Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Özet

Gübreleme için Prosedürü Xenopus oositleri Ana aktarma yöntemi.

Özet

Erken gelişim omurgalı maternal miras moleküllerin katkısının incelenmesi genellikle etkisi anne-mutant hayvanlar üretmek için gerekli zaman ve masraf tarafından engellenmektedir. Ayrıca, pek çok teknik Xenopus ve zebrafish gibi organizmaların gen fonksiyonu eksprese veya etkisizleştirmek için yeterince Wnt sinyal gibi kritik anne sinyalizasyon yolaklar hedef başarısız. Xenopus, kültürlü oosit gen işlevi manipüle ve daha sonra onları gübreleme, bu sorunların bir ölçüde iyileştirebilir . Oosit donör yumurtalık dokusu elle defolliculated istediğiniz gibi enjekte veya kültür tedavi ve sonra olgunlaşma ikna etmek için progesteron ile uyarılır. Sonra, ev sahibi fallop borusunda transloke ve modifikasyon ve gübreleme için gerekli jöle kat kazanmak olacak bunun üzerine oosit yumurtladığımı ev sahibi kadın kurbağa vücut boşluğuna tanıtıldı. Oluşan embriyolar daha sonra istenilen aşamaya kaldırdı ve hiçbir deneysel tedirginlikler etkileri için analiz edilebilir. Bu konak-devret yöntemi erken gelişiminin temel mekanizmaları ortaya çıkarılması son derece etkili ve herhangi bir diğer omurgalı model organizmada mevcut değil deneysel olanakları geniş bir yelpazede sağlar.

Protokol

1. Yumurtalık Doku Cerrahi Kaldırma

1. Deney büyüklüğüne bağlı olarak 400-800 ml arasında, oosit kültür ortamı yeni bir parti (Malzeme OCM) hazırlayın. Fenol kırmızısı, koyu kırmızı bir renk (5N NaOH altı ya da çok küçük damla) olana kadar, 7,6-7,8 pH ayarlayın. PH pH elektrodu medya kontamine yılından bu yana ayrı bir tüp içinde kontrol etmek için küçük bir miktarını dökün. OCM 18 ° C'de saklanır ve bir hafta içinde kullanılmalıdır.
2. ~ 2L tamponlu anestezik solüsyonu (Malzemeleri) 3-5 kadın ve bir yer seçin. Biz gün ya da ameliyat öncesinde beslenen kurbağa kullanarak kaçınmaya çalışın. Kurbağa anestezi yenik düşen iken,% 70 EtOH, cerrahi alan dezenfekte ve cerrahi aletler hazırlamak.
3. 250 sıcak bir boncuk sterilizatör 20 saniyelik daldırma cerrahi aletler sterilize ° C. Aşağıdaki araçların yandan edilmelidir: neşter sapı (# 3) ve blade (# 10 veya 11), Dumont forseps, Bonn iris makası (eğri veya düz), Halsey veya Olsen Hegar mikro iğne tutucu ve dikişlerle birkaç çift. Sterilize aletler steril bir Petri kabı yerleştirin veya steril tutmak için dikiş paketi iç. Iğne iğne tutucu başlamadan önce istenilen açıda tutun. Kolu anahtarlama aletleri olmadan sütür kırpmak için kullanılabilir makas bıçakları, içerdiğinden Olsen-Hegar iğnelikler tercih ediyor.
4. 10 dakika sonra cerrahi anestezi düzlemde elde edildiğini kontrol edin. Anestezi kurbağa hareket duracak ve ayak tutam yanıt vermez veya devredildi. Anestezi, işlemleri gerçekleştirmek için yeterli zaman daha fazla 15 dakika sürmelidir. Don uygun cerrahi giydirmek. Bu kişisel tercih ve kurumsal hayvan bakımı kurallarına bağlı olarak temiz eldiven (lateks), laboratuar kat, cerrahi maske, içerebilir.
5. Aseptik teknik Not: Kurbağa cilt salgıları aseptik teknik mümkün olduğunca uyulmalıdır rağmen, genellikle ameliyat sırasında kontaminasyon insidansını azaltmak antimikrobiyal peptidler içerir. Cerrahi örtüler kullanılabilir, ancak kurumsal IACUCs tarafından gerekli olmayabilir ve pek yarar sağlamaz. Elinde steril aletleri, dikiş materyali veya kesi sitesi ipuçları dokunmatik Genellikle "ucu tekniği". Araçlar (boncuk sterilizatör) cilt aşağıdaki kesi tekrar steril edilebilir ve steril bir alana yerleştirerek araçların (örneğin, bir Petri kabında ya da dikiş paketi gibi) benchtop muhafaza edilmelidir. Kurumsal gereksinimleri önemli ölçüde farklı olabilir, bu nedenle kurumların yönergeleri takip edin ve performans ameliyatları öncesinde uygun eğitim alma.
6. Anestezik kurbağa ve bir nemli bir cerrahi silin sırt yatma yeri çıkarın. Not. Seyreltilmiş povidin iyot (1:20) veya klorheksidin (% 0.75) durulama cilt temizlenir. Ancak, bu amfibiyenlerin hassas cildine zarar verecek, ticari cerrahi scrubs, sabun ve% 70 izopropil alkol kaçının.
7. Orta hatta lateral karın, alt kısmında ciltte kesi ya da küçük bir neşter iris makası kullanarak, küçük bir (1,5 cm 1). Alternatif tarafta aynı kurbağa sonraki kesiler yapılmalıdır, birbirinden aralıklı. Kesikler ya paralel ya da dik orta hatta yapılabilir.
8. Iki aşamada deri ve karın kas kesiler olun. Cilt kestikten sonra, kas tabakası ve forseps ile çevreleyen beyaz renkli fasya kaldırın ve yükseltilmiş bir kas kesi yapmak. Makas kullanın ve deneyin bir hızla kesim temiz yara kenarları bırakarak vücut boşluğunda maruz yapmak, düz kesmek. Sadece fasya kesilirse, geri çekilecektir ve dikilmesi daha zor hale getirecek. Kas kaldırma, yanlışlıkla herhangi bir iç organların yaralama önlemeye yardımcı olacaktır. Ayrıca, kas tabakaları içinde görünen herhangi bir lenf kalpleri ve kan damarları aracılığıyla kesme önlemek için deneyin. Bu over kolayca çekilebilir böylece kesi makas ile uzatmak.
9. Kesi yapıldıktan sonra Over açıkça görünür olmalıdır. Yumurtalık temin etmek, forseps ile kavramak ve yumurtalık dokusu dışa. Istenilen miktarda doku kaldırılır ve vücut duvarı düzeyinde kesilmiş. Bu, enfeksiyon veya başka komplikasyonlara bir kaynak olabilir, coelomic boşluğuna geri doku şeyler yapmayın.
10. Diseksiyon mikroskobu altında küçük bir parça yumurtalık hemen gözlemlemek ve onların kalitesini test etmek için bir kaç oosit defolliculate. Sağlam olmalı ve eşit boyda ve renklenmesi. Eğer kabul edilebilir, yumurtalık dokusunun istenilen miktarda kaldırmak ve kesi sütür. 90 mm Petri kabı dolduracak kadar genellikle çoğu deneyler için yeterli. Oosit kalitesi şüpheli ise, kurbağa sütür ve farklı bir kadın ile işlemi tekrarlayın.
11. Ilk kas ve fasya tabakası dikilmesi kesi kapatın. N takın fasya tabakası geçmesine de dikkat ederek, bir kaç milimetre kesi lateral eedle. Sütürleri sadece kas dokusu gözyaşı ve gevşek gelebilir. Forseps kesi karşı tarafında aşağıda iğneyi yardımcı olmak için kullanın. Özen aracılığıyla tüm yol çekmek için değil, vücut dışından iğne yeniden kavramak ve ile dikiş kuyruk kalır ya da birkaç santim kadar çekin ve bırakın.
12. Dikiş basit bir kesintiye desen yara kapatın. Biz cerrah kare knot (resif knot) yapmak için temel bir araç kravat kullanırlar. Döngü iğne tutucu çevresinde dikiş, kuyruk uzun sonuna kavramak ve döngü içinde kendinize doğru çekin ve sıkın. Döngü ve tekrar üzerinden çekin, bu kez sizden uzağa iğne tutucu çekin. Üçüncü bir atış (ilk olarak aynı yönde), ek güvenlik için kullanılabilir. Dikiş, kesin, kısa kuyruk bırakarak ve birkaç milimetre ötede başka bir dikiş kas yapmak. İki sütür küçük sütürler için yeterli; üç büyük olanlar için. Deri tabakası için tekrarlayın. Temel sütür tekniği YouTube'da video gösterileri mevcuttur "alet kravat" için arama; temel tekniği aynı olmasına rağmen, pek çok seçim için vardır.
13. Kadın deiyonize su ile durulayın ve serin (18 ° C) su ile dolu bir kurtarma kova onun yerine. Laboratuarda iken, kurbağa kloraminler kaldırmak için Amquel ile tedavi musluk suyu tutulur. Her birkaç dakika hafifçe su kurbağa kaldırın ve anestezi kurtarma göstergesidir gulping ya da şişkin göz hareketleri, bakın.
14. Not: kadın operasyonların bir sayıdan sonra iyi oosit üretmek için devam edecek olsa da Survival cerrahi, yumurtalık dokusu elde etmek için kesinlikle gerekli değil. Hayatta kalma ameliyat yapılması da kullanılan hayvanların sayıları aşağı kesecek. Omurgalı hayatta kalma cerrahi yöntemleri, post-op bakım ve izleme hayvan bakım ünitesi ve bir birey izin ameliyatları sayısı için yönergeleri izleyin emin olun.

2. Kültürleme ve Defolliculating Oosit

1. Ameliyat bittikten hemen sonra, 90 mm ​​çanak başına 5-6 adet küçük parçalara (~ 2 cm ²⁾ ve taze OCM saklamak, yumurtalık alt bölümlere. Bireysel yumurtalık loblar, açık kesilerek dışarı basık ve kare şeklinde parçalara ayrılır. Bu temiz OCM durulanır ve kültür için yemekler konur. Düzleştirme ve yumurtalık kadar bölünebilen kültür ömrünü uzatmak ve defolliculation kolaylaştırır.
2. OCM küçük bir yemek için bir lob hareket ettirin ve elle 300-500 oosit defolliculate. Transferi oosit, yangın cilalanmış steril bir pipet kullanarak. Biz pamuk takılı çeşitli kültürlerin kontaminasyonu en aza indirmek için gerekli olduğunu bulduk. 18 oosit Mağaza ° C (orta yemekleri (Falcon 1007)) 100-150 grupları 8 mL OCM. Uygulama ile, 1-2 saat içinde yeterli sayıda oosit defolliculate mümkün olmalıdır. Fertilizable değildir beri Collagenased oosit konak transferi için uygun değildir.
3. Yöntemi Defolliculating. Smith ve ark. Açıklanan temel yöntem aşağıdaki saatçiler 'forsepsi (İnce Bilim Araçları, 5s Dumont # 4s veya #), (1991) defolliculate. Forseps bir çift (baskın elinde) kullanarak, tam yetiştirilen sahne VI oosit folikül yumurtalık (sap) eklenir yere yakın çevresindeki teka bağ doku tabakası kavramak. Forseps diğer çifti ile ilk çifti bitişik yumurtalık kavramak. Oosit üzerinden çekerek hafifçe folikül katmanı açmak gözyaşı. Doku yavaşça dışarı oosit tease. Başarıyla defolliculated oositlerin oosit sadece folikül katmanı çıkarmadan çıkardı ve görünür kan damarları yoksun olacak daha floppier.
4. Not: karşılamak için ipuçları, forseps ipuçları için yeterli ancak çok hafif bir basınç korumak için şarttır. Çok sıkı sürükleyici yeni başlayanlar arasında ortak ve sağlam folikül çekti oosit neden olacaktır. Defolliculating forseps iyi bir çifti için özel olarak tutun. Ipuçları tam olarak yerine getirmeli ve Xenopus embriyolar (Şekil 1) eksplantlar yapmak için forseps biraz blunter olmalıdır .
5. Progesteron ve deney iptal ile yaklaşık 20 olgunlaşma oranı düşükse rutin olgun testi (oda sıcaklığında 6-7 saat sonra <% 50).
6. Bu noktada, oosit, oligo, morfolino veya mRNA mikroenjeksiyon gibi manipüle edip istediğiniz gibi kültür olabilir. Enjeksiyon prosedürleri laboratuar başına değişir, bu nedenle burada bu tarif olmaz. Oosit OCM bir hafta kadar korunur, ancak izolasyon 96 saat içinde transferi için bunları kullanmak en iyisidir, böylece genel sağlık düşüşler olabilir.
7. Hayati boyalar sınırlamalar nedeniyle sadece beş-altı grupları (kontrol dahil), tek bir kadın transfer edilebilir olduğunu aklınızda tutun, buna göre deneyler planı.

"> 3 Oosit Olgunlaşma ve Aday Ana Dişiler uyarılması

1. Oligo tükenmesi bir kurtarma yapmak durumunda oligo ~ 24-48 saat sonra mRNA (genellikle 50-300 pg RNA) enjekte edilir. Oligos bu zamana kadar bozulmuş olacak ve enjekte edilen RNA zarar vermemelidir.
2. Akşam transferi gerçekleştirmeden önce, orta yemekler 8 mL OCM (son progesteron konsantrasyonu ~ 2 mcM) oosit progesteron çalışma çözümü (EtOH 1mm) 16 mcL ekleyin. 18 az 10-12 saat inkübe ° C oosit olgunlaşması için izin vermek.
3. HCG kurbağa başına 1000 adet ile 3-5 kadınlarda yumurtlama neden enjekte edilir. Bizim deneyleri oosit olgunlaşma ve aynı zamanda etrafında hCG enjeksiyonu yapılır (örneğin, 22:00 -10 PM) ev sahipliği içine implantasyon öncesinde yaklaşık 12 saat, daha iyi çalışmak için görünüyor. RT veya 18 ° C gecede kadın bırakın.

4. Hazırlık ve Oosit Vital Boya Boyama

1. Transfer sabahı, ~ 45-60 'kurmak ve yordamı gerçekleştirmek için izin verir. Bu noktada, olgun oosit, mRNA demonte veya protein ifadesi etkinliğini daha sonraki analiz için dondurulur. Ayrıca, oosit enfekte olup olmadığını kontrol edin ve iyi bir olgunlaşma oranı (% 50) olduğunu. Enfekte oosit döller. Hayati boyalar (Malzeme) çözülme ve 5 dakika maksimum hızda dönmeye.
2. 15 'sallanan oosit yemekleri ve inkübe uygun vital boya (ler) 80 mcL ekleyerek Rengi farklı deneysel gruplar. Bu süre zarfında, ev sahibi kadın ve anestezi başlayın. Yavaş yavaş normal veya hafif bir sıkma ile bol yumurta üreten bir yumurtlayarak bir kurbağa seçin. Konak Yumurta iyi kalite olmalıdır. Dizeleri, yumurta veya ezilmiş yumurta döşeme kadın kaçının.
3. Renkli yumurta, taze OCM büyük bir çanak, yıkama ve transfer etmek için önce onları bir kenara kısaca girdap aktarın.
4. Oosit nakli için bir oosit (~ 1.5 mm) karşılamak için yetecek geniş delikli steril bir Pasteur pipeti hazırlayın. Elmas kalemle pipet Puan ve temiz kırmak. Yangın cilası, kenarları düzgün kadar özen açılış kapalı eritmek için değil.

5. Oosit Nakli Sahne

1. Oosit nakli, Bölüm I açıklandığı gibi aynı cerrahi işlemler, yumurtalık kaldırarak yerine, manipüle oosit bir pipet ile vücut boşluğuna tanıtıldı olmasına rağmen kullanır. İdeal olarak, transfer işlemi mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirilir ve insizyon boyutu mümkün olduğunca küçük tutulmalıdır.
2. Ev sahibi kadın Anesthesize ve cerrahi aletler, I. Bölüm I. kesi daha küçük olabilir açıklandığı gibi olun ve kesi Bölüm açıklanan hazırlamak, ancak transfer pipeti (Şekil 2A) delik sığacak kadar büyük olması gerekir.
3. Oosit nakli için, kavramak ve yükseltmek, kas ve fasya flep ve forseps ile yukarıda hazırlanan Pasteur pipeti kullanarak deneysel oosit tanıtmak. Swirl çanak oositlerin merkezi haline onları toplamak ve mümkün olduğunca çok emmek. Tanıtılıyor aşırı sıvı önlemek ve kesi içine pipet ucu yerleştirin ve yavaş yavaş oosit vücut boşluğuna (Şekil 2B) damlama izin oosit pipetin ucunu yerleşmelerine izin verir. Her oosit transfer edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Dikilmesi başladı, ya da oosit kesi dökülebilir kadar, herhangi bir zamanda kas tabakası bırakmayın.
4. Oosit transfer edildikten sonra, kesi her iki taraf forseps ile kavramak ve bunları bir araya getirmek, oosit vücut boşluğuna yerleşmelerine izin verme. Açıklandığı gibi, ilk düğüm (Şekil 2C) bağlıdır kadar kas ve fasya yukarı doğru gerilimi tutmak için özen dikilmesi başlayın. Bu atılmaktan oosit tutacak ve kesi kenarları eşit olarak iyileşmek için izin verecek. Kas / fasya tabakası başka bir sütür ekleyin ve sonra cilt sütür.
5. Kadın deiyonize su ile durulayın ve soğutmalı (18 ° C) Amquel arıtılmış su ile dolu bir kurtarma kovası onu yer. Yukarıdaki gibi anestezi onu kurtarma Monitör. O ameliyattan sonra normal yumurtalarını başlamalıdır.
6. Testisler normal prosedürleri kullanarak bir erkek kurbağa alın. Kadar gerekli OCM veya L15 testisler saklayın. Transferi deneyler gübreleme zaman taze testis tercih ediyor.

6. Oosit, Kurtarma ve in vitro Fertilizasyon

1. Periton kirpikler vücut boşluğunda ön siyon hatası açıklıklar transfer yumurta (ve konağın normal coelomic yumurta) sürücü olacaktır. Renkli yumurtalar normal sıkarak transferi 2-3 saat sonra başlayan geri kazanılabilir. Kadın döşeme durana kadar Yumurta her yarım saatte bir ya da elde edilebilir.
2. Gübreleme de bir SPE4 dakika için rm süspansiyon (~ 4 ml 1x MMR). Sel ve 0.1x MMR ile yoğun durulama. Yumurta normalde aktif hale getirmelisiniz ve tutunmaya ~ 1.5-2 saat gübreleme sonra başlayacak. Aktarılan yumurta biraz daha sonra ev sahibi yumurta daha tutunmaya sık sık olacak.
3. Ayrı kaplarına normal ve sıralama embriyolar gibi sistein ile jöle kat çıkarın. Bu deney ihtiyaçlarına bağlı olarak, herhangi bir aşamada yapılabilir. 4-hücreli sahne etrafında çeşitli renk ve geç blastula aşamalarında en zor tanımlamak için genellikle kolay. Temiz 0.1x MMR (orta çanak başına <50), düşük yoğunluklu Kültür yumurta. Bu noktadan sonra, embriyolar tedavi ve normalde manipüle edilebilir.
4. Komplikasyonlar için önümüzdeki birkaç gün içinde hayvan tesis etmek ve izlemek için kurbağa dönün.
5. Alternatif döllenme yöntemi; yüksek tuz tamponu yumurtlama
   1. Kurbağa anestezi kurtarıldı sonra ~ 1L yüksek tuz MMR (1.2x) içine onu yer. Kadın, yaklaşık 4-6 saat boyunca tampon içine yumurtalarını bırakmak için izin verin. 1.2x MMR drenaj ve temiz bir tabak içine renkli yumurta sıralamak, kalan yumurta sıkmak; mümkün olan tüm sıvı çıkarın.
   2. 0.3x MMR ile iyice yıkayın ve yumurta (10 dakika) aktive kadar 0.3x MMR / sperm süspansiyonu minimal volüm döller. Sel yukarıdaki gibi 0.1x MMR ve kültürü ile. Birçok yumurta aynı sahneyi ya da yumurta manuel ifade donör oosit zarar ihtiyaç vardır, bu seçenek kullanışlıdır.

Tartışmalar

Başarılı bir transfer, gübreleme ve oosit>% 50 (Şekil 3) normal bölünme neden olacaktır. Genellikle% 30-60 arasında transfer edilen oosit neurula aşamaları geçmiş hayatta kalacaktır. Biz genellikle 75-150 çeşitli analiz için yeterli embriyolar verecektir deney grubu başına oosit, (in situ, RT-PCR) gibi fenotip görselleştirme aktarın. Önemli ölçüde daha fazla oosit implantasyon büyük ölçüde verim artışı görünmüyor. Ayrıca, grup başına en az 30 oosit en azından bazı gastrulasyo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
% 70 Leibovitz L-15 orta (L-glutamin içeren)	(Invitrogen 11.415-064)
0.4 mg / ml Sığır serum albumini (BSA, fraksiyon V)	(Sigma A-9418-50g)
1x Penisilin-Streptomisin	(Sigma P-0781)
5N NaOH ile pH 7,6-7,8 ayarlayın
18 ° C'de taze haftalık, mağaza olun

1M NaCl

20 mM KCl

20 mM CaCl 2

10 mM MgCl 2

150 mM HEPES

pH 7,6-7,8 uyum

Mağaza, 4 ° C

1 g / L 3-aminobenzoik asit Etil Ester (MS222)	(Sigma A-5040)
0.7 g / L sodyum bikarbonat
Amquel arıtılmış su içinde çözülür
Taze haftalık olun

% 100 Etanol 10 mM Progesteron (Sigma P-0130)

500x bir hisse senedi için% 100 EtOH 1 mM sulandırınız / çalışma çözümü

-20 ° C'de muhafaza

Mavi:% 0.1 Nil Mavi.	(121.479 Aldrich-5G),
Kırmızı:% 0.25 Sabit Kırmızı	(Sigma N-6634),
Brown:% 1 Bismarck Brown	(Sigma B-2759),
Yeşil (80 ul mavi + 80 ul kahverengi),
Leylak (80 mavi + 80 ul ul kırmızı).
Altıncı renk, Orange (80 ul kırmızı + 80 ul kahverengi) de kullanılabilir, ancak kahverengi ayırt etmek genellikle zordur.