Endovasküler Dikiş Rat Orta Serebral Arter Tıkanıklığı Fokal Serebral İskemi Model

Özet

Sıçan iskemik beyin hasarı Cerrahi indüksiyon inme araştırma için yaygın olarak kullanılan bir model. Burada orta serebral arter oklüzyonu ile fokal serebral iskemi indüksiyon göstermektedir. Histolojik boyama ve manyetik rezonans görüntüleme ile enfarkt Görselleştirme de gösterilir.

Özet

^İnme, 1 dünya çapında yetişkin sakatlık ve ölüm üçüncü önde gelen nedenidir önde gelen nedenidir . Insan inme, son derece değişken bir klinik devlet vardır; Ancak, fokal iskemi gelişimi hayvan modellerinde deneysel olarak infarkt hacmi tekrarlanabilirliği sağlamak esastır. Rat nispeten düşük hayvancılık maliyetleri ve insanlar ^2,3 kafa dolaşımı benzerliği nedeniyle inme için yaygın olarak kullanılan bir hayvan modeli. İnsanlarda, orta serebral arter (MCA) inme sendromlar ve MCA tıkanıklığı (MCAO) birden çok yöntem en sık etkilenen hayvan modellerinde bu klinik sendrom taklit etmek için tarif edilmiştir. Rekanalizasyon yaygın oklüzyon bir süre sonra insan, reperfüzyon bir akut inme sonrası oluşur çünkü bu modellerin çoğunda dahil edilmiştir. Bu video, spontan hipertansif sıçan (SHR) geçici endovasküler dikiş MCAO modeli ortaya koymaktadır. Silikon meme kaplama ile filament reperfüzyon ile 60 dakika için MCA kökenli intraluminally yerleştirilir. Wistar veya Sprague-Dawley sıçan suşları, en uygun oklüzyon süresi değişebilir unutmayın. Sıçan inme birçok davranışsal göstergeler. Fokal iskemi doğruladı ve T2 ağırlıklı manyetik rezonans görüntüleri kullanarak beynin bölümleri MCAO 24 saat sonra 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile boyanarak.

Protokol

MCAO Rat Modeli

Cerrahi öncesi hazırlıklar

Aseptik teknik, bütün hayatta kalma cerrahi işlemler için kullanılmalıdır. Cerrahi çalışma yüzeyine ticari dezenfektan ile dezenfekte edin ve otoklav ile steril cerrahi aletler, perdeler, gazlı bez, bezlerden, dikiş, bisturi ağızları paketleri hazırlamak. Cerrahi maske, saç kaput ve steril eldiven giyilmelidir. A Germinator kuru boncuk sterilizatör da bir oturum sırasında birden fazla sıçan ameliyatları yapılabilir. Prosedürleri arasında cerrahi aletler tekrar sterilize etmek için kullanılır. Emici ped altında Prewarm su-ceketli homeothermic battaniye ve yeri, ameliyat sırasında sıçan hipotermi önlemek için.

1. Spontan hipertansif sıçan (ya da seçtiğiniz diğer sıçan suşu) indüksiyon odasına yerleştirin ve anestezi neden izofluran (% 5 anestezi makinesi 1.0 L / dk O ₂ ve 1.0 L / dk N ₂ O set olması lazım). % 1-2 izofluran anesteziyi idame ettirmek için indirin.
2. Her iki gözde Yapay Tears merhem sürün.
3. Tıraş kesme makineleri (# 10 bıçak Oster A5) kullanılarak prospektif kesi yeri ötesinde, boğaz ve sol boyun bölgesi.
4. Bir gazlı bezle Betadine uygulayın ve cerrahi bölgenin merkezi başlayarak dışa doğru helezonik cildi dezenfekte edin. Benzer bir model ped hareketli,% 70 etanol içeren steril gazlı bezle durulayın. Toplam üç kür için her iki adımları tekrarlayın.
5. Prospektif kesi yeri boyunca subkutan% 0.5 bupivakain 0.2 ml enjekte edilir.
6. Steril cerrahi örtü ile steril stockinette veya kapak yerleştirin sıçan.

