Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar

Özet

Neurexins ve neuroligins sinaptik farklılaşma ve iletiminde önemli rolleri yerine membran nöron yapışma proteinleri. Neuroligin, eksik mutantlar C. elegans Osmotik gücü tespit kusurlu, ama onlar da neurexin kodlayan gendeki bir mutasyon içerdiğinde, onlar vahşi tip fenotip kurtarabilirsiniz.

Özet

Neurexins ve neuroligins hücre adezyon moleküllerinin eksitatör ve inhibitör sinaps mevcut ve doğru nöron ağ fonksiyonu ¹ için gereklidir. Bu proteinler, presinaptik ve postsinaptik ^membranlar 2 bulunur . Farelerde yapılan çalışmalar, neurexins ve neurologins ^sinaptik iletim 1 önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir. Son raporlar, insan sinir sisteminin gelişimi sırasında değişmiş nöron bağlantıları otizm spektrum ^{bozuklukları (3)} çok sayıda vaka etyolojisi temel teşkil edebilir göstermiştir .

Caenorhabditis elegans nedeniyle laboratuar deneyleri için sadeliği, deneysel bir araç olarak çalışma sinaptik bileşenlerinin işleyişini kolaylaştırmak için kullanılır, ve, sinir sistemi ve sinaptik kablolama tam olarak karakterize edilmiştir vermiştir olabilir. C elegans nrx-1 ve NLG-1 genleri sırasıyla alfa-neurexin-1 ve neuroligin-1 protein, kodlamak NRXN1 ve NLGN1 genlerin insan için orthologous. Neuroligins neurexins ve organizasyon, insan ve nematod, fonksiyonel alanlar bakımından benzer.

Nematod başkanı amphid, osmotik gücü dahil olmak üzere farklı uyaranlara verilen yanıtlar aracılık nematod, bir duyu organı içerir. Amphid siliyalı dendrit ve tek bir presinaptik terminal akson ⁴ ile 12 duyusal bipolar nöronların yapılır. ASHR ve ashl adlı bu nöronlar, iki yüksek osmotik gücü ⁵ suda çözünür kovucular tespit osmotik duyusal fonksiyon özellikle önemlidir. Bu iki nöron dendritler ağız ucu uzatmak ve davranışsal yanıt ⁶ belirleyen diğer nöronlarla sinaptik bağlantıları aksonlar sinir halkası kadar uzanır.

Yüksek osmotik gücü kaçınma neurexin ve neuroligin etkilerini değerlendirmek için, ⁷ 4M fruktoz halka dayalı bir yöntem kullanarak, nrx-1 ve NLG 1 genlerin arızalı C. elegans mutantlar farklı tepki gösterir. Davranışsal fenotipleri belirli RNAi klonlar ⁸ kullanarak teyit edildi. C. elegans, RNAi tetiklemek için gerekli dsRNA ⁹ beslenme uygulanabilir. Gıda yoluyla dsRNA teslim ilgi böylece genetik bileşenleri ve ağ yollar kimlik sağlayan gen RNAi parazite neden olur.

Protokol

1: Osmotik kaçınma tahlil.

1. OP50 E. içeren taze bir NGM plaka tahlil Hakkında 16-24 saat önce, her genotipin L4 larva aşamasında hayvan almak coli, 20 ° C'de bu andincubate Ertesi gün genç yetişkinler denemeyi başlatmak.
2. Bu tahlil, "körü körüne" yürütmek için tavsiye edilir. Test edilecek her suşu ile plakaları deney tamamlandığında maskesiz olurdu relabelled plakaları kullanılarak tahlil yapılması, ikinci bir deneyci tarafından relabelled olmalıdır.
3. Testin gün,% 1 Kongo Red çözümü ile fruktoz 4M stok solüsyon hazırlanır ve oda sıcaklığında tamamen çözülür. Boya ile çökelti nedeniyle her bir deney için önce çözüm kontrol öneriyoruz.
4. NGM plaka Anülüs halkası (1 cm çap) 15 ul kırmızı 4M fruktoz çözüm, katı orta merkezi özetlenmiştir. Fruktoz çözüm agar içine bekletin ki, bu genellikle 2 ile 5 dakika arasında sürer.
5. Ring içinde her bir suş bireysel genç yetişkin hayvanların yerleştirin ve osmotik bariyer yanıtı belirlemek için, sonraki 10 dakika içinde uygulayın. Arka arkaya altı kez daha halka kaçınarak hayvanlar normal olarak sınıflandırılır; az altı girişimleri halka çıkmadan bu osmotik hassasiyet kusurlu kabul edilir.
   Not: Kontrol suşu her tayininde kullanılması gerekir. Kararlı bir şekilde halka bariyer önlemek N2 genç yetişkin hayvanların pozitif kontrol olarak kullanılır. Daha önce, açlıktan, Dauer larvaları geçen ya da çok kuru plakalar gelen edilmiştir Hayvanlar kullanılmamalıdır. Başlangıçta, kontrol hayvanları tahlil plakalar ve çözümün doğru olup olmadığını teyit etmek için, iki nüsha halinde değerlendirilir olmalıdır.

