İnflamatuar Plak Kızılötesi Floresans (NIRF) İntravasküler Moleküler Görüntüleme, Multimodal Yaklaşım civarında in vivo Ateroskleroz Görüntüleme

Özet

Biz, ayrıntılı 2-boyutlu plak biyoloji intravasküler moleküler görüntüleme için yeni bir yakın-kızılötesi floresan (NIRF) kateter In vivo. NIRF kateter varlığı plak hevesli devreye sokulabilir ve hedefli NUR fluorochromes raporlama inflamasyon gibi temel biyolojik süreçlerin oluşturulabiliyor. Kateter klinik mühendislik ve güç gereksinimleri kullanır ve insan koroner arterlerin uygulama için hedeflenen. Aşağıdaki araştırma çalışması bir roman kullanan bir multimodal görüntüleme stratejisi açıklanmıştır In vivo Intravasküler NIRF görüntü kateter ve proteolitik aktif iltihaplı tavşan atheromata inflamatuar plak ölçmek.

Özet

Yaralanma vasküler yanıt, lipid yüklü içi luminal plak, düz kas hücre proliferasyonu ve damar lümen daralması ilerici birikimi giden damar duvarının içinde makrofajların birikimi ile tetiklenen çok iyi yönetilen bir inflamatuar yanıt. Rüptürü altında yatan akut miyokard infarktüsü vakalarının çoğunluğu eğilimli gibi hassas plakların oluşumu. Karmaşık moleküler ve hücresel inflamatuar kaskad endotel ve düz kas hücreleri, T lenfositler ve makrofajlar ve parakrin etkileri işe yönetti. ¹

Ateroskleroz Moleküler görüntüleme, enflamasyon ve diğer biyolojik süreçler in vivo görüntüleme sağlayan önemli bir klinik ve araştırma aracı haline gelmiştir . Son zamanlarda yaşanan bazı örnekler, yüksek riskli plaklar hastalarda tespit ve ateroskleroz pharmacotherapeutics etkilerini değerlendirmek için yeteneğini ^göstermek 4 moleküler görüntüleme yaklaşımları (özellikle MR ve PET) bir dizi biyolojik yönlerini karotis gibi büyük damarların görüntüsü arterler, koroner arterleri görüntüleme için yetersizdir seçenekleri var. ² yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme stratejileri gelişi, özellikle yakın-kızılötesi floresan (NIRF) devreye sokulabilir floresan problar ile birleştiğinde, gelişmiş hassasiyet ve yeni intravasküler stratejilerinin geliştirilmesi yol açtı insan koroner ateroskleroz biyolojik görüntüleme artırmak için.

Kızılötesi floresan (NIRF) civarında moleküler görüntüleme, optik kontrast madde ya da floresan prob teslim tespit edilebilir NUR penceresinde floresan yayar, fotonların bir kaynak olarak belirli bir bant genişliği (650-900 nm) ile uyarma ışık kullanan uygun bir emisyon filtresi ve yüksek hassasiyet şarj çiftli kamera kullanarak. NUR ışık, görünür ışık aksine, doku içine derinlemesine nüfuz eder, hemoglobin, yağ ve su gibi endojen foton emiciler tarafından belirgin bir şekilde daha az zayıflatılmış ve NUR pencere azalmış otofloresans nedeniyle yüksek hedef-arka oranları sağlar. NUR 'penceresi içinde Görüntüleme in vivo görüntüleme için potansiyel önemli ölçüde ^{artırabilir.} 2,5

İnflamatuar sistein proteazlar aktive NIRF probları ¹⁰ kullanılarak çalışıldı ve aterogenezde önemli rol oynamaktadır edilmiştir. Ekstraselüler matriks bozulması ile, sistein proteazlar ilerlemesini ve komplikasyonları ateroskleroz ⁸ önemlisi katkıda bulunur. Özellikle, sistein proteaz, katepsin B, son derece olarak ifade edilir ve, deneysel Fare ve sıçan, tavşan ve insan atheromata makrofajlar ^ile colocalizes Ayrıca 3,6,7, plaklarda katepsin B aktivitesi önceden 1 açıklanan kullanarak in vivo olarak algılanır. -D ile birlikte birden fazla NUR fluorochromes (VM110/Prosense750, eski / em 750/780nm VisEn Tıp, Woburn, MA) ile derivatized poli-lizin polimer omurgası oluşan bir enjektabl nanosensor ajan intravasküler yakın-kızılötesi floresan ^{teknolojisiyle} 6 başlangıçta güçlü bir molekül su verme bu ^sonuçları 10 Aşağıda NIRF sinyal önemli amplifikasyon katepsin B (plak makrofajlar colocalize bilinen), ayrı fluorochromes sistein proteazlar tarafından enzimatik parçalanma hedef . İntravasküler kullanılan roman 2D intravasküler NIRF kateter NUR floresan sinyal algılama iltihaplı plak katepsin B aktivitesi in vivo algılama geometrik olarak doğru, yüksek çözünürlüklü sağlar.

