Focale modèle d'ischémie cérébrale par occlusion suture endovasculaire de l'artère cérébrale moyenne chez le rat

Résumé

L'induction chirurgicale d'une lésion cérébrale ischémique chez le rat est un modèle largement utilisé pour la recherche sur les AVC. Ici nous démontrons l'induction d'une ischémie cérébrale focale par occlusion de l'artère cérébrale moyenne. Visualisation de l'infarctus entraînant par coloration histologique et l'imagerie par résonance magnétique est également représentée.

Résumé

L'AVC est la principale cause d'invalidité et la troisième cause de décès chez les adultes dans le monde ^1. En course humaine, il existe un état clinique très variable; dans le développement de modèles animaux d'ischémie focale, cependant, la réalisation de la reproductibilité de volume de l'infarctus induite expérimentalement est essentielle. Le rat est un modèle animal largement utilisé pour la course en raison de sa relativement faible des coûts d'élevage et à la ressemblance de sa circulation crânienne à celui des humains ^2,3. Chez l'homme, l'artère cérébrale moyenne (MCA) est plus fréquemment touchées dans les syndromes AVC et de multiples méthodes de MCA occlusion (MCAO) ont été décrits pour imiter ce syndrome clinique dans des modèles animaux. Parce que la recanalisation survient fréquemment après un AVC aigu chez l'homme, la reperfusion après une période d'occlusion a été inclus dans plusieurs de ces modèles. Dans cette vidéo, nous démontrons le transitoire de suture endovasculaire modèle MCAO chez le rat spontanément hypertendu (SHR). Un filament d'une couche de silicium est placée la pointe lumière intestinale à l'origine du MCA pendant 60 minutes, suivie d'une reperfusion. Notez que la période d'occlusion optimale peut varier dans d'autres souches de rats, comme des rats Wistar ou Sprague-Dawley. Plusieurs indicateurs comportementaux d'AVC chez le rat sont représentés. Ischémie focale est confirmée en utilisant séquences pondérées en T2 par résonance magnétique et par la coloration des coupes de cerveau avec du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) 24 heures après MCAO.

Protocole

Modèle de rat MCAO

Les préparatifs préchirurgical

Une technique aseptique doit être utilisée pour toutes les procédures de survie chirurgicale. Désinfecter la surface de travail chirurgical avec désinfectant commercial et préparer stériles packs d'instruments chirurgicaux, des rideaux, de la gaze, des tampons, des sutures, et les lames de bistouri par autoclavage. Un masque chirurgical, bonnet de cheveux et gants stériles devraient être portés. Un sèche Germinator stérilisateur à billes est également utilisé pour stériliser les instruments chirurgicaux entre les procédures si chirurgies multiples chez le rat sera fait au cours d'une session. Préchauffer une couverture à chemise d'eau homéothermes et de lieu dans un tampon absorbant afin d'éviter l'hypothermie chez le rat pendant la chirurgie.

1. Lieu spontanément rat hypertendu (ou souche de rats autre moyen du choix) dans une chambre d'induction et d'induire une anesthésie avec l'isoflurane à 5% (appareil d'anesthésie devrait être fixé à 1,0 L / min d'O ₂ et 1,0 L / min N ₂ O). Basse à 1-2% d'isoflurane pour maintenir l'anesthésie.
2. Appliquer une pommade artificielle larmes aux yeux à la fois.
3. Rasez la gorge et du cou gauche au-delà du site d'incision prospective utilisant tondeuses (Oster A5 avec # 10 lames).
4. Appliquer à la Bétadine un tampon de gaze et de désinfecter la peau à partir du centre de la région chirurgicale, en spirale vers l'extérieur. Rincer avec un tampon de gaze stérile contenant de l'éthanol 70%, passant pad dans un schéma similaire. Répétez les deux étapes pour un total de trois cycles.
5. Injecter 0,2 mL de bupivacaïne à 0,5% en sous-cutané le long du site d'incision prospective.
6. Placez le rat en jersey stérile ou couvrir d'un drap stérile chirurgicale.

Occlusion transitoire de MCA

7. Sous un microscope opératoire, une incision médiane ventrale est effectuée et le fascia superficiel est disséqué.
8. Sous l'aponévrose superficielle, il ya des tissus glandulaires de la gauche et trois muscles qui forment un triangle: le sternohyoïdien, qui se trouve sur la ligne médiane de la trachée; digastrique (facilement identifiable grâce à sa partie brillante tendineux blanc) et, enfin, le muscle sterno.
9. Attention dissection fine et émoussée est réalisée au sein du triangle d'identifier l'artère carotide (exclusif dissection peut être préférée par certains pour minimiser les dommages tissulaires accidentelle). Les artères externe, interne et carotide commune (CEA, l'ICA, CCA) sont exposés. L'artère carotide est grande et visiblement impulsions. Le nerf vague est vu courre le long de la face latérale des deux communes et artères carotides internes et est fortement disséqué les artères carotides internes et les communes.
10. Deux branches CEA sont ensuite disséqués fortement, la première branche rubrique dedans et la deuxième branche rubrique latéralement. Les deux branches sont cautérisées et coupé, ce qui permet une plus grande facilité à mobiliser les grands navires.
11. Le CEA est maintenant disséqué plus rostral. L'os hyoïde peuvent être rencontrés, ce qui limitera l'ampleur de la dissection rostrale. L'artère carotide externe est lié hors de distal que possible avec une suture soie 6-0.
12. Un autre de suture soie 6-0 est placé lâchement autour du CEA à proximité de la bifurcation avec l'ICA. Veillez à ne pas obstruer le vaisseau que la suture intraluminale à être utilisé pour l'occlusion sera passer par là à une étape ultérieure.
13. Microchirurgie clips sont placés sur communs et artères carotides internes à proximité de la bifurcation.
14. Une artériotomie partielle initiale est créée entre les deux liens de suture de soie sur l'artère carotide externe.
15. Introduire un 2,2 -3,0 cm de longueur de suture de monofilament en nylon 4-0, avec un repli 2,0 cm à partir de son arrondi, siliconé pointe, dans la lumière vers le bas vers la CEA de l'ACC, où le clip de microchirurgie est situé. Ces sutures sont commercialement disponibles (Doccol Corp, Redlands, CA, USA). Couper la partie restante de la CEA (à l'emplacement de l'artériotomie partielle) pour libérer le moignon et la position de la souche en dessous de la bifurcation de la CEA et l'ICA, ce sera plus facile de permettre à la suture intraluminale de glisser dans l'ACI.
16. Serrer la suture de soie autour du moignon CEA pour sécuriser la suture en nylon intraluminale et prévenir les saignements, puis retirez le clip microvasculaire de l'ICA. Ouvrez le clip avant de le sortir pour vérifier les saignements.
17. Continuer à faire progresser la suture en nylon de la CEA à l'ICA lumière de l'artère cérébrale moyenne (MCA). Cette longueur est généralement de 18-20 mm et c'est la raison pour placer un coude dans la suture avant l'insertion. Après une durée variable de suture en nylon est inséré, la résistance peut se faire sentir. Si cela se produit avec beaucoup de la suture en nylon encore présent en dehors de la cuve, il indique que la suture est susceptible d'entrer l'artère ptérygo (voir note ci-dessous). Retirez-vous et la courbe de la suture légèrement pour continuer le long de l'ICA, qui se déroulera plus en dedans. De plus, la dissection de l'origine de l'APP peut être fait pour mieux visualiser le chemindu filament intraluminale. Continuez à insérer le fil de suture en nylon jusqu'à sentir une résistance pendant et après le poste de 2 cm plié. À ce stade, la suture intraluminale a bloqué l'origine de la MCA. MCA occlusion peut être confirmée par le suivi de la réduction du débit sanguin cérébral régional aide d'un débitmètre laser Doppler (voir tableau Matériaux pour une seule source d'équipement). Notez également que l'origine de l'artère ptérygo hors de l'ICA peut être directement liée au large, si on préfère, afin d'éviter une intubation accidentelle de ce navire avec la suture intraluminale.
18. Démarrez le chronomètre et l'heure de début d'enregistrement d'occlusion.
19. Retirez le microclip de la CCA.
20. Fermer l'incision (derme, pannicule carnosus, les couches de tissu sous-cutané) rapidement avec suture de soie 3-0 (un modèle simple en continu faciliteront la réouverture de reperfusion) et placer soigneusement le rat dans une cage de récupération. Vérifier que le plancher de la cage autour du nez et la bouche sont libres de litière et la récupération du moniteur à partir d'anesthésie.

