Memeli MSS Optik Sinir transeksiyonu sonra Deneysel İşlemler Yöntemleri

Özet

Optik Sinir transeksiyonu yetişkin MSS yaralanma yaygın olarak kullanılan bir model. Bu model, küresel retina hedef ya da doğrudan hedef, retina ganglion hücrelerinin yaralı nöronal nüfus bir dizi deneysel manipülasyon yapmak için idealdir.

Özet

Retina ganglion hücrelerinin (RGCs) MSS nöronlar olduğunu retina optik sinir yoluyla beyne görsel bilgi çıktı. Optik sinir göz yörüngesinin içinde erişilebilir ve tüm RGC nüfus aksonlar tamamen kesme, (axotomized) transeksiyon olabilir. Optik sinir transeksiyonu yetişkin MSS ^1-4 apoptotik nöron hücre ölümü tekrarlanabilir bir model. Bu model özellikle çekici, göz vitreus kamara göz içi enjeksiyonları ile deneysel manipülasyonlar izin retina ilaç dağıtım için bir kapsül gibi davranır çünkü. Vitreus sıvı ile kimyasal difüzyon tüm RGC nüfus üzerine hareket etmelerini sağlar. Viral vektörler, plazmid ya da kısa müdahale RNA'lar (siRNA) ^5-12 retina hücreleri enfekte veya transfect için vitreus odasına teslim edilebilir. Adeno Associated Virus (AAV) vektörleri yüksek tropizm enjeksiyon yerinde ^{6, 7, 13-15} yakın hücrelerinin% 90 yaklaşan bir enfeksiyon oranı ile, hedef RGCs için yararlı. Ayrıca, RGCs seçici hedef üstün colliculus ¹⁰ siRNA'lar, plazmid veya viral vektörler içine optik sinir ^16-19 veya enjekte vektörler kesik ucuna uygulayarak transfekte olabilir. Bu araştırmacılar, diğer seyirci nöron veya glia çevreleyen karıştırıcı etkisi olmadan yaralı nöronal nüfus apoptotik mekanizmalar çalışma sağlar. RGC apoptozis, hücre ölümü hücrelerin hızla dejenere sonra 3-4 gün postaxotomy, gecikmiş sayede ders karakteristik bir zaman vardır. Bu apoptozis de dahil yollar yönelik deneysel manipülasyonlar için bir pencere sağlar. Axotomy zaman sinir kesim hemen sonra, doğrudan transeksiyon optik sinir güdük RGCs hedef manipülasyonlar yapılmaktadır. Buna karşın, madde bir göz içi yolla teslim edildiğinde, onlar, axotomized RGCs apoptoz başlaması önceki cerrahi öncesi veya ameliyat sonrası ilk 3 gün içinde enjekte edilebilir. Bu yazıda, optik sinir transeksiyonu sonra deneysel manipülasyonlar için çeşitli yöntemler göstermektedir.

Protokol

1. Cerrahi Teknik

1. Aseptik teknik kullanılarak deneyler ve özel kurum hayvan kullanımını protokolleri takip yapılmalıdır. Canlı doku ile temas eden alet ve malzemeler (çözümleri, test maddeler, izleyiciler, iğne, vb), hayvan refahı ve çalışma üzerindeki olası olumsuz etkileri üzerinde enfeksiyon ve olumsuz etkilerini önlemek için steril olmalıdır.

2. Anestezi

1. Sıçanlar bir veteriner izofluran buharlaştırıcı sistemi kullanılarak anestezi olacaktır. Isofluran gaz buharlaştırmak için 0.8 L / dak hızında tıbbi sınıf oksijen kullanın. Ekli anestezi kutusunda hayvan koyun ve nefes yavaşladı ve hayvan oturaklı kadar izofluran konsantrasyonu% 4 çevirmeli.
2. Sonra, stereotaksik çerçeve için gaz maskesi ek gaz akışını değiştirmek ve stereotaksik aparat hayvan. Izofluran konsantrasyonu% 2 aşağı çevirin ve anestezi monitör. Büyük hayvanların (> 300g) yüksek konsantrasyonda izofluran bir gerektirebilir. Anestezi, ameliyat sırasında takip ve izofluran dozu buna göre ayarlanması gerekir. Derinlik ve nefes alma oranı sürekli olarak değerlendirilir ve derin bir ağrı olmaması için ayak tutam değerlendirme (her 5 dakikada bir) yapılmalıdır.
3. Ameliyat tamamlandıktan sonra, izofluran kapatın ve hayvan stereotaksik cihazdan çıkarılması önce birkaç dakika nefes oksijen izin. Vücut ısısı, cerrahi battaniye ve / hayvan kapsayan ya da operasyon sırasında düzenli bir ısıtma battaniye kullanarak sağlanmalıdır.

