Оплодотворение Xenopus ооцитов Использованием метода передачи хост

Резюме

Процедура для удобрения Xenopus ооцитов По методу передачи хосту.

Аннотация

Изучение вклада матерински унаследовал молекул позвоночных раннего развития часто препятствует времени и средств, необходимых для создания материнского эффекта мутанта животных. Кроме того, многие методы гиперэкспрессией или подавляют функции генов в организмах, таких как Xenopus и данио не в состоянии достаточно критическое целевой материнской сигнальных путей, таких как Wnt сигнализации. В Xenopus, манипулируя функции генов в культуре ооцитов, а затем удобрения них могут улучшить эти проблемы в некоторой степени. Ооциты вручную defolliculated из донорской ткани яичника, вводят или обработаны в культуре по своему желанию, а затем стимулировали прогестерон, чтобы вызвать созревание. Далее ооциты вводят в полость тела овуляция хост женщины лягушки, после чего они будут перемещаться через яйцевод хозяина и приобрести модификации и желе пальто необходимые для оплодотворения. В результате эмбрионов может быть увеличена до желаемой сцены и проанализированы последствия любых экспериментальных возмущений. Этот узел передачи метод был очень эффективен при выявлении основных механизмов раннего развития и позволяет широкий спектр экспериментальных возможностей не доступны в любой другой организм модель позвоночных.

протокол

1. Хирургическое удаление яичников тканей

1. Подготовить новую партию ооцитов культуральной среде (ОСМ; материалы), между 400-800 мл в зависимости от размера эксперимента. Отрегулируйте рН до 7.6-7.8, пока фенола красного превращается в темный цвет красный (шесть или около того капельки 5N NaOH). Вылейте небольшое количество проверить рН в отдельную трубку с рН электрод может загрязнять СМИ. OCM должны храниться при температуре 18 ° C и использовать в течение недели.
2. Выберите 3-5 самок и поместите один в ~ 2L буфер анестезии раствором (материалов). Мы стараемся, чтобы избежать использования лягушек, которые питались в день или до операции. В то время как лягушка поддаваясь анестезии, дезинфекции хирургических области с 70% этанола и подготовить хирургических инструментов.
3. Стерилизовать хирургических инструментов по 20-секундный погружением в горячий шарик стерилизаторе при температуре 250 ° C. Следующие документы должны быть под рукой: скальпель ручкой (# 3) и лезвие (# 10 или 11), несколько пар Дюмон щипцы, Бонн диафрагмы ножницы (изогнутые или прямые), Хэлси или Олсен-Хегар микро иглодержателя, и швы. Место стерилизовать инструменты на стерильную чашку Петри или на внутренней стороне шва пакета держать стерильным. Возьмите иглу в иглодержатель в нужной ориентации перед началом. Мы предпочитаем Олсен-Хегар держателей иглу с ручкой содержит ножниц, которые могут быть использованы для отделки швов без переключения инструментов.
4. Через 10 минут, проверьте, что хирургическое плоскости анестезия была достигнута. Наркозом лягушек будут прекратить движение и не будет реагировать на носок щепотку или быть перевернута. Анестезия должна длиться 15 минут, что более чем достаточно времени для выполнения операций. Дон соответствующей хирургической одежды. Это может включать чистые перчатки (без латекса), халаты и хирургические маски, в зависимости от личных предпочтений и институциональные руководящие принципы ухода за животными.
5. Обратите внимание на асептики: выделениями кожи лягушки содержат антимикробные пептиды, что в целом снизить частоту заражения во время операции, хотя асептики должно последовать как можно больше. Хирургическое шторы могут быть использованы, но не может требовать институциональных IACUCs и не может обеспечить большую пользу. Вообще "наконечник техника", используются, где руки делают сенсорным стерильной кончики инструменты, шовный материал или разреза. Инструменты могут быть resterilized (в стерилизатор шарик) после разреза кожи и стерильной зоне должна поддерживаться на настольный для размещения инструментов (например, чашку Петри или шов пакета). Организационные требования могут значительно отличаться, поэтому, пожалуйста, следовать рекомендациям вашего учреждения и получать соответствующие инструкции перед выполнением операции.
6. Удалить лягушка из анестезии и место в спинной лежачее положение на влажную хирургические салфетки. Примечание. Кожу можно очищать промывкой в ​​разбавленных йода povidine (1:20) или раствором хлоргексидина (0,75%). Тем не менее, избежать коммерческих хирургических скрабы, мыла и 70% изопропиловый спирт, так как они могут повредить нежную кожу земноводных.
7. Использование скальпеля или небольшой радужная оболочка глаза ножницами, сделать небольшой (1 - 1,5 см) разрез в коже в нижней части живота, сбоку от средней линии. Последующие разрезы на той же лягушки должны выполняться поочередно по обеим сторонам, хорошо разделены друг от друга. Разрезы могут быть сделаны либо параллельно, либо перпендикулярно средней линии.
8. Сделать кожу и мышцы брюшного разреза в два этапа. После разрезания кожи, поднять мышечный слой и окружающие белого цвета фасции пинцетом и сделать разрез в поднятом мышцы. Используйте ножницы и вырезать прямо вниз, пытаются сделать одним быстрым сократить раскрыть полость тела оставляя чистые края раны. Если только фасции режется, он немного опустится и составит ушивание сложнее. Подъемные мышц поможет избежать случайного ранения каких-либо внутренних органов. Кроме того, постарайтесь избежать сокращения через любые видимые лимфатические сердца или кровеносных сосудов в мышцах слоев. Расширение длины с ножницами разрез, чтобы яичник может быть легко до конца.
9. Яичников должен быть отчетливо виден один раз надрез. Закупить яичников, захватите с пинцетом и воплощать яичников ткани. Необходимое количество ткани удаляются и поправили с на уровне стенки тела. Не наполняйте ткани обратно в целомической полости, так как это может быть источником инфекции и других осложнений.
10. Непосредственно наблюдать небольшой кусочек яичника под микроскопом и рассекает defolliculate несколько яйцеклеток, чтобы проверить их качество. Они должны быть твердыми и одинакового размера и окраски. Если они приемлемы, удалить нужное количество ткани яичников и шовные разрез. Достаточно, чтобы заполнить 90 мм чашки Петри, как правило, достаточно для большинства экспериментов. Если ооциты сомнительного качества, шовный лягушки и повторите с другой женщиной.
11. Закрыть разрез по ушивание мышц и фасции слоем в первую очередь. Вставьте н eedle несколько миллиметров сбоку надрез, убедившись, что пройти через фасции слоя. Швы только через мышцы может порваться ткани и выдернут. Используйте пинцет, чтобы помочь вставить иглу снизу на противоположной стороне разреза. Выпуск и снова схватить иглу из вне тела и вытащить через шов до нескольких дюймов или около хвоста остается, заботясь, чтобы не тянуть его весь путь до конца.
12. Закрыть рану простой прервал структуры наложения швов. Мы используем основные галстук инструмент, чтобы сделать хирурга квадратных узлов (риф узлов). Цикл длинный конец шва вокруг иглодержателя, держитесь за хвост и тянуть его через петлю по отношению к вам и затянуть. Петля и тянуть через раз, на этот раз тянуть иглодержателя от вас. Третий бросок может быть использована для дополнительной безопасности (в том же направлении, что и первый). Обрезать нить, оставив короткий хвост, а делают другое шва в мышцах несколько миллиметров прочь. Два швов достаточно для небольших швов, три на более крупные. Повторите эти действия для скин-слоя. Видео демонстрации базовой техникой наложения швов доступны на YouTube - Поиск "инструмент галстука"; Есть довольно много на выбор, хотя основная техника такая же.
13. Смойте женщина с деионизированной водой и поставьте ее в восстановлении ведро с прохладной (18 ° С) водой. Находясь в лаборатории, лягушки хранятся в водопроводной воде, получавших Amquel для удаления хлораминов. Каждые несколько минут, осторожно поднимите лягушки из воды и искать глотая или глаза выпуклые движений, что свидетельствует о восстановление после наркоза.
14. Примечание: Выживание хирургии не является строго необходимым для получения ткани яичника, хотя женщины будут продолжать производить хорошие ооциты после ряда операций. Выполнение выживания операции будут также сократить количество животных используется. Будьте уверены, чтобы следовать рекомендациям вашего ухода за животными устройства на позвоночных выживания хирургические методы, послеоперационной помощи и мониторинга, а также количество разрешенных операций на человека.