Restauration de la circulation sanguine MCA (reperfusion)

21. Peu avant la période d'occlusion doit se terminer, ré-anesthésier le rat, désinfecter le site d'incision avec de la Bétadine et de l'éthanol à 70% (3 cycles, comme avant) et de rouvrir l'incision en supprimant les sutures de clôture.
22. Placer un microclip sur le CCA, comme avant.
23. Retirer à mi-course de suture occlusion de l'ICA jusqu'à la fin de suture est visible à travers l'ICA. Ne PAS retirer complètement de la suture de l'ICA / CEA!
24. Placer un microclip sur l'ICA dessus de l'extrémité de la suture intraluminale.
25. Supprimer complètement la suture d'occlusion et attacher solidement la souche de la CEA. Terminer l'enregistrement de l'occlusion (début de reperfusion) du temps.
26. Retirez le microclip de l'ICA.
27. Retirez le microclip de la CCA.
28. Humidifiez la région avec quelques gouttes d'une solution saline stérile et fermer les couches incision (derme, pannicule carnosus, tissu sous-cutané) avec 3-0 suture de soie en utilisant un modèle simple interrompu.
29. Administrer 0,05 mg / kg de buprénorphine (ou d'autres analgésiques post-opératoires après vos directives institutionnelles) dans l'espace péritonéal.
30. Injecter par voie intrapéritonéale 5cc de salines préchauffée. Cela fournira une hydratation pendant la phase de récupération.
31. Surveiller le rétablissement de rat de l'anesthésie.
32. Après que le rat a récupéré, le test de comportement pour l'indication de l'infarctus en tenant le rat par la queue et en observant si le rat peut se tourner vers les deux côtés. Curling d'un côté seulement est prévu. Échelles de notation simple peut être utilisé pour enregistrer initiales post-infarctus fonctionnement comportementaux (voir discussion).
33. Injections supplémentaires de la buprénorphine (même dose que ci-dessus) doit être administrée tous les 6 à 8 heures pour 24 heures de soulagement de la douleur. Prolongez l'analgésie si l'animal montre des signes de malaise.

Les résultats représentatifs

Figure 1. L'occlusion de l'artère cérébrale moyenne par suture endovasculaire. Un schéma simplifié du système circulatoire crânienne du rat est montré avec une suture intraluminale siliconé occultant l'origine de la MCA. L'arthrose et les branches ST hors de la CEA gauche ont été ligaturés et d'une cravate de suture autour du moignon CEA détient la suture intraluminale en place. ACA, artère cérébrale antérieure; BA, basilaire artère; CCA, l'artère carotide commune; CEA, carotide externe artère; ICA, artère carotide interne; MCA, l'artère cérébrale moyenne; l'arthrose, l'artère occipitale; PCA, l'artère cérébrale postérieure; PComA, communicante postérieure artère; APP, l'artère ptérygo; ST, l'artère thyroïdienne supérieure. Figure adaptée de Sasaki et al. ⁴ et Lee ^3.

Figure 2. Représentant imagerie par résonance magnétique de coupes coronales du cerveau de rat 24 heures après MCAO transitoires 1 heure. Œdème cérébral qui accompagne l'ischémie focale est visualisée dans séquences pondérées en T2 IRM. La zone de l'infarctus apparaît hyperintenses (lumineux) sur les images T2. Modèles similaires d'infarctus peut être vu avec des techniques plus avancées telles que l'IRM de diffusion et de l'imagerie pondérée coefficient apparent de diffusion de cartographie ^5.

Figure 3. Représentant coupes coronales de cerveau de rat tachés avec TTC 24 heures après MCAO transitoires 1 heure. Coloration TTC révèle blanc (non coloré) infarci régions du cortex cérébral et du striatum chez le rat même que celui montré dans la figure 2. Notez que le schéma général de focale des lésions ischémiques est similaire à celle observée dans l'IRM en pondération T2, bien que la zone d'infarctus final déterminé histologiquement peut être légèrement plus petite que la lésion T2.