3. Göz içi Enjeksiyonlar için Şırınga Hazırlama

1. Öncelikle, göz içi enjeksiyonları gerçekleştirmek için şırınga sistemi monte edin. 10 mcL RN Gaz geçirmez 1701 Hamilton Şırınga enjeksiyon için kullanılır. Herhangi bir iğne veya şırınga ucundaki RN fındık hediye çıkarın.
2. Sıkıştırma uydurma, halkalı PFA halkalı PEEK kabına yerleştirin. Sonra şırınganın ucunu tamamen uydurma eklemek ve gevşek üstünden RN somun vida.
3. RN fındık açıklıktan, sıkıştırma uydurma içine 1 / 16 inç PEEK hortumun bir ucunu. PEEK tüp tam oturduğundan emin olun. PEEK boru sızdırmazlık halkalı sıkıştırmak için RN somunu sıkın.
4. Çift RN cam bağlaç iki ucunda 3.2 Adım gerçekleştirin. RN somun sıkma PEEK hortumun bir ucunu Çift RN cam coupler serbest ucunu takın.
5. Çekti cam mikropipet enjeksiyon sistemi için iğne ve namlu oluşturacaktır. Cam pipetler imal için 1.5 mm OD kalın duvarlı cam kapiller tüp kullanın ve cam pipet Çift RN cam coupler serbest ucunu takın. Pipet düzeltmek için RN somunu sıkın.
6. Çekti cam mikropipetler ince uçlu göz içi enjeksiyonları gerçekleştirmek için genellikle çok küçük. Uygun çaplı bir ipucu oluşturmak için, cerrahi mikroskop kullanarak, görsel rehberliği altında cam pipet ucu kırmak. Buzlu cam bir örnek slayt sonuna pipet kırmak için uygundur. Bir açıda tutun ve pipet ucu sonu yaratmak için cam buzlanma boyunca ovmak. İdeal olarak, son ucu biraz kesik olmalıdır. Bu iyi bir ipucu üretmek için birkaç girişimleri alabilir, bu nedenle kullanmadan önce birden fazla pipetler çekin.
7. Enjeksiyon sistemi, hidrolik. Bu nedenle, şırınga, PEEK boru ilintileyici, Çift RN cam coupler ve cam mikropipet kullanmadan önce madeni yağ ile doldurulmalıdır. Hamilton Şırınga A.Ş. (PRMKIT) Astar kiti kullanarak, priming şırınga mineral yağ ile doldurun. Viskoz yağ kolayca geçmesine izin için büyük çaplı bir iğne kullanın. Iğne 10 mcL Hamilton şırınga varil içinde uygun Hamilton 90030 iğne ile değiştirin. Daha sonra, mineral yağ enjekte ederken, bir mühür sağlamak amacıyla, Hamilton 90030 iğne üzerinde lastik septum yerleştirin.
8. Emişli şırınga Hamilton 90030 iğne enjeksiyon sistemi 10 mcL Hamilton şırınga varil arkasına yerleştirin. Bir mühür oluşturmak için şırınga sonuna septum sıkıca basın.
9. Pistonu yavaşça bastırın. Enjeksiyon sistemi cam elemanları ile mineral yağ geçmek, ve nihayet cam pipet dolum. Yolu boyunca herhangi bir hava kabarcığı kaldırmak için tüm yağ enjeksiyon sistemi üzerinden itin. Mineral yağ dolum şırınga çalışıyorsa sürekli hava kabarcığı oluşumunu önlemek için petrol dağıtımı ise, yavaş yavaş iğneyi çıkartın. Yedek emişli şırınga ve tekrar enjekte.
10. Tüm sistemi ücretsiz mineral yağ ve kabarcık ile dolduğunda, 10 mcL Hamilton şırınga orijinal piston yerleştirin. Piston ek mineral yağ sistemden kaldırmak için, seyahat sonuna kadar basınız. Cam mikropipet temiz ve% 70 etanol ile temiz şırınga silin.
11. Withdraw namlu 2 mcL işareti şırınga pistonu. Cam mikropipet sonunda, mineral yağ ve istenilen sıvı enjekte edilecek arasında bir tampon bölge hava ile doldurun. Pipet varil mikropipet sonunda istenilen çözüm yerleştirerek ve Hamilton şırınga pistonu çekilme doldurulabilir. Çözüm fazla 4-5 mcL bir yetişkin sıçan göz içine enjekte etmeyin.