Geçici MCA oklüzyonu

7. Operasyon mikroskobu altında, ventral orta hat kesi yapılır ve yüzeysel fasya disseke edilir.
8. Son olarak sternomastoid kas ve sindirimve (parlak beyaz tendinöz kısmı ile kolayca tespit); trakea üzerinde orta hat yatıyor sternohyoid, yüzeysel fasya altında, bir üçgen oluşturan sol ve üç kaslara glandüler doku.
9. Karotis arter (kaza sonucu doku hasarı en aza indirmek için bazı özel künt diseksiyon tercih edilebilir) tanımlamak için üçgen içinde dikkatli keskin ve künt diseksiyon yapılır. Iç, dış ve ortak karotid arterler (ECA, ICA, CCA) maruz kalmaktadır. Karotis arter büyük ve gözle görülür bir bakliyat. Vagus siniri ortak ve iç karotid arterlerin lateral boyunca dolaşan ve keskin bir ortak ve iç karotid arterlerin kapalı disseke edilir.
10. İki ECA dalları sonra ilk şubesini mediale başlığı ve ikinci şubesini yanal başlığı, keskin disseke. Her iki şubesi daha büyük gemilerin harekete geçirilmesi daha kolay sağlar, koterize ve kesilir.
11. ECA, şimdi daha rostrally disseke edilir. Hyoid kemik karşılaştı olabilir ve bu rostral diseksiyon ölçüde sınırlayacaktır. Eksternal karotid arter distalde olarak 6-0 ipek sütür ile mümkün bağlıdır.
12. Bir başka 6-0 ipek sütür ICA ile bifurkasyon yakın ECA çevresinde gevşek olarak yerleştirilir. Oklüzyon için kullanılmak üzere bir sonraki adımda intraluminal dikiş burada geçiyor olacak gibi gemi kapamak için değil emin olun.
13. Mikrocerrahi klipleri çatallanma yakın ortak ve iç karotid arterler üzerine yerleştirilir.
14. Eksternal karotid arter iki ipek sütür bağları arasında bir ilk kısmi arteriyotomi oluşturulur.
15. 4-0 prolen sütür ECA lümen içine silikon kaplı yuvarlak, bir ucundan bir bükülme 2.0 cm ile 2.2 -3.0 cm uzunluğunda, mikrocerrahi klibi bulunan CCA doğru tanıtmak. Bu dikişler ticari olarak mevcuttur (Doccol Corp, Redlands, CA, USA). ECA ve ICA çatallanma altında güdük güdük ve pozisyon ücretsiz Cut ECA kalan kısmı (kısmi arteriyotomi yerinde), bu daha kolay intraluminal dikiş ICA slayt sağlayacaktır.
16. Intraluminal naylon dikiş ve kanama önlemek güvenli ve daha sonra ICA mikrovasküler klibini kaldırmak için ipek sütür ECA güdük etrafında sıkın. Kanama kontrol etmek için çıkarmadan önce yavaş yavaş klibi açın.
17. Orta serebral arter (MCA), ECA ve ICA lümen naylon dikiş ilerleyen devam edin. Bu uzunluk, genellikle 18-20 mm ve ekleme önce dikiş kink yerleştirmek için nedeni budur. Naylon sütür bir değişken uzunluğu takıldıktan sonra, direnç hissedilebilir. Bu geminin dışında halen naylon sütür ile oluşursa, dikiş muhtemelen pterigopalatin arter (aşağıdaki nota bakınız) girdiğini gösterir. Geri çekin ve eğri sütür biraz daha mediale çalışacağı, ICA boyunca devam etmek. Ayrıca, Kamu İhale kökenli diseksiyon yolu daha iyi görselleştirmek için yapılabilirintraluminal filament. Direnç ve 2 cm bükülmüş pozisyonda sonra hissedilir kadar naylon sütür eklemek için devam edin. Bu noktada, intraluminal dikiş MCA kökeni engelledi. OSA oklüzyonu, bir lazer Doppler debimetre (tek bir donanım kaynağı için Malzemeler tabloya bakınız) kullanılarak bölgesel serebral kan akımında azalma izleme ile teyit edilebilir. Ayrıca bu gemi intraluminal sütür ile yanlışlıkla entübasyon önlemek için, eğer tercih ICA pterigopalatin arter kökeni, doğrudan bağlanır olabilir unutmayın.
18. Zamanlayıcı ve kayıt oklüzyon başlangıç ​​zamanı başlayın.
19. CCA microclip çıkarın.
20. 3-0 ipek sütür (basit bir sürekli desen reperfüzyon için yeniden açılmasını kolaylaştıracaktır) ile hızlı bir kesi (dermis, panniculus carnosus, subkutan doku katmanlarına) kapatın ve sıçan bir kurtarma kafes dikkatlice yerleştirin. Burun ve ağız çevresinde kafes katında yatak malzemesi ve anestezi monitör kurtarma ücretsiz olup olmadığını kontrol edin.