Discussion

Des modèles de rongeurs d'ischémie cérébrale peut être classé comme globale ou focale et aussi réversible ou irréversible. Nous utilisons un modèle d'ischémie focale réversibles afin de mimer l'reperfusion qui peuvent survenir chez l'homme après recanalisation patients victimes d'AVC. Alors que la part du rat l'avantage de la circulation crânienne semblable à l'humain, la circulation collatérale étendue intracrânienne due au Cercle de Willis et leptoméningées résultats anastomoses dans les volumes d'infarctus incompatibles ^6. Nous utilisons le rat spontanément hypertendu (SHR) souche parce taille de l'infarctus est plus grande dans SHR exposés à une ischémie cérébrale focale par rapport à des rats normotendus ^7-10. L'induction des maladies dans le SHR est également plus conforme et peut générer moins de mortalité que dans d'autres souches couramment utilisées ^11. En outre, les paramètres physiologiques doivent être surveillés tout au long de la chirurgie, car les fluctuations peuvent ajouter à la variabilité des volumes d'infarctus; ces paramètres comprennent la pression artérielle, artérielle en O ₂ et CO ₂ niveaux, l'hypothermie, et l'hyperglycémie, qui peuvent aggraver les lésions ischémiques ^2,12 . L'hypothermie est particulièrement préoccupante car elle peut diminuer le degré de lésion ischémique neuronales, et donc, en plaçant le rat sur un coussin chauffant thermorégulation pendant la chirurgie est essentielle.

Nous employons préparés commercialement siliconé sutures dans cette procédure dans une tentative d'accroître la cohérence dans la taille de l'infarctus ^13-15. Traditionnellement, les sutures intraluminale utilisé pour occlure le MCA ont été préparés par la flamme-arrondi une pointe de suture 3-0 en nylon ou en utilisant un pistolet à colle chaude pour bien enrober la pointe de suture avec un petit cordon de colle ^16. Ces procédures produisent des sutures avec des diamètres variant pointe et donc, peut exiger plusieurs tentatives avant de trouver l'occlusion d'une suture qui correspond au diamètre du vaisseau d'un rat donné. D'autres variantes de la méthode décrite dans MCAO cette vidéo comprennent l'occlusion plus distale, épargnant les branches lenticulostriées afin d'avoir un pur infarctus corticaux ^17, et l'occlusion simultanée de la MCA et ipsilatérale artère carotide commune pour réduire la circulation collatérale ^6,9.

Les effets fonctionnels de la course peut être évaluée en utilisant une variété de tests de comportement, dans laquelle les déficits dans des tâches spécifiques sont reflétées dans une échelle de notation simple. Par exemple, Bederson et al. ¹⁸ développé un rat neurologiques classement score sur la mesure de la flexion du membre antérieur dans une position corporelle élevée, la résistance asymétrique à une poussée latérale, et le comportement en plein champ encerclant. Rats s'étendant à la fois membres antérieurs à l'étage où élevés et ne présentant pas de déficits d'autres ont été classés «Normal (0)», tandis que des rats avec une flexion des membres antérieurs controlatéraux seulement ont été classés avec les "déficits modérés (1)». «Sévère de grade 2" rats affiché diminution de la résistance du côté controlatéral à une force latérale et "sévère de grade 3" rats de plus engagés dans encerclant les comportements. Grade inférieur déficits comportementaux ont toujours été observées dans le grade immédiatement supérieur (par exemple, de grade 2 et 3 animaux ont aussi affiché une flexion des membres antérieurs) et ces scores étaient prédictifs des différences de taille de l'infarctus ^{de 18 ans.} Ainsi, un tel système de notation simple permet une rapide, cohérente évaluation semi-quantitative des déficits fonctionnels d'un AVC.

Mesure de l'étendue de l'infarctus cérébral est communément réalisé par coloration histologique des lésions tissulaires utilisant TTC, le violet de crésyl (Nissl tache) ou l'hématoxyline et l'éosine. Magnétiques des techniques d'imagerie par résonance, y compris la diffusion IRM pondérée de visualiser l'infarctus à des moments tôt après l'occlusion, permettant la détermination d'un volume de l'infarctus chez chaque rat individu sans la nécessité pour la récolte de tissus. Ceci est particulièrement utile dans les études visant à déterminer l'efficacité d'un traitement neuroprotecteur suite d'un AVC, l'imagerie du rat après administration du traitement, mais MCAO avant donne confiance enquêteur que tous les animaux expérimentaux et de contrôle expérimentés coups similaires pour commencer, de réduire les effets confondants de la variabilité dans l'induction de course.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture	Doccol Corporation		2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter
Spontaneously hypertensive rats	Charles River Laboratories		290-300 g, male
Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads	Gaymar Industries
Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit	Summit Hill Laboratories
Germinator 500 glass bead sterilizer	CellPoint Scientific
Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor	TSI Inc.