4. Göz İçi Enjeksiyon Yöntemi: Küresel Retina Hedefleme

1. Anestezi ve güvenli stereotaksik frame (Bölüm 2 açıklandığı gibi) hayvan ile Alcaine gözün kornea topikal uyutmak için damla kullanın. Parmaklar ve yer anestezik çözüm kornea yüzeyinde bir damla ile göz kapaklarını açın.
2. Bir cam pipet vitreus odasına yerleştirin ve pipet konumunu korumak ve başka istenen bir çözüm sunar şırınga pistonu bastırmak için: Enjeksiyon iki kişi gerekir.
3. Cerrahi mikroskop, kavrama cam mikropipet ve parmaklarınızla Çift RN cam coupler altında. Enjeksiyon yerinde ters "V" şeklinde oluşturan serbest elin parmakları ile göz kapaklarının sürün. Göz, göz kapaklarının çekiş uygulayarak limbus arkasında arka yüzeyinin açığa yörüngesinin yükselmiş olacak. Enjeksiyon yerinde karşısında parmakları ile "V" şeklinde oluşturarak, bir beşik enjekte zaman göz istikrarın sağlanması için oluşturulmuştur.
4. Hafifçe aşağı doğru bir açıyla, sklerasına ile kan damarlarının yoksun bir bölgede konjonktiva ile cam mikropipet ucuna takın ve. Pipet sklerasına nüfuz ettiğinde, küçük bir "pop" hissetmeniz gerekir. Hafifçe aşağı doğru bir açıyla pipet takma iğne takarken lens vurma şansını azaltır.
5. Şırınga tutan kişi, şimdi şırınga 2 mcL işareti Medyumu çözüm 4 mcL enjekte edilmelidir. Enjeksiyon toplam yaklaşık bir iki saniye sürer. > Çok yavaş bir hızda enjekte 3 saniye vitreus haznesinden çözümün ilk yayılmasını azaltır. Böylece prosedürün başarısı doğrulayarak, mikroskop altında vitreus haznesinden kızarma enjekte çözüm görmek mümkün olacak.
6. Mikropipet yaklaşık 5 saniye süreyle sabit tutun ve daha sonra iğne takılı olduğu gibi aynı yöne çekilecekti. Konjonktiva, skleral ponksiyon mühür yardımcı, küçük bir açıklık içinde geri flep.
7. Kurtarma sırasında kornea kuruma önlenmesi, hayvan ve bir kurtarma kafesine geri dönmek için oftalmik göz merhemi (Tears Naturale PM) ile kornea yüzeyinde örtün.
8. Post-cerrahi analjezikler hayvan bakımı makamlarının kurallarına göre idare olmalı ve hayvanların ameliyattan sonra dikkatlice izlenmelidir.