MCA kan akım Restorasyonu (reperfüzyon)

21. Oklüzyon dönem sonu kısa bir süre önce, sıçan yeniden uyutmak Betadine ve% 70 etanol (3 döngüleri, daha önce olduğu gibi) ile kesi yeri dezenfekte ve kapanış sütür kaldırarak kesi yeniden.
22. Önce olduğu gibi, CCA bir microclip yerleştirin.
23. Kapatılmasıy dikiş partway ICA, ICA ile dikiş sonu görünür oluncaya kadar çekin. ICA / ECA tamamen dikiş ÇIKARMAYIN !
24. Intraluminal dikiş sonunda yukarıda ICA microclip yerleştirin.
25. Tamamen kapatılmasıy dikiş kaldırmak ve ECA güdük sıkıca kapalı kravat. Oklüzyonu sonunda (reperfüzyon başlangıç) zaman.
26. ICA microclip çıkarın.
27. CCA microclip çıkarın.
28. Bölgede birkaç damla steril serum fizyolojik ile ıslatın ve basit bir kesintiye desen kullanırken 3-0 ipek sütür ile kesi katmanları (dermis, panniculus carnosus, derialtı dokusu) kapatın.
29. Peritoneal boşluğa (kurumsal yönergeleri izleyerek ya da diğer uygun post-operatif ağrı kesici) 0.05 mg / kg buprenorfin yönetme.
30. 5cc prewarmed serum fizyolojik intraperitoneal olarak enjekte edilir. Bu kurtarma aşamasında hidrasyon sağlayacaktır.
31. Anesteziden sıçan kurtarma izleyin.
32. Sıçan kurtarıldı sonra, kuyruk sıçan tutan ve sıçan, her iki taraf için açabilirsiniz olup olmadığını gözlemlemek enfarktüsü davranışsal endikasyon için test edin. Sadece bir tarafa Curling bekleniyor. Basit puanlama ölçekleri ilk post-infarkt behavorial işleyişi (Tartışma) kaydetmek için kullanılan olabilir.
33. Buprenorfin (yukarıdaki gibi aynı doz) Ek enjeksiyonu için her 6 ila 8 saat 24 saat ağrı kesici verilmelidir. Hayvan rahatsızlık belirtileri gösteriyor ise analjezi uzatın.

Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Endovasküler sütür ile orta serebral arter tıkanıklığı sıçan kraniyal dolaşım sisteminin basitleştirilmiş bir şeması MCA kökeni kapatılmasıy bir silikon kaplı intraluminal sütür ile gösterilir. Sol ECA OA ve ST dalları bağlandı ve ECA güdük etrafında bir dikiş kravat yerine intraluminal dikiş tutar olmuştur. ACA, anterior serebral arter, BA, baziler arter; CCA, karotis arter; ECA, eksternal karotid arter; ICA, internal karotid arter; MCA, orta serebral arter, OA, oksipital arter; PCA, posterior serebral arter; PComA, arka iletişim arter; PPA, pterigopalatin arter; ST, üstün tiroid arter. Sasaki ve ark. ⁴ ve Lee ³ uyarlanmıştır Şekil.

Şekil 2. Sıçan beyni 24 saat koronal bölümleri Temsilcisi manyetik rezonans görüntüleme, 1 saat geçici MCAO sonra Beyin ödemi fokal iskemi ile birlikte T2 ağırlıklı MR görüntülerde görüntülenmiştir . Infarkt bölgesi T2 görüntülerde hiperintens (parlak) görünür. Benzer infarkt şekilleri, difüzyon ağırlıklı görüntüleme ve ⁵ haritalama görünen difüzyon katsayısı gibi daha ileri MRG teknikleri ile görülebilir.

Şekil 3. Sıçan beyin Temsilcisi koronal bölümleri, 1 saat geçici MCAO sonra TTC 24 saat ile boyandı. TTC boyama Şekil 2'de gösterildiği gibi aynı sıçan serebral korteks ve striatum beyaz (boyasız) enfarkte bölgelerinde ortaya koymaktadır. Belirlenen nihai enfarkt alan histolojik T2 lezyon biraz daha küçük olsa da fokal iskemik lezyonların genel desen, MRG T2 ağırlıklı görüntülerde görülen benzer olduğunu unutmayın.

Tartışmalar

Serebral iskemi Kemirgen modelleri, küresel veya fokal ve geri dönüşümlü veya dönüşümsüz olarak sınıflandırılabilir. Biz insan inmeli hastalarda aşağıdaki rekanalizasyon oluşabilir reperfüzyon hasarı taklit etmek için bir tersinir fokal iskemi modeli kullanın. Iken sıçan hisse senetleri, insan, Circle Willis ve tutarsız ^infarkt hacimleri 6 leptomeningeal anastomozlar sonuçları nedeniyle kapsamlı intrakranial kollateral dolaşım benzer kafatası dolaşımı avantaj. Infarkt ^7-10 normotansif sıçanlara kıyasla fokal serebral iskemi maruz SHRs büyüktür, çünkü spontan hipertansif sıçan (SHR) suşu kullanın. SHRs inme endüksiyon da daha tutarlı ve yaygın olarak kullanılan diğer suşların ¹¹ daha az ölüm oluşturabilir. Dalgalanmalar infarkt hacimleri değişkenliği ekleyebilirsiniz Buna ek olarak, fizyolojik parametrelere, ameliyat boyunca takip edilmelidir; bu parametrelerin iskemik hasarı arttırabilir ^2,12 kan basıncı, arteriyel O ₂ ve CO ₂ düzeyleri, hipotermi ve hiperglisemi, . Hipotermi esastır, ameliyat sırasında bir termoregülatuar ısıtma yastığı sıçan yerleştirerek, bu nedenle nöronal iskemik hasarın derecesini azaltmak, çünkü özellikle endişe vericidir.

Biz ticari bir girişim infarkt boyutu ^13-15 tutarlılığını artırmak için bu yordamı silikon kaplı sütür hazırlanan istihdam etmektedir. Geleneksel olarak, MCA kapamak için kullanılan intraluminal sütür alev yuvarlama 3-0 naylon sütür ucu veya kat küçük bir tutkal boncuk ¹⁶ dikiş ucu bir sıcak tutkal tabancası kullanarak tarafından hazırlanmıştır. Bu prosedürler, belirli bir sıçan damar çapı eşleşen bir dikiş bulmadan oklüzyon birkaç deneme gerektirebilir, dolayısıyla farklı uç çap ve dikişlerle üretir. Bu video açıklanan MCAO yöntem Ek varyasyonları daha distal tıkanıklığı, kollateral kan akımı ^6,9 azaltmak için saf bir kortikal enfarkt ¹⁷ ve aynı anda MCA ve ipsilateral karotis arter oklüzyonu için lentikülostriat dalları koruyucu içerir .

Fonksiyonel etkileri inme, belirli görevleri açıklar basit bir puanlama ölçekte yansıtılmıştır davranış testleri, çeşitli kullanılarak tespit edilebilir. Örneğin, Bederson ve ark. ¹⁸ yüksek bir vücut pozisyonu, lateral itme asimetrik direnç, ve açık alan çizerek davranışı ön ayakları fleksiyon ölçüde bir nörolojik skoru derecelendirme sıçanlarda geliştirdi. Yükselmiş ve başka hiçbir açıkları sergileyen hem ön ayakları yere uzanan Sıçanlar derecelendirildi "Normal" (0), sadece kontralateral ön ayakları fleksiyon ile sıçan "Orta açıkları (1)" sınıflandırılmış idi. "Şiddetli notu 2" sıçan yanal kuvvet kontralateral tarafta azalmış direnç gösterilir ve "Ciddi grade 3" sıçan ayrıca çizerek davranışları yapan. Düşük dereceli davranış açıkları her zaman bir sonraki daha yüksek dereceli gözlenen (örneğin, grade 2 ve 3 hayvan da ön ayakları fleksiyon görüntülenir) ve bu puanları infarkt ¹⁸ farklılıklar tahmin edildi. Bu nedenle inme fonksiyonel açıklarının hızlı, tutarlı bir yarı-kantitatif bir değerlendirme için, böyle basit bir skorlama sistemi sağlar.

Beyin enfarktüsü ölçüde ölçümü yaygın cresyl menekşe, TTC (Nissl leke) veya hematoksilen ve eosin ile doku hasarı histolojik boyama ile gerçekleştirilir. Manyetik rezonans görüntüleme teknikleri difüzyon ağırlıklı oklüzyon sonra doku hasat için gerek kalmadan, her bir sıçan bir infarkt hacminin belirlenmesi için izin erken zaman noktalarında infarkt görselleştirmek için MR. MCAO sonra sıçan görüntüleme ama önce tedavi yönetimi değişkenlik karıştırıcı etkilerinin azaltılması, tüm deney ve kontrol hayvanların benzer vuruş başlatmak için deneyimli araştırmacı güven verir; Bu, inme sonrası bir nöroprotektif tedavi etkinliğinin belirlenmesine yönelik çalışmalar özellikle değerli İnme indüksiyon.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture	Doccol Corporation		2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter
Spontaneously hypertensive rats	Charles River Laboratories		290-300 g, male
Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads	Gaymar Industries
Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit	Summit Hill Laboratories
Germinator 500 glass bead sterilizer	CellPoint Scientific
Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor	TSI Inc.