2. Культивирование и Defolliculating ооцитов

1. Сразу после операции закончены, подразделяют яичников на мелкие кусочки (~ 2 см ²⁾ и хранить в свежем OCM, используя 5-6 штук в 90 мм блюдо. Индивидуальные долей яичника разрезать, расплющенной и разрезать на квадратные кусочки. Эти промывают в чистой OCM и поместили в чашки для культуры. Сведение и разделения яичников расширит свою жизнь в культуре, и сделала defolliculation легче.
2. Перемещение доли в блюдце с OCM и вручную defolliculate 300-500 ооцитов. Передача ооцитов использованием стерильной, огневой полировкой пипетки. Мы обнаружили, что использование хлопка подключен разнообразие имеет важное значение для сведения к минимуму загрязнение культур. Магазин ооцитов при 18 ° С в 8 мл OCM (в средних блюд (Falcon 1007)) в группах по 100-150. С практикой, вы должны быть в состоянии defolliculate достаточно ооцитов в течение 1-2 часов. Collagenased ооцитов не подходят для принимающих передачи, так как они не оплодотворению.
3. Defolliculating метод. Мы defolliculate использованием часовщиков щипцы (Дюмон # 4s или # 5s, Изысканные инструменты наук), следующие основные методы, описанные в Smith и соавт., (1991). Использование одной пары щипцов (в своей доминирующей рукой), держитесь теки слоя соединительной ткани, окружающей полностью выращенных этап VI ооцитов рядом, где фолликула прикрепляется к яичников (ножки). С другой паре щипцов, держитесь яичников, прилегающих к первой паре. Слегка разорвать фолликул слой, потянув через яйцеклетки. Аккуратно дразнить яйцеклетки из ткани. Успешно defolliculated ооциты floppier чем ооциты просто снял, не снимая слой фолликула и будет лишен видимых кровеносных сосудов.
4. Примечание: Очень важно поддерживать очень легкое давление на кончики пинцета, едва хватает на подсказки, чтобы встретиться. Захватывающий слишком сильно это распространено среди начинающих, так и приведет к ооцитов тянет прочь с фолликула без изменений. Имейте хорошую пару щипцов исключительно для defolliculating. Советы должны отвечать точно и должна быть немного резче, чем щипцы для изготовления эксплантов из эмбрионов Xenopus (рис. 1).
5. Мы регулярно тест зрелых около 20 с прогестероном и прервать эксперимент, если созревания плохой (<50% после 6-7 часов при комнатной температуре).
6. На данный момент, ооциты можно манипулировать и культивировали, как желаемое, такие, как микроинъекции олиго, морфолино или мРНК. Инъекция процедуры варьироваться в зависимости от лаборатории, поэтому мы не будем описывать их здесь. Ооциты могут быть сохранены до недели в ОСМ, но в целом здоровье снижается, так что лучше использовать их для передачи в течение 96 часов изоляции.
7. Имейте в виду, что только пять-шесть групп (включая управление) могут быть перенесены на одиноких женщин, из-за ограничений по жизненно важным красители, так что планируйте ваши эксперименты соответственно.

"> 3. Созревания яйцеклетки и стимулирование перспективных Женщины Хост

1. При выполнении спасательных истощения олиго, ввести ваш мРНК (обычно 50-300 мкг РНК) ~ 24-48 часов после олиго. Олигонуклеотидов будет деградировали к этому времени и не должны влиять вводили РНК.
2. Вечером перед выполнением передачи, добавить 16 мкл рабочего раствора прогестерона (1 мм в этаноле), чтобы ооциты в 8 мл OCM в среде блюда (конечная концентрация прогестерона составляет ~ 2 мкм). Инкубируйте 10-12 часов при 18 ° С, чтобы обеспечить созревание яйцеклетки.
3. Inject 3-5 самок с 1000 единиц в лягушку ХГЧ, чтобы побудить откладки яиц. Наши эксперименты, кажется, работают лучше, если созревание ооцитов и ХГЧ инъекции сделаны примерно в то же время, около 12 часов до имплантации в хозяина (например, в 10 вечера -10 AM). Оставьте женщин при комнатной температуре или 18 ° С в течение ночи.

4. Подготовка и прижизненного окрашивания краска ооцитов

1. В первой половине дня передачи, позволяющие ~ 45-60 ', чтобы создать и выполнить процедуру. На данный момент, зрелые яйцеклетки могут быть заморожены для последующего анализа эффективности нокдаун мРНК или белка выражения. Кроме того, проверьте, что ооциты не заразиться и что существует хороший темп созревания (> 50%). Зараженные ооцитов не удобряют. Оттепель витальных красителей (материалам), и спина на максимальной скорости в течение 5 мин.
2. Цвет различных экспериментальных групп, добавляя 80 мкл соответствующего жизненно красителя (ей) ооцитов блюд и инкубировать с качающимися на 15 ». За это время, выберите хост женщины и начинают наркоз. Выберите лягушку, которая медленно откладывают яйца обычно или тот, который производит обильные яйца с мягкой сжатия. Яйца от хост должен быть хорошего качества. Избегайте женщин, которые лежат строки яиц или измельченные яйца.
3. Передача крашеные яйца в большую миску свежих OCM, вихрем кратко мыть и отложите их до передачи.
4. Подготовка стерильной пипетки Пастера с отверстием как раз хватает для размещения ооцитов (~ 1,5 мм) для использования в пересадке ооциты. Оценка пипетки с карандашом алмаз и перерыва чисто. Пожар польский пока края гладкие, заботясь, чтобы не расплавиться открытия закрыты.

5. Выполнение ооцитов трансплантации

1. Ооцитов трансплантации используются те же хирургических процедур, как описано в первой части, хотя вместо удаления яичников, манипулировать ооциты вводят в полость тела с пипеткой. В идеале, передача процедура должна быть выполнена как можно быстрее и размер разреза должны быть как можно меньше.
2. Anesthesize хост женщин и подготовить хирургических инструментов, как описано в первой части Марка и разрез, как описано в первой части разреза может быть меньше, но она должна быть достаточно большой, чтобы соответствовать отверстие передачи пипетки (рис. 2А).
3. Для пересадки ооцитов, держитесь и поднять один лоскут из мышц и фасции щипцами и внедрение экспериментальных ооцитов помощью пипетки Пастера подготовлены выше. Swirl блюдо ооцитов, чтобы собрать их в центр и поглощать как можно больше. Разрешить ооцитов, чтобы обосноваться в конце пипетки, чтобы предотвратить избыточную жидкость из внедряются и вставьте кончик пипетки в разрез и медленно позволяют ооцитов сочиться в полость тела (рис. 2В). Повторяйте, пока все ооциты были переданы. Не отпускайте мышечного слоя в любой момент, пока вы не начали ушивание, или ооциты прольется из разреза.
4. После ооцитов были переданы, понять обе стороны разреза пинцетом и свести их вместе, позволяя ооцитов, чтобы обосноваться в полость тела. Начните наложения швов, как описано, заботясь, чтобы держать вверх напряженности на мышцы и фасции, пока первый узел привязан (рис. 2С). Это позволит сохранить ооцитов от изгнана и позволит края разреза, чтобы исцелить равномерно. Добавить еще один шов в мышцах / фасции слоем, а затем шов кожи.
5. Смойте женщина с деионизированной водой и поставьте ее в восстановлении ведро с охлаждением (18 ° С) Amquel обработанной воды. Монитор ее восстановление после наркоза, что и выше. Она должна начать откладывать яйца как правило, после операции.
6. Получить яички от мужчин лягушки с помощью обычных процедур. Магазин яички в OCM или L15, пока это необходимо. Мы предпочитаем свежие яички, когда удобрения эксперименты по передаче.

6. Восстановление ооцитов и экстракорпоральное оплодотворение

1. Перитонеальный реснички будет управлять переданы яйца (и нормальной целомической яйца хоста) для отверстий яйцеводов в передней полости тела. Цветные яйца могут быть восстановлены начало через 2-3 часа после передачи от нормальных сжатия. Яйца могут быть получены через каждые полчаса или около того, пока женщина останавливается кладки.
2. Удобряйте в специгт подвеска (в ~ 4 мл 1x MMR) в течение 4 минут. Потоп и смыть экстенсивно с 0.1x MMR. Яйца должны активировать нормально и начнет расщеплять ~ 1.5-2 ч после оплодотворения. Переданы яйца часто расщепляют немного позже, чем хозяин яйца.
3. Удалить желе пальто с цистеином, как обычно и сортировать эмбрионов в отдельную посуду. Это можно сделать на любом этапе, в зависимости от потребностей эксперимента. Обычно легче всего идентифицировать различные цвета вокруг 4-клеточной стадии, и самое трудное во время поздней бластулы этапов. Культура яйцами низкой плотности (<50 в среду блюдо) в чистом 0.1x MMR. С этой точки, эмбрионы могут рассматриваться и управляться как обычно.
4. Вернуться лягушек на объект животного и мониторинг развития осложнений в течение ближайших нескольких дней.
5. Альтернативный метод оплодотворения; откладки яиц в буфере с высокой ионной соли
   1. После лягушки оправилась от наркоза, место ее в ~ 1L высокого соль MMR (1.2x). Разрешить женщина, чтобы отложить яйца в буфер около 4-6 часов. Сожмите оставшиеся яйца из, процедить 1.2x MMR и сортировать крашеные яйца в чистые блюдо, удалить все возможные жидкости.
   2. Вымойте экстенсивно с 0,3 x MMR и оплодотворить в минимальном объеме 0,3 x MMR / спермы подвески пока яйца активировать (10 минут). Потоп с 0.1x MMR и культуры, что и выше. Эта опция полезна, если много яиц необходимы на одной сцене или при ручном выражение яиц ущерба доноры ооцитов.

Обсуждение

Успешная передача приведет к оплодотворению и нормального расщепления> 50% ооцитов (рис. 3). Обычно между 30-60% от переводимой ооцитов выживет прошлого этапа нейрулы. Мы обычно передачи 75-150 ооцитов в экспериментальной группе, которая даст достаточно эмбрионов в течение нескольких типов ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% L-15 Лейбовиц в среде (содержащей L-глютамин)	(Invitrogen 11415-064)
0,4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА; часть V)	(Sigma-9418-50г)
1x Пенициллин-Стрептомицин	(Sigma P-0781)
Отрегулируйте до рН 7.6-7.8 с 5N NaOH
Сделайте свежие еженедельные, хранить при температуре 18 ° C.

1M NaCl

20 мМ KCl

20 мМ CaCl 2

10 мМ MgCl 2

150 мМ HEPES

приспособиться к рН 7.6-7.8

Хранить при температуре 4 ° С

1 г / л 3-аминобензойной кислоты этиловый эфир (MS222)	(Sigma-5040)
0,7 г / л бикарбоната натрия
Растворите в Amquel-очищенной воды
Сделайте свежие еженедельно

10 мМ Прогестерон (Sigma P-0130) в 100% этанола

Развести в 1 мм в 100% этанола для 500x запаса / Рабочий раствор

Хранить при температуре от -20 ° C

Синий: 0,1% Нила Синий	(Aldrich 121479-5G),
Красный: 0,25% нейтрального красного	(Sigma N-6634),
Браун: 1% Бисмарк Браун	(Sigma B-2759),
Зеленый (80 мкл синий + 80 мкл коричневый),
Сиреневый (80 мкл синий + 80 мкл красного цвета).
Шестой цвет, оранжевый (80 мкл красный + 80 мкл коричневый), также может быть использован, но часто трудно отличить от коричневого.