5. Optik Sinir Stump Retina Ganglion Hücreleri seçerek Hedefleme

1. Optik sinir güdük izleyiciler, uyuşturucu, plazmid, siRNA'lar veya viral vektörlerin uygulanması aşağıdaki axotomy doğrudan retrograd taşıma yoluyla retina ganglion hücrelerinin hedefliyor. Bu ilk "Optik Sinir transeksiyonu Protokolü" ²² göre optik sinir transeksiyonu performans tarafından gerçekleştirilir.
2. Gelfoam kullanarak, optik sinir içine veya direkt enjeksiyon: bu yordamı gerçekleştirmek için iki ana yöntem vardır.
3. Ancak deneysel tedaviler sunan, üstün colliculus 1 hafta önce axotomy retrograd izleyiciler enjekte edilerek ön-etiket retina ganglion hücrelerinin arzu optik sinir gelfoam yöntemi, izleme retrograd benzer. Bu bazı durumlarda nöron izleyiciler deneysel maddeler ya da tam tersi retrograd taşıma ile karışabilir, çünkü hücre izlemek için önemlidir.
4. Optik sinir kesilir hemen sonra, deneysel bir çözüm batırılmış gelfoam küçük bir parça, transeksiyon optik sinir güdük üzerine yerleştirilir. Orbital içeriği daha sonra önceki konumuna geri döndü. Göz, optik sinir üzerinde kalmasını sağlayarak, forseps, aşağı yörüngesine gelfoam parçası itmek için kullanmak için gerekli bir nötral pozisyonda iade edilir.
5. Enjeksiyon tekniği retrograd axoplasmic akış tarafından taşınan olmak için akson sitoplazmasında erişmek gerekir maddelerin teslimi için daha etkilidir. Bu siRNA'lar ve plazmid, ve bazı durumlarda viral vektörlerin içerir. 5-10 mcL Hamilton şırınga transeksiyon optik sinir içine istenilen çözüm enjekte etmek için kullanılır.
6. Ince uçlu Dumont forseps ile optik sinir kenar tutuş. Eğim artık görünmez olana kadar, paralel sinir, optik sinir içine iğne ucunu. Her tarafta takılı iğne sinir kaplı olacaktır. Kısa bir konik iğne arzu edilir.
7. N sonraeedle sinir eklenir, hafifçe ince uçlu forseps ile sinir tarafı sıkmak ve şırınga bir çeyrek tur saat yönünde veya saat yönünün tersine dönerken çözüm dörtte biri enjekte.
8. Adım 5.7 iğne tam bir dönüşü tamamlamış ve şırınga tüm içeriğini enjekte kadar tekrar devam edin. En iyi sonuçlar için bir gaz geçirmez 10 mcL Hamilton şırınga kullanarak çözüm toplam 10 mcL enjekte edilir.
9. Sinir şırınga ucu çıkarın. Bu akson uçlarında alımı için ek bir havuz oluşturacak yörüngesinin içinde sinir kaynatılır fazla enjekte edilen sıvı bırakın.
10. Kendi orijinal konumuna yörünge içeriği ile döner, yara kapatın ve hayvan kurtarmak için izin verir.
11. Post-cerrahi analjezikler hayvan bakımı makamlarının kurallarına göre idare olmalı ve hayvanların ameliyattan sonra dikkatlice izlenmelidir.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Göziçi enjeksiyonları küresel retinada tüm hücreleri hedef ve vitreus odasına bitişik, en içteki nöronal tabaka, retina ganglion hücrelerinin bulunmaktadır yaralı RGCs teslim maddeler için iyi çalışır. RGCs transeksiyon optik sinir güdük maddelerin sunarak doğrudan hedef olabilir. Şekil 1'de gösterildiği gibi sinir güdük peptidler, uyuşturucu, vektörler, plazmid ya da siRNA'lar kullanarak Fluorogold retrograd etiketli RGCs hedeflenebilir. Şekil 1A-C, üstün colliculus içine Fluorogold enjekte edilerek önceden etiketli RGCs somata bir Cy3 etiketli peptid lokalizasyonu gösteriyor. Cy3 etiketli peptidler axotomy hemen sonra optik sinir enjekte edildi ve retina fiksasyonu sırasında doku liç peptidler önlemek için canlı görüntülendi. Şekil 1D-F Cy3 etiketli siRNA'lar ve axotomized RGCs Fluorogold retrograd tracer lokalizasyonu gösteriyor. Cy3 etiketli siRNA'lar axotomy hemen sonra optik sinir güdük içine enjekte edildi ve retina canlı görüntülü.

Şekil 1 flatmounted retina, optik sinir güdük içine etiketli peptidler veya siRNA'lar ya axotomy ve enjeksiyon sonrası 1 gün RGCs Epifloresans mikrograflar . (A) Fluorogold retrograd 1 gün postaxotomy axotomized RGCs etiketleme (B) etiketli peptidler retrograd ulaşım, optik sinir içine axotomy ve peptid enjeksiyon sonrası 1 gün sonra RGCs Cy3 floresan. (C) Overlay ve (A) ve (B) Fluorogold etiketli RGCs Cy3 etiketli peptidler seçici lokalizasyonu gösteren. (DF), Fluorogold etiketli RGCs (D) hücre gövdeleri de bindirme (F) gösterildiği gibi, 24 saat önce optik sinir güdük içine enjekte Cy3 etiketli siRNA'lar (E) ile doldurulur. AC ölçek çubuğu 50 mm. DF Ölçek çubuğu 20 mm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Optik sinir transeksiyonu yetişkin MSS nöron apoptozis yüksek tekrarlanabilir bir model. Bu yazının gösterdiği deneysel manipülasyonlar yaralanma sonrası RGC apopitoz mekanizmalarının çalışma izin verir.

Göziçi enjeksiyonları retina küresel hedefleme için yararlıdır. Bu prosedür, cam pipet ucu ile lens kesmemeye kritik olduğu gibi, bazı pratik gerektirir. Lens hasar değiştirerek hücre sağkalım ve rejenerasyon ^{20, 21,} büyüme faktörlerinin salınımı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT