Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Özet

Pratik ve verimli bir alternatif olarak geleneksel nükleik asit kantitatif metodolojiye NanoDrop microvolume sistemlerinin kullanımı iki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri gösteri ile tarif edilir.

Özet

Biyomoleküler deneyleri genellikle microvolume kantitatif gerçekleştirebileceğiniz bu nükleik asit kantitatif geleneksel küvet-temelli araçların kullanımını engelleyen, sürekli kullandığınız malzemenin giderek daha az miktarlarda gelişmiş ediliyor.

NanoDrop microvolume numune tutma sistemi (Thermo Scientific NanoDrop Ürünler) Küvet veya kapiler gibi geleneksel çevreleme cihazların bağımsız örnek dakika miktarda yakalamak ve korumak için fiber optik teknoloji ve doğal yüzey gerilim özelliklerini birleştirerek fonksiyonları. Ayrıca, sistem, aslında dilüsyonları gerçekleştirmek için ihtiyacı ortadan kaldırır. Kısa yol uzunluklarında, nükleik asit konsantrasyon ölçümleri geniş bir yelpazede Sonuç olarak, istihdam Spektroskopik analiz için gerekli olan örnek hacminin azaltılması da dahil birçok moleküler iş akışları boyunca ek kalite kontrol adımları kolaylaştırır verimliliğin artırılması ve sonuçta aşağı sonuçlarında daha fazla güven.

Sınırlı bir kitle yüksek hassasiyetli floresan analizi için ihtiyaç da deneysel son gelişmeler ile ortaya çıkmıştır. Aynı microvolume örnek saklama teknolojisini kullanarak, floresan ölçümler, floresan testleri hacim gereksinimleri önemli ölçüde azaltılabilir sağlayan 2 mcL malzeme ile olabilir. Bu mcL 10 veya daha az microreactions adanmış microvolume fluorospectrometer kullanarak artık mümkün.

İki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri geleneksel küvet tabanlı protokoller için pratik alternatif olarak entegre numune tutma sistemleri kullanan gösterilecektir. Birincisi, bir microvolume spektrofotometre kullanarak doğrudan A260 absorbans yöntemi açıklanmıştır. Bu microvolume fluorospectrometer ile az hacimli floresan reaksiyonlar sağlayan bir floresan tabanlı bir yöntem bir gösteri izledi. Bu yeni teknikler 1 pg / ml numune en az tüketim ile 15.000 ng / ml arasında değişen nükleik asit konsantrasyonlarının değerlendirilmesi sağlar.

Protokol

1. Microvolume Nükleik Asit Niceleme NanoDrop 2000c Spektrofotometre

1. Başlamak için, optik alt yüzeye temiz deiyonize su 2 - 3 mcL pipetleme microvolume spektrofotometre numune tutma sistemi, üst ve alt optik yüzeyler temiz.
2. Üst kaide deiyonize su ile temas halinde gelir sağlamak, kol kapatın. Kol kaldırın ve her iki optik yüