da célula e resistência em série, e depois aplicar o protocolo de tensão de interesse, enquanto movimento de imagens de vesículas sinápticas. É nesta fase importante ter o protocolo de tensão sincronizada com a taxa de quadros da câmera. No nosso caso, cada quadro é de 30 ms de comprimento, de modo a variações de tensão ocorrem em múltiplos desse valor (ou seja, a cada 300 ms ou 10 quadros);
10. Espere pelo menos 40 segundos entre ensaios para permitir a recuperação;
11. Para verificar a posição de fitas sinápticas, tirar fotos ao girar o laser nm em 561.

Figura 1: A configuração experimental. Um laser de 488 nm (azul) é voltado para a periferia do plano focal posterior da objetiva e sofre reflexão interna total quando ele atinge o vidro aquoso interface de médio porte. O campo eletromagnético gerado pelo feixe refletido excita o fluoróforo carregado no vesículas sinápticas mais próximo do bottom da câmara de vidro, que então fluorescência (verde). A luz fluorescente é então guiado ao olho do observador (representado) ou a uma câmera CCD. O potencial de membrana das células imaged é controlado simultaneamente por patch-aperto-los. Esta abordagem permite o estudo da relação entre os sinais de entrada (a tensão de membrana) ea saída neuronal (exocitose).

Figura 2: Resultados típicos. Esquerda: Imagem de campo claro de uma célula isolada goldfish bipolar. Superior direito: image TIRF das vesículas sinápticas no terminal axonal célula bipolar carregado com FM 1-43 ® e fotografada com o laser de 488 nm (FM corante). Parte inferior direita: imagem do terminal mesmo depois remendar o celular e as imagens do terminal axonal com o laser nm 561. Fitas sinápticas são rotulados pela rodamina baseado em peptídeo de ligação de olho de lombo (Rpep_rhod).

Tabela 1: Reagentes e equipamentos específicos.

Nome	Tipo	Fabricante	Catálogo	Comentário
-	Air Tabela	Newport Corporation	-	-
IX70	Microscópio invertido	Olimpo	-	Equipado com uma lâmpada de tungstênio para campo claro e uma porta de abertura lateral para TIRF
TH4-100	Fonte de energia da lâmpada	Olimpo	-	-
FF498_581-DI01	Dichroic Filtro	Semrock	-	-
NF01-405_488_568	Filtro de emissão	Semrock	-	-
X100 Apo O HR	Objetivo	Olimpo	-	NA 1,65
RG630	Red Filtro de Vidro	Schott	-	-
-	Laser 488 nm	Coerente	-	Use o mínimo de energia
-	Obturador	Uniblitz	-	-
VMM-D1	Driver de obturador	Uniblitz	-	-
-	Laser 561 nm	Melles Griot	-	-
-	Obturador	Uniblitz	-	-
VMM-D3	Driver de obturador	Uniblitz	-	-
Kit de pressão de perfusão	Sistema superfusão	Automatizar Scientific	04/09	-
Pen perfusão	Sistema superfusão	Automatizar Scientific	-	-
ValveLink 8	Controlador do Sistema superfusão	Automatizar Scientific	-	-
Cascade 512B	EM CCD Camera	Roper Scientific	-	-
Metamorph 7,1	Software de imagem	Os dispositivos moleculares	-	-
EPC-9	Amplificador de patch clamp	Heka Elektronik	-	-
Pulso	Software amplificador	Heka Elektronik	-	-
MP-285	Micromanipulador	Instrumento Sutter	-	-
-	Titular eletrodo	Heka Elektronik	-	Por 1,5 mm de diâmetro externo de vidro, 2 unidades
Kwik-Fil ® TW150-3	Capilar de vidro de borosilicato	WPI	-	Sem filamento
B150-86-10	Capilar de vidro de borosilicato	Instrumento Sutter	-	Com filamento
P-97	Puller microeletrodo	Instrumento Sutter	-	Equipado com filamento caixa 3x3 e câmara ambiental
-	Pressão da bomba de ar de vácuo	Thomas Scientific	7893B05	Cria vácuo para remover líquidos de câmara e sobrepressão para pipetas
MatLab R2008a	Software de análise	MathWorks	-	-
353001	35 milímetros de plástico Pratos Cultura	Falcão	-	-
-	Vidro alto índice de refração	PlanOptik	-	Índice de refração 488 nm = 1,78
Série M	Líquido de elevado índice de refração	Cargille Labs	-	Índice de refração = 1,78
Sylgard 184	Kit de silicone elastômero	Dow Corning	-	-
Glutationa	Tripeptídeo	Merck Química		Radica livrescavenger l
Hialuronidase	Enzima	Sigma	H6254	Tipo V
L-cisteína	Aminoácidos	Fluka	30090	Ativa papaína
Papaína	Enzima	Fluka	76220	De Carica papaya
Trolox ®	Vitamina E solúvel	Sigma	56510	Scavenger de radicais livres
ADVASEP-7	Sulfonado B-Ciclodextrina Derivativos	Sigma	A3723	Reduz FM 1-43 ® fluorescência de fundo
FM 1-43 ®	Corante fluorescente	Invitrogen	T35356	"Embalagem Especial"
Cera pegajosa	Pipeta agente de revestimento	Kerr Corporação	-	Diminui a capacitância pipeta

Tabela 2: soluções fisiológicas utilizadas neste estudo.

Substância	Ca 2 + baixo Ringer	Controle de Ringer	Alto K + Ringer	Solução interna
NaCl	120 mM	120 mM	97,5 mM	-
KCl	2,5 mM	2,5 mM	25 mM	-
MgCl 2	1 mM	1 mM	1 mM	4 mM
CaCl 2	0,5 mM	2,5 mM	2,5 mM	-
HEPES	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
EGTA	0,75 mM	-	-	0,5 mM
Glicose	10 mM	10 mM	-	-
Glutationa	2 mM	2 mM	-	1 mM
* CH 3 CSO 3 S	-	-	-	100 mM
TEACl	-	-	-	10 mM
ATP-Mg	-	-	-	10 mM
GTP-Li	-	-	-	1 mM
Rpep-Rhod **	-	-	-	5 mM
Volume	200 mL	100 mL	5 mL	100 L

* Metanossulfonato Césio.
** Peptídeo de olho de lombo de ligação: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

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Discussão

As vantagens do objectivo do tipo de microscopia TIRF são que 1) ele fornece seccionamento óptico excelente restringindo luz de excitação a uma estreita região dentro do plano focal da objetiva, minimizando assim o fora-de-foco de luz, 2) já que a luz cai exponencialmente com a distância , o movimento em uma direção vertical pode ser monitorado como uma mudança na intensidade de fluorescência, 3) a coleta de luz eficiente através do objectivo de alta abertura numérica ^1,5.

A principal desvantagem da técnica ...

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