In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Özet

Yumurtalık kanseri Ortotopik hayvan modellerinde daha iyi insan hastalığı çoğaltmak ve bu nedenle kanser progresyonu ve tedaviye tümör yanıt anlayışımızı geliştirmek. Bir fare modelinde lusiferaz ifade over tümör hücrelerinin bir İntrabursal enjeksiyon alır. Tedavi ağızdan sonda ile yönetilmektedir. Tümör büyüme izlenir In vivo Görüntüleme sistemi.

Özet

İnsan kanser ve tedaviye yanıt ortotopik hayvan modellerinde daha iyi temsil edilmektedir. Bu makale, yumurtalık kanseri ortotopik fare modelinde, in vivo görüntüleme sistemi kullanarak gerçek zamanlı olarak ilaç tedavisine yanıt tümör hücresi davranış oral ilaçlar teslim ve izleme ile kanser tedavisi gelişme açıklamaktadır . Bu ortotopik modeli, lusiferaz ifade over tümör hücrelerinin her yumurtalık içine fare bursa içine doğrudan enjekte edilerek topikal olarak uygulanır. D-luciferase, ateşböceği lusiferaz bir substrat enjeksiyon üzerine, lusiferaz ifade hücreleri biyoparlaklık sinyaller oluşturur. Bu sinyal in vivo görüntüleme sistemi tarafından tespit edilir ve bireysel hayvanlarda tümör büyümesini, dağıtım ve regresyon izleme non-invaziv bir araç sağlar . Maksimum doz hacmi için 10 ml / kg vücut ağırlığı mide doğrudan teslim edilmek üzere bir ağızdan sonda ile ilaç yönetimi sağlar ve klinik tedavilerde ilaçlar teslim yakından benzer. Bu nedenle, teknikleri, burada, yumurtalık kanseri, oral ilaç teslimat ve in vivo görüntüleme ortotopik fare modeli geliştirme açıklanan insan yumurtalık kanseri ve tedavi daha iyi anlaşılması için yararlı olur ve bu hastalık hedefleyen artıracaktır.

Protokol

Over Tümör Hücreleri I. Hazırlık

1. Grow kültür lusiferaz ifade yumurtalık kanseri hücre hatları. Lusiferaz Kaynakları Firefly, Renilla, ya da diğer türler olabilir. Floresan proteinleri ifade Hücreler de kullanılabilir. Bu gösteri için ateşböceği lusiferaz ifade yumurtalık kanseri hücre hattı, OVCAR5, kullanın.
2. Rutin hücre kültürü tekniği kullanılarak Hasat hücreleri.
3. Fosfat hücre süspansiyonu (10.000 hücre / mcL) enjeksiyon saatine kadar buz üzerinde tamponlu salin (PBS) tutun.

II. İntrabursal Enjeksiyon

Bu prosedür, ikinci bir kişiden yardım gerektirir. Tüm cerrahi işlemler aseptik koşullarda yapılmaktadır. Bu cerrahi kıyafetleri giyen ve steril cerrahi aletler, şırınga ve iğneler kullanarak içerir.

1. 3 mL ketamin hidroklorür (100 mg / ml), 1.6 ml (100 mg / ml) ksilizin hidroklorür, acepromazine (10 mg / ml) 1.5 ml ve 20 ml% 0.9 sodyum klorür karıştırılarak anestezik çözüm hazırlayın.
2. Hayvan kimlik numarası ve gözlemlenebilir sağlık kontrol edin. Ketamin ksilizin-acepromazine hazırlanmış bir doz hacmi 8 ~ 9 ml / kg vücut ağırlığı (BW) ile intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi ile hayvan anestezisi.
3. Hayvan hayvanın arka pençeleri forseps veya parmak ile ayak tutam yaparak kabul edilebilir bir ova anestezi altında olduğunu onaylayın. Pedal refleks varsa, hayvan bu prosedüre tepkisiz kadar derin bir anestezi düz bekleyin.
4. Hayvan dorsal tarafına kadar steril bir gazlı bezle başını dönük ve kuyruğu size doğru yatırın. Yumurtalıkların üzerinde sol veya sağ ve orta hat kesi noktasında yer almaktadır. Kesi noktada% 70 alkol ile kürk Tıraş veya ıslak.
5. Forseps kullanılarak ıslak cilt kaldırın ve makas dorsomedial konumda ve doğrudan over yağ yastığı üzerinde küçük bir kesi yapmak. Over yağ yastığı periton duvar yüzeyinin altında görünür olmalıdır. Fat pad, onu çevreleyen koyu pembe doku aksine beyaz renk ile kolayca tanınabilir.
6. Periton duvarını kaplayan yavaşça kaldırın ve yukarıda açıklandığı gibi küçük bir kesi (5).
7. Orta hat kesi bitişik batırılmış steril tuzlu gazlı bez yerleştirin. Over yağ yastığı bulun ve yavaşça dışarı çekin ve gazlı bez üzerine geri kalanı. Bulldog klip ile yağ yastığı sıkma yumurtalık sabitleyin. Diseksiyon mikroskobu, pozisyon altında yumurtalık bursa giden yumurtalık tübül viraj içine iğne (30 gauge, G) ekleme için izin vermek. Iğne uygun konuma takıldığında, bursa altında görünür olmalıdır.
8. Şırınga enjeksiyon yerinde konumlandırılmış bursa ve yumurtalık arasındaki 5 mcL hücre süspansiyonu enjekte etmek için şırınga pistonu yavaşça itin. Bu adım, iki kişi gerekir. Bir kişi, diğer kişi iğne konumlandırma koruyor pistonu iter. Ponksiyon sitesi mühür hızlı iğne çıkarın ama bursa ve tübül gözyaşı hafifçe yeterli değil. Bursa uygun enjeksiyon biraz şişmiş olarak görünmelidir.
9. Bulldog klipten yağ yastığı bırakın ve periton boşluğuna yavaşça üreme yolları ve yağ yastığı arka değiştirin. Alt astar üzerine üst periton astar çekerek vücut duvarı yavaşça kapatın. Cerrahi zımba veya yara klipleri ile cilt kapatın.
10. Kendi kafesine geri kurtarma hayvan koyun ve hipotermi önlemek ve kurtarma hızlandırmak için güvenli bir ısı kaynağı sağlar. Monitör, solunum hızı ve kolaylığı, kas tonusu dönüş, ve gönüllü bir hareket yeteneğine. Bu kurtarma yolunda ilerlemesi tüm iyi göstergeleridir. Staples veya yara klipleri, 7 gün veya daha fazla cerrahi sonrası silinebilir.

III. Ağızdan sonda İdaresi

1. 18 ~ 20 G sonda ile iğne ya da beslenme tüpü yuvarlak uçlu kullanın. Gavaj iğne hayvanın başının ucundan son kaburga mesafe daha uzun olmamalıdır.
2. Hayvanların kimlik numarası ve gözlemlenebilir sağlık kontrol edin. Başparmak ve işaret parmakları ile omuzlar üzerinde cilt tutarak yavaşça berduş hayvan. Kısıtlama, yolun her iki tarafında ve dışarı uzatılabilir ön bacaklar için yeterli sağlam olmalıdır. Hayvan iğne kavramak mümkün olmamalıdır.
3. Yavaşça parmağı ile boyun ve yemek borusu ile düz bir çizgi oluşturan, hayvanın kafasını geri çekin. Hayvanın içinde başparmak ile sırt desteği.
4. Yavaşça ve kuvvet olmadan, ağız ve dil üzerinden iki tarafında gavaj iğne takın. Tek bir düzgün hareket, iğne ağız ve yemek borusundan aşağı çatı karşı geçmelidir. Yerçekimi toplantı direnişle karşılaşmadan iğne rehberlik etmelidir. Herhangi bir resistan varsace, iğne kaldırmak ve yeniden başlatın. Hayvanın gag ve yutma refleksinin yerleştirilmesi sırasında tetiklenen olabilir. Ancak, hiçbir direniş ya da hayvan nefes nefese olması gerekir. Hayvan iğne burun delikleri ve göğüs hareketi kontrol ederek ne zaman nefes olduğunu emin olmak için çok önemlidir.
5. Yavaş yavaş doz hacmi dağıtmak için şırınganın pistonu itin.
6. , Yemek borusu takıldı yolu olarak aynı açı ve yolağı gavaj iğne yavaşça çıkarın.
7. 5 ~ 10 dakika, kafes ve solunumu ve davranış hayvan dönün.

Vivo Görüntüleme IV.

Kaliper Yaşam Bilimleri İntrabursal boşluğuna enjekte edilen hücrelerin davranışlarını izlemek için kullanın. Bu sistemi kullanarak deneyler genellikle tümör implantasyonu zaman 4 ~ 16 haftalık bir zaman dilimi var.

1. D-luciferase (ateşböceği lusiferaz substratı) 5 ~ 20 mg 1 ml PBS içinde eriterek ve sterilizasyon için 0.22 mikron zarından filtreleme çözümü hazırlayın.
2. Indüksiyon odasına oksijen ve isofluran gaz hem çevirerek şarj edin. Sadece indüksiyon odasına gaz akışı AÇIN. Hayvanlar yansıması için hazır olana kadar izofluran debisi düşük bir düzeyde tutulur.
3. Hayvanların kimlik numarası ve gözlemlenebilir sağlık kontrol edin. Isofluran gaz ücret indüksiyon odasında hayvan yerleştirin.
4. Hayvan, hayvan anestezi göründüğünde odasından çıkarın. 200 mcL ip enjeksiyon yoluyla 30 G iğne kullanılarak hazırlanmış luciferase çözüm sunun. Çalışma boyunca luciferase enjeksiyon ve görüntü performansı arasındaki zaman tutarlı tutmak için enjeksiyon zamanını kaydetmek için önemlidir.
5. Indüksiyon odasına enjekte luciferin-hayvan arkasına yerleştirin.
6. Görüntüleme sistemi uygun ayarları ayarlayın. Ilk hayvan görüntü almadan önce sistemi başlatmak için emin olun.
7. Indüksiyon odasına gaz akışı KAPATIN ve görüntüleme odasına gaz akışı AÇIK konuma getirin.
8. Anestezi hayvan dorsal veya ventral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Uygun anestezi indüksiyonu korumak için bir burun konisi hayvanların burun yere emin olun. Hayvan yeşil aydınlatma tarafından belirtildiği gibi "faiz grid noktası" içinde olduğundan emin olun.
9. Odanın kapısını kapatın ve uygun bir zamanda görüntü elde. Zaman kinetiği tarafından tespit edilebilir.
10. Hayvan görüntüleme odasından çıkarın ve onun kafes içine geri koyun. "İntrabursal Enjeksiyon" anlatıldığı gibi hayvanların kurtarma izleyin.

V. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 ortotopik bir fare modeli over tümör hücrelerinin Vivo görüntüleme. Lusiferaz ifade OVCAR5 hücreleri sağ yumurtalık intrabursally enjekte edilen ve zaman içinde görüntülenmiş. Görüntüler IVIS Spectrum görüntüleme sistemi kullanarak enjeksiyon gün sonra 13 (solda), 17 (orta) ve 22 (sağ) alınmıştır. Dorsal yüzü üst panelinde gösterilir ve ventral tarafta alt panel. Not tümör hücrelerinin peritoneal yayılım enjeksiyonu takiben 22 gün.

Fox Chase Kanser Merkezi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Tartışmalar

Yumurtalık kanseri tüm jinekolojik maligniteler ¹ arasında önde gelen ölüm nedenidir. Bu hastalığın yüksek ölüm oranı, geç tanı ve güvenilir tanı yöntemleri ² eksikliği büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Ayrıca, geleneksel kemoterapi genellikle kanser ³ chemoresistance ve nüks karşılaşır. Bu nedenle, yeni terapötikler bu hastalığın etkin bir şekilde hedef gereklidir. Insan yumurtalık kanseri hedefleyen yeni tedavi geliştirme, temsil eden bir hayvan modeli geliştirmek için kritik öneme sahiptir.

Ortotopik bir hayvan modeli, metastaz ortak sitesi temsil eden), 2 tümör oluşumunu birincil site üretir), geleneksel xenograftlarının modellere göre avantajları şöyle: 1. (örneğin, subkutan ya da tümör hücrelerinin intraperitoneal enjeksiyonu), ve 3), tümör hücrelerinin sağlar uygun mikroçevresinin ^{4, 5, 6, 7, 8} ile etkileşim. Kemirgenler, yumurtalık çevreleyen ve yumurtalık sürekli eşsiz bir bursal membran var. Kemirgen Bu benzersiz anatomisini orthotopically over tümör hücrelerinin enjeksiyonu sağlar. Böylece İntrabursal zarının içinde büyüyen ve tümör ilerledikçe periton boşluğuna yayılan Intrabursally enjekte over tümör hücrelerinin, insan hastalığına benzer şekilde davranırlar. Hücreleri stabil bir şekilde ifade luciferases veya floresan proteinlerle enjeksiyon da, gerçek zamanlı olarak tümör hücrelerinin izleme davranışı sağlar. Bioluminescent ve / veya floresan görüntüleme teknolojisi sayesinde, zaman ve non-invaziv ^{bir şekilde 9, 10,} 11 çalışma tümör büyümesi, dağıtım ve regresyon uzun bir süre boyunca sürekli görüntü tümör hücreleri yapar.

Ortotopik modeli kuran, hızlı enjeksiyon üzerine bursa iğneyi çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Ani iğne mühürler ponksiyon sitesi çıkarılması ve enjekte edilen hücrelerin dışarıya sızmasını önler. Ancak, aynı zamanda, hareketin bursa gözyaşı nazik olmalıdır. Enjeksiyon sırasında sızıntı meydana gelirse, karın içinde tohum hücreleri neden ve olası erken yumurtalık dışına yayılan çalışma, yani bulandırabilir. Bu durumda, belli bir hayvan kaydedildi ve periton tedavisi ya da alternatif sonraki analizlerde elimine önce birden fazla tümör sitelerinin gelişimi için takip. Ağızdan sonda gerçekleştirmeden önce, bu hayvanın başının ucundan son kaburga ölçerek gavaj tüpün uzunluğu kontrol etmek için kritik öneme sahiptir. Hayvan burnu tüp işaretlemek için yararlı olur ve bu işareti geçmiş tüp geçemiyor. Bu işareti geçmiş tüpün yerleştirilmesi, mide perforasyonu neden olabilir. Tüpün uzunluğu Belirlenmesi 20 kapsamında gr ağırlığında küçük hayvanlar veya hayvanların özellikle önemlidir. Yemek borusundan aşağı gavaj iğne yerleştirilmesi üzerine, hiçbir direniş ya da hayvan mücadele olmalıdır. Bu reflüye yol ve daha sonra yanlış doz hacmi teslim yanı sıra hayvan stres ekleyerek gibi çözeltisi veya süspansiyonu çok hızlı bir şekilde yönetmek için önemlidir. Zaman zaman karşılaştırılabilir görüntüleme sonuçlar için, lusiferaz substrat ve görüntüleme enjeksiyonu arasındaki zaman tutarlı tutmak için arzu edilir. Substrat enjeksiyondan sonra dizi görüntü sinyalleri kinetiği dikkate alarak ve zaman atlamalı tespit edilebilir. Yumurtalık kanseri gelişimi ve yayılması daha iyi anlaşılması ve değerlendirilmesi, sonuçta, bu ölümcül hastalığı olan hasta sonucu artırabilir yeni tedavi rejimleri, yumurtalık kanseri, oral ilaç teslimat ve in vivo görüntüleme ortotopik fare modeli geliştirilmesi gerekli teknikleri.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine Hydrochloride	Vedco, Inc.	Not Available
Xylazine Hydrochloride	Lloyd, Inc.	Not Available
Acepromazine	Vedco, Inc.	Not Available
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796