2: RNAi besleme demonte solucanlar Üretimi.

1. RNAi plakaları: NGM RNAi besleme plakaları litre başına içerir: 17 g agar, 2,5 g pepton, 3.0 g NaCl, 1, 5 mg ^ml -1 kolesterol ml _{H 2} O ve otoklav ile 1 litrelik şişeyi doldurmak . Agar yaklaşık 65 soğuduktan sonra ° C, 1 M KPO _4, pH 6.0, 1 M CaCl 1M MgSO _4, 0,5 ml carbenicillin (50 mg ml ^-1) ve 1, _2, 1 ml 1 ml, 25 ml eklemek ml 1M IPTG. Hazırlanan katı NGM ile başlayan iseniz, mikrodalga katı besiyeri eritmek ve daha sonra serin ve daha sonra da belirttiğim gibi KPO _4, pH 6.0, CaCl _2, MgSO _4, carbenicillin ve IPTG eklemek bankta sıvı NGM.
   
   Her 60 mm Petri kabı içine NGM 10 ml ekleyin. İzin soğutma ve geceleme kullanmadan önce oda sıcaklığında muhafaza plakaları ters. Plakalar 4 ° C'de 4-5 gün boyunca plastik bir torba içinde saklanabilir.
2. Bakteriyel hazırlanması ve endüksiyon: Luria-Bertani (LB) agar plakları (17 g agar, 10 g Tripton, 5 gr üzerine, hedef genin karşılık gelen bir parça içeren L4440 vektör ile dönüştürülmüş E.coli HT115 (de3) suşu kolonileri, ayırma maya özü, litre başına 10 gr NaCl), ampisilin (50 mg / ml) ve tetrasiklin (15 mg / ml) içeren.
   
   Bir bakteri kolonisi Alış ve 50 mikrogram / ml ampisilin ile LB aşılamak ve 6 8 saat süreyle 37 ° sallayarak yetiştirilen ° C; hazırlanan NGM plakaların üzerine tohum, bu kültürün bir damla ve gecede kuluçka olmaktan iyice tabak kuru ( oda sıcaklığında 12 24 h) bakterilerin üremesine izin ve indüksiyon başlamak için. Tetrasiklin, ışığa karşı hassastır ve plakalar arasında RNAi testlerinin değişkenlik etkileyebilir, çünkü karanlık inkübasyon oldu.
   
   RNAi beslenme deneyleri için bir pozitif ve negatif kontrol kullanmak için gerekli. Pozitif kontrol E.coli HT115 hücre unc-22 gen sekansı içeren L4440 vektör ile dönüştürülmüş. Unc-22 gen demonte "seğirmesi fenotip" üretir. Negatif kontrol E.coli HT115 hücre boş L4440 vektör ile dönüştürdü.
3. Solucan kullanımı ve puanlama: bakteri ve inkübe olmadan NGM plakalar üzerine OP50 20 numaralı seribaşı bir NGM plakadan ilk gün, yer L4 aşamada solucanlar ° C 12 saat boyunca (açlık).
   
   Ertesi gün genç oruç tuttuklarını yetişkin çift cinsiyetli, bakterilerin belirli hedef gen RNAi ifade ile seedded bir tabağa aktarın. 40-48 saat 20 ° C F1 döl oluşturmak için bırakın.
   
