Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Özet

Tümör hücrelerinin T hücre etkileşimi analizi için deneysel bir akciğer metastazı ve CTL immünoterapi fare modeli In vivo.

Özet

Deneysel metastaz fare modeli basit ve fizyolojik ilgili henüz metastaz modeli. Tümör hücrelerinin fare kuyruğu damarlar içine (iv) damar içine enjekte ve tümör hücre spontan metastaz son adımları benzeyen, böylece, akciğerlerde kolonize: distal organlarda kan dolaşımı, ekstravazasyonu ve sömürgeciliğin yaşam. Metastatik tümör distal organ yılında kurulan: tedavilerin hedef genellikle metastaz bitiş noktası bu yana tedavi edici bir açıdan bakıldığında, deneysel metastaz modeli en basit ve ideal bir model. Bu modelde, tümör hücrelerinin fare kuyruğu damarlar içine iv enjekte edilir ve akciğerlerde kolonize ve büyümeye izin. Tümör spesifik CTL sonra iv metastaz taşıyan fare içine enjekte edilir. Akciğer metastazları sayısını ve boyutunu enjekte edilecek tümör hücrelerinin sayısı ve tümör büyümesini zaman kontrol edilebilir. Bu nedenle, çeşitli aşamalarında metastaz, geniş metastaz minimal metastaz modellenmiş olabilir. Akciğer metastazı, böylece daha kolay görsel gözlem ve miktar sağlayarak, mürekkep ile enflasyon analiz edilir.

Protokol

1. Deneysel metastaz Fare Modeli

1. Gün önce tümör hücresi enjeksiyonları, 1'e kadar tohum T75 balon x 10 ⁷ CMS4 Met hücreleri RPMI orta hızlı büyüyen tümör hücreleri elde etmek için% 10 serum içeren 10 ml. 37 o gece inkübe ° C
2. Enjeksiyon gününde, orta kaldırmak ve hücreler PBS ile bir kez yıkayın, sonra 37 0.05% tripsin-EDTA ile tümör hücrelerinin hasat ° C 5 dakika. 10 ml% 10 serum içeren RPMI orta ile reaksiyon durdurun. Konik bir tüp hücreleri aktarın.
3. Oda sıcaklığında 3 dakika 1300 rpm'de Sorvall Legend RT santrifüj hücreleri aşağı spin. Süpernatantı. Yıkamak için 10 ml taze 1X HBSS hücrelerin yeniden süspanse edin, sonra tekrar aşağı spin ve aynı şekilde tekrar süspansiyon haline getirin.
4. Bir hemasitometre tümör hücreleri saymak. Böylece her enjeksiyon için gerekli hücrelerin toplam hacmi 100 mcL yeniden süspanse, HBSS hücrelerin sulandırınız.
5. Kuyruk ven genişletmek için ılık suya batırılmış beher 6-8 haftalık BALB / c farelerde ısıtın. Fare, bankta bir kuyruk ven süzgeç koyun. 100 mcL tümör hücrelerinin lateral kuyruk damar içine enjekte etmek için bir mikroenjektör kullanın. Bulaşmasını önlemek için aseptik teknik kullanın. Kanama durduktan kadar enjeksiyondan sonra enjeksiyon yerinde hafif bir basınç uygulayın.
6. Fare kafesine geri dönün ve istenilen aşamada tümör büyümesine izin.

2. Sitotoksik T-Lenfosit (KVK) Kabul edilmiş Transferi İmmünoterapi

1. Transfer gününde, saflaştırılmış T-lenfositleri sitotoksik ya da CTL, metinde açıklandığı gibi hazırlanmış tekrar süspansiyon pipet ve aşağı yukarı. Hacmi daha fazla tüpün 2 / 3 'ünden fazla izin vermeyen, tüm hücreleri bir plaka 15 ml konik tüp transferi.
2. Steril bir Pasteur pipeti konik tüp içine yerleştirin ve toplam hacmi 14 ml yaklaştığında kadar hücrelerin altında, Lenfosit Ayırma, Orta veya LSM yatıyordu.
3. Katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun. Oda sıcaklığında 20 dakika 2000 rpm'de santrifüjleyin. Sonra rotor iplik yavaş fren kullanmayın.
4. Yeni bir 15 ml konik tüp CTL'lerin aktarın. Yıkamak için yaklaşık 10 ml hacmi HBSS ekleyin.
5. Hücreleri saymak. Oda sıcaklığında 5 dakika 1300 rpm'de Spin. Enjeksiyon başına toplam hacmi 100 mcL tutarak, enjeksiyon için gerekli hücre yoğunluğu HBSS tekrar
6. CTL'lerin Tümör taşıyan farelere enjekte etmek için bu video daha önce görüldüğü gibi aynı kuyruk enjeksiyon tekniği kullanın.
7. Fare kafesine geri dönün ve CTL tümör ile etkileşim kurmak için izin. Fareler genellikle 14-21 gün CTL tedavi sonra analiz için feda.