Ateroskleroz gibi önceden 1-D spektroskopik yaklaşımın aksine kateter tabanlı 2B NIRF görüntüleme, in vivo moleküler görüntüleme, ⁶ yeni ve umut verici bir araç vasküler inflamasyon tespit makrofaj zengin plak proteaz aktivitesi artar kullanır. ^11,12 Aşağıdaki araştırma protokolü görüntü NIRF 2-boyutlu bir intravasküler kateter kullanımı açıklanır ve plak biyoloji temel yönlerini kullanarak plak yapısını karakterize. Bu, anjiyografi ve intravasküler ultrason (IVUS) da dahil olmak üzere mevcut klinik görüntüleme teknolojileri ile entegre bir çevrilebilir platform inflamatuar atheromata ayıran benzersiz ve yeni bir entegre multimodal moleküler görüntüleme tekniği sunuyor ve insan ölçekli koroner arterlerde intravasküler NIRF sinyallerin algılanmasını sağlar. .

Protokol

In vivo Hayvan Modeli: Deneysel Aortoiliyak Ateroskleroz Üretimi

1) Temel Anjiyografi ve Balon denüdasyon

1. Bazal anjiyografi ve balon denüdasyon elde etmek için önce, Yeni Zelanda beyaz tavşanı, yüksek kolesterol (% 1), 1 hafta boyunca diyet beslenir. Bu hayvan tavşanlarda aorto-iliacs damarları hiperlipidemik, balon-yaralanma modeli benzer inflamatuar hücreler (makrofajlar taşıyan iltihaplı ateroskleroz üretir insan koroner arterlerin (2.5-3.5mm) ve 2) aynı kalibre) 1 olarak translasyonel alaka için kullanılmaktadır insan ateroskleroz) ve molekülleri (katepsinler).
2. Kolesterol besleme, hayvan, propofol ve ketamin ile anestezi. Tek inç ventral orta hat boyun insizyonu bir boyutu 15 neşter bıçak kullanarak kullanılarak yapılır. Künt diseksiyon teknikleri kullanarak, trakeanın sağ tarafında fasya altındaki kasların maruz kalmaktadır. Sol sternocephalicus kas, bağ dokusu kavşak boyunca ayrılır ve sağ karotis arter maruz kalmaktadır. Arter vagus siniri ayrılır. Proksimal ve distal sütür döngüler retraksiyon ve oklüzyon için izin arter üzerine yerleştirilir. 1 2mm için arteriyotomi eğimli 5 Fransız (1.67mm dış çapı) vasküler kılıf takılı ve heparin (1000μ/mL ~ 150units/kg) kılıf ile intra-arteriyel uygulanan üzerinden yapılır.
3. Kontrast madde (Ultravist) sonra bir kontrol anjiyogram distal aorta ve her iki iliak arterlerden elde etmek için 2 saniyelik bir süre içinde (1 2mL) enjekte edilir.
4. Iliofemoral arter ve aort sonra endotelyal soyulma yaralandı. Standart floroskopi yöntemlerinin kullanılması, distal iliofemoral arter 3FR Fogarty embolektomi kateteri yerleştirilir ve 0,3 0,5 kontrast cc (% 50 tuzlu contrast/50%) ya da hava ile şişirildi. Kateter daha sonra kendi şişirilmiş devlet sol renal arter proksimalde take-off sağ iliyak ve distal aorta boyunca bir mesafe geri çekilir. Balon denüdasyon ardından, anjiyografi, damar açıklığının belge tekrarlanır. Anjiyografi sonrasında, tüm kateterler ve kılıflar kaldırılır ve proksimal sağ karotis arter ligasyonu, kas ve fasya 4 / 0 emilebilir sütür ile sütüre, ve cilt insizyonu 4 / 0 emilmeyen dikiş ile kapatıldı.
5. Hayvan daha sonra tek doz antibiyotik (sefazolin, 0.5 gram IM) yönetimi ile kurtarmak için izin verilir. Ağrı kesici ilaçlar da dahil olmak üzere 0.01 mg / kg buprenorfin IM (gerektiği kadar günde iki kez). Hayvanlar daha sonra, 4 hafta sonrası balon denüdasyon için% 1 kolesterol üzerinde devam etmektedir. Haftada 5, hayvanların% 0.3 kolesterol diyeti geçiş.

Tavşan Atheromata Entegre Multi-modal Görüntüleme

2) proteolitik aktif iltihaplı plak enjektabl nanosensor kullanarak etiketleme; Anjiyografi, intravasküler ultrason (IVUS), ve in vivo intravasküler NIRF görüntüleme Tavşan Aterom

1. Görüntüleme için önce balon yaralanma ve 24 saat sonra sekiz hafta, intravenöz 500 nmol / kg Prosense/VM110 (Perkin Elmer) ile tavşan kulak damar yoluyla enjekte edilir.
2. Yirmi dört saat, enjeksiyon sonrası hayvanlarda anestezi ve arteriyel erişimi (adım 1.2 'ye bakınız), sol karotis arter yoluyla elde edilir. İntra-arteriyel heparin (150 ünite / kg) uygulanır. Temel anjiyografi yukarıdaki gibi elde edilir.
3. IVUS kateter bir klinik koroner arter yetenekli 0.014 inç tel üzerine yüklenir ve kılıf içine eklenir. Floroskopik kullanarak, tel radyoopak ucu sağ iliyak arter distalde bir konuma sahiptir. IVUS kateter sonra standart bir klinik monoray tekniği kullanılarak proksimal iliak artere ileri düzeydedir.
4. A 100 mm geri çekilme başlatılır ve görüntüleri kaydedilir. Geminin Boyuna rekonstrüksiyon elde edilir ve luminal plak tanımlanır.
5. NIRF kateter ^11,12 0.014 inç tel (monoray sistemi) üzerine yüklenir ve sağ iliyak artere kateter dikkatle kılıf ve görüntüleme kafası takılı distalde konumlandırılmış.
6. Çoklu otomatik pullbacks (1 mm / sn boyuna geri çekilme, dakikada 30 mermi) yapılır ve ateroskleroz bölgeleri içinde floresan sinyalleri belirtilmiştir. Görüntü kaydedilir ve sinyal aralığı dayalı uygun ölçekleme ve pencereleme ile daha fazla işlem gerçekleştirilir.

3) Ötenazi ve ex vivo aorto-iliyak doku izolasyonu

1. Ötenazi ötenazi ajan 1 cc (390mg sodyum pentobarbital ve 50 mg fenitoin sodyum çözümü), intravenöz, tek bir enjeksiyon ile gerçekleştirilir.
2. Inferior vena kava kan netleşene kadar arter ağacı% 0.9 serum fizyolojik ile perfüze. Aterosklerotik aorta ve iliak arterler tespit ve çevre dokulardan disseke vardır. Buna ek olarak, li küçük 2 x 2 cm adetver, böbrek, dalak ve kalp de elde edilir.
3. Intravasküler NIRF görüntüleme kateter ile ex vivo NIRF görüntüleme bu aşamada yapılabilir. Geminin uzun ve görüntüleme başı sağ iliyak arter veya çatallanma getirilinceye kadar NIRF kateter proksimal aort içine yeniden eklenir. Çoklu otomatik pullbacks (bkz 2.6) yukarıdaki gibi yapılır.

4) disseke aorta ve iliak arterlerden ex vivo Floresans Yansıtma Görüntüleme (CUMA)

1. Disseke doku yerleştirilir ve 10-20 cc serum fizyolojik FRI analizleri (Kodak Görüntü İstasyonu 4000mm Pro, Carestream Health, Inc.) Taşınır.
2. Aorta, iliak damarlar yaklaşık gerçek zamanlı uzunlukları uzatılmış ve çoklu dalga boylarını [beyaz ışık, yeşil floresan kanal (eski 495 nm, em 515 nm), Cy5 (eski 565 nm, em 670 nm) ve Cy7 (eski görüntüler elde edilir 650 nm, em 760 nm)] kanal. Pozlama süreleri bir dizi her dalga boyu için kullanılmaktadır (0,1-30sn) ve elde edilen görüntüler DICOM ya da daha fazla analiz için 16-bit ölçeklendirilmemiş TIFF dosyaları olarak ihraç edilmektedir. Pozitif ve negatif kontroller olarak, organların (karaciğer, dalak, böbrek ve kalp) benzer kanalları ve pozlama süreleri görüntülü.
3. Yakın-kızılötesi kanal (780nm +) artış sinyali Alanları aterosklerotik arterlerde belirtilmiştir.

Kesit ve immünhistokimyasal analiz için 5) Doku Gömme

1. Alanları normal (olmayan yaralı doku, yani sol iliyak arter) ve plak alanlar tespit edilir ve doku küçük 5-10 mm halkaları OCT (Optimum Kesme Sıcaklık) medya gömülü. Bloklar kesit kadar -80 C'de saklanır.
2. Kesit ve immünohistokimyasal analizler için standart teknikler yapılmaktadır. Hematoksilen ve eosin Ram-11 ve Katepsin B boyama yapılır, leke.

Analizler ve multi-modal Görüntü Entegrasyonu (Anjiyografi, IVUS, NIRF ve CUMA)

6) NIRF ve CUMA görüntü İşleme

1. DICOM NIRF ve CUMA görüntüleme verileri içeren dosyalar (yakın kızılötesi 780 nm kanal alınan) pullbacks sırasıyla, MATLAB ve Osirix yazılımı kullanarak işlenir. Uygun sinyal yoğunluğu tam kapsamlı görüntülemek için pencere elde edilir. Final görüntüleri TIFF dosyaları olarak ihraç edilmektedir.
2. Dosyalar standart görüntü işleme yazılımı (Davetli kullanılabilir) alınır. Görüntüler referans noktaları (anjiyogram, iliak bifurkasyon ve renal arter yani vertebra) göre hizalanır. Normal damar ve plak alanları belirlenmiştir.
3. Ilgi (ROI) Bölgeler elle takip (plak normal doku ve alanlar için) ve sinyal intensitesi CUMA ve NIRF görüntülerin her ikisi için de sırasıyla Osirix ve MATLAB kullanılarak elde edilen ortalama. Uygun izleme kılavuzu için, geminin boyuna IVUS görüntü kullanılır ve normal damar ve plak tanımlanması için kolayca tanınırlar.
4. Hedef arka plan (KAZ) oranları plak bölgeleri için hesaplanır.

Temsilcisi Sonuçlar:

Yukarıdaki protokol tamamlanmasından sonra, biz tanımlayabilir ve aorta ve iliak damarlar içinde inflamatuar plak artar katepsin proteaz faaliyet alanları karakterize. (Prosense/VM110) devreye sokulabilir nanosensor enjeksiyon bize proteolitik aktif plak tanımlamanıza olanak sağlar. Bu kadar parlak görünür ya da yakın kızılötesi kanal (750 nm) CUMA kullanarak görüntülü yoğun bölgeleri sinyal. NIRF pullbacks yüksek sinyal FRI yoğunluğu ve NIRF sinyalleri anatomik kaydı izin IVUS hizalanmalar ile ilişkilidir. CUMA ve NIRF elde Hesaplanan plak TBR (NIRF TBR 4.2 ortalama, CUMA TBR 2.9 ortalama bkz. Şekil 3) benzer bulunmuştur. Parlak plak immünohistokimyasal analizi, RAM-11 ve plak alanları (veri gösterilmemiştir) Katepsin B aktivitesi yoğun varlığını doğrulamaktadır.

Şekil 1. ^11,12 özel dahili kateter bir optik fiber (125 mikron çaplı ev sahipliği oluşur 1D NIRF algılama yaklaşımı ⁶ klinik potansiyelini genişletmek için 2D NIRF Kateter şematik bir roman damar içi görüntüleme için 2-B NIRF kateter inşa edilmiştir. polietilen borular: 2.9F) 750 nm lazer uyarma kaynağı kullanarak aydınlatır. Lazer ışığı, lif eksenine göre 90 derecelik bir açıyla yayılır. Sistem gerçek 2D görüntü elde etmek için birlikte 360 ​​derece görüntüleme ve boyuna geri çekilme sağlamak için iki otomatik motorlar (rotasyon ve translasyon) kullanır. Görüntüler referans 11 izni ile kullanılır.

Şekil 2. Nanosensor şematik gösteren proteaz aracılı aktivasyon, Prosense/VM110. Referans 10 izni ile kullanılmaktadır Görüntü.

Şekil 3. In vivo ve ex vivo Plak TBRs (arka plan oranları hedef)

Tartışmalar

Iltihaplı yüksek riskli ya da hassas plak, miyokard enfarktüsü çoğunluğu için muhtemelen sorumludur. Semptomların başlamasından önce bu plakların tanımlama sonuçlarını tahmin etmek ve tıbbi tedavinin yönlendirilmesinde önemli klinik hem de etkileri vardır. X-ray anjiyografi gibi konvansiyonel koroner arter görüntüleme yöntemleri genellikle luminal daralma karakterizasyonu ziyade, yüksek riskli non-stenotik lezyonlar genellikle altta yatan biyolojik profilleri aydınlatıcı odaklanmak. İntrava...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prosense 750	Visen Medical	VM110	500 nmol/kg IV injection
Heparin Sodium	APP Pharmaceuticals	401586D
Cephazolin	NovaPlus	46015683
Lidocaine HCL 2%	Hospira Inc.	NDC 0409-4277-01
Buprenorphine	Bedford Laboratories	NDC 55390-100-10
Ketamine	Hospira Inc.	NDC 0409-2051-05
High Cholesterol Diet 1%	Research Diets	C30293
HIgh Cholesterol Diet 0.3%	Research Diets	C30255