   Ardından aynı bakteri ile seribaşı başka bir tabağa birkaç F1 erişkin solucanlar yerleştirin. 24-48 saat sonra, seçin ve F2 döl, genç yetişkinler (birkaç yumurta ile tam olarak oluşan çıkıntı vulva) ve fenotipleri için puan izole.
   
   Not: nöronlarda RNAi indüksiyon RNAi C elegans sinir sistemi refrakter özellikleri nedeniyle bazı sınırlamalar var. Nöron bu verimsizlik sorunları aşmak için rrf-3 suşu, nöronlar ¹⁰ RNAi etkileri aşırı duyarlı bir arka plan kullanılması tavsiye edilir. Deneyimlerimizden hiçbir differences genler için Bristol N2 ve rrf-3 suşları arasında bulundu ve fenotip incelendi.

3: Suşlarının kullanılır.

C. Tablo 1'de bu çalışmada kullanılan elegans suşları gösterilmiştir. Mutant-çapraz N2 karşı vahşi tip mutagenez protokolü sırasında oluşan olabilirdi istenmeyen rastlantısal mutasyonlar kaldırmak için en az dört kez.

OP50 E. coli suşu, plazmid nrx-1 taşıyan pL4440 (JA: C29A12.5). Caenorhabditis Genetik Merkezi, Minnesota Üniversitesi, ABD E.coli HT115 (de3) suppliied ve NLG-1 (JA: C40C9.5 Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de biología del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, İspanya) gen parçaları temin edilmiştir.

4: Temsilcilik sonuçları.

Örnek sonuçlar Şekil 1 ve 2 'de temsil ediliyor. On her bir suş hayvanlar ve en az üç kopya deneyler yapılmıştır.

Şekil 1. Osmotik kaçınma davranışı deneyler.
Kontrol suşları ve nrx-1 V eksik mutantworms osmotik bir bariyer (4M fruktoz) karşılaştığınızda geriye doğru ters cevap (ok1649 ve tm1961). NLG-1 (ok259 ve tm474) X mutantlar Bu bariyer algılamak için başarısız olur. VX ve CRR23 (tm1961; ok259); NLG-1 ve nrx-1, suşları CRR21 (ok259 ok1649) eksik Çift mutantlar VX vahşi tip fenotipi iyileşti. * T-öğrenci testi ile her suşu Bristol N2 yabani tip tepki, t-öğrenci testi ile anlamlı bir fark (p ≤ 0.001), gösterir

Şekil 2. RNAi besleyerek demonte solucanlar deneyler.
E.coli HT115 (de3) boş pL4440 vektör ile dönüştürülmüş veya nrx-1 veya NLG-1 ile beslenen farklı solucan suşları için kullanılan hedef genleri ile ilgili bir parçası içeren . * Boş pL4440 vektör ile beslenen N2 suşu ile karşılaştırma pL4440 vektör NLG-1 geni hedefleyen bir parçası taşıyan bakteri ile beslenen N2 suşu yanıt, t-öğrenci testi ile anlamlı bir fark (p ≤ 0.001), gösterir .

Tartışmalar

Neurexins ve neuroligins sinaptik iletim ¹¹ ve sinaptik bağlantıları ¹² farklılaşma önemli rolleri yerine. Her iki molekülleri için aday ^genler, otizm 13,14 olarak tespit edilmiştir.

Bu video C. osmotik kaçınma yanıtını etkileyen genlerin etkisini araştırmak için bize sağlayan basit bir yöntem elegans. Neuroligin eksik mutantlar osmotik gücü tespit kusurlu ama neurexin eksikliği mutantlar 4M fruktoz çözümü kaçınar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gerginlik	Gen	Allel	Kaynak
Bristol N2	-	-	aCGC
VC228	NLG-1	ok259	CGC
FX00474	NLG-1	tm474	bNBP-JAPONYA
VC1416	nrx-1	ok1649	CGC
FX1961	nrx-1	tm1961	NBP-JAPONYA
NL2099	rrf-3	pk1436	CGC
CRR21	nrx-1; NLG-1	ok1649; ok259	Bu çalışma
CRR22	nrx-1; NLG-1	tm1961; ok259	Bu çalışma