3. Akciğer metastaz, Görselleştirme

1. Akciğer metastazları görselleştirmek için, plastik bir yönetim kurulu sırtını bir kurban fare yerleştirin. Trakea engelsiz erişim sağlamak için bacaklarını Pin. % 70 etanol ile ventral taraf püskürtün.
2. , Orta karın itibaren, göğüs kafesi, tükürük bezlerinin doğru, orta hat boyunca kesme, ve makas kullanın. Trakea Açığa. Trakea çevre dokulara çıkarmak için forseps kullanın.
3. Trakea altında 200 mcL pipet geçirin. Tek elle Holding ucu hafifçe vücuttan trakea yukarı kaldırın ve uzak.
4. Platform 180 ° döndür. Trakea yoluyla ciğerlerine Hindistan Mürekkep enjekte etmek için 50 ml şırınga kullanın. Güçlü bir direnç hissedene kadar mürekkep ile akciğerler tamamen şişirmek.
5. Trakea kesmek için makas kullanın. Slayt, akciğerlerin altında forseps bir çift ve onları farenin dışarı çıkarın. Akciğerlerde su 1L beher kısaca durulayın.
6. Kimyasal bir davlumbaz, Fekete çözüm 5 ml cam sintilasyon içeren bir flakon için akciğerlere transfer. Tümör dokusu, birkaç dakika sonra siyah akciğerler üzerindeki beyaz nodüller olarak ortaya çıkacaktır. Tümörler şimdi sayılır ve süresiz Fekete çözümü olarak saklanabilir.

4. Görüntülenmiştir Akciğerler Temsilcilik Metastazları

1. Burada, meme karsinom hücre hattı 4T1 ile enjekte edilen farelerden alınan akciğerlerin tümörler gösteren beyaz lekeler gösteriyor. Bir IRF8 dominant-negatif mutant K79E ile transfekte 4T1 hücreleri enjekte edildi Fare, tümör hücrelerinin gelişmiş metastatik potansiyelini gösteriyor.
2. Bu görüntüler CTL evlatlık transfer immünoterapi etkinliği bir histolojik analiz göstermektedir. Tümör taşıyan farelere enjekte edildi sarı oklar (A) ile gösterilir, 6 gün sonra birden fazla tümörler gösterdi. Tümör spesifik T hücreleri ile enjekte edilen farelerin, diğer taraftan, tümörler (B) bir azalma gösterdi.
3. Aynı deneyde, Hindistan mürekkep tedavi CTL evlatlık transferi etkinliğini ölçmek için basit bir yol verir. Burada, tümör taşıyan akciğerler üzerindeki beyaz tümör nodülü CTL evlatlık transferi başarıyla geçirmiş ve nodüller sayma akciğerler açıkça ayırt bir dereceye kadar izin verirhistoloji ile kantitatif mümkün değildir.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. Deneysel deneysel tümör metastazı ve CTL adaptif transfer immünoterapi fare modeli şeması. Kırmızı nokta, tümör hücreleri ve yeşil noktalar CTL'lerin göstermektedir.

Şekil 2 IRF8 fonksiyonunun bozulması, tümör hücrelerinin metastatik potansiyeli geliştirilmiş . Fare meme karsinom hücre hattı 4T1 stably vektör (4T1.Vector) veya vektör bir IRF8 dominant-negatif mutant K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16) ifade ile transfekte edildi. Tümör hücreleri fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Tümör taşıyan akciğerleri tümör nodülü görselleştirmek Türkiye mürekkep ile şişirildi. Tümör nodüller kolaylıkla siyah akciğer dokusunda arka plan üzerinde beyaz lekeler olarak görülür.

Şekil 3 CTL evlatlık transfer immünoterapi etkinliğini histolojik analiz. Fare sarkom hücre hattı CMS4-met fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Üç gün sonra, tuzlu su (A) veya tümör-spesifik T hücrelerinin (B) Tümör taşıyan farelere enjekte edildi. Akciğerler geleneksel H & E histolojik boyama tarafından CTL tedavi altı gün sonra incelendi. Tümör nodüller oklarla gösterilir.

Şekil 4 Hindistan mürekkep enflasyon tümör nodülleri Görselleştirme. Fare sarkom hücre hattı CMS4-met fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Üç gün sonra, serum fizyolojik (kontrol) veya tümör-spesifik T hücreleri (CTL) Tümör taşıyan farelere enjekte edildi. Akciğerler, ondört gün CTL tedavi sonra incelendi. Tümör nodülü olan beyaz noktalar, kolay CTL tedavinin etkinliğinin ölçümü için izin verir.

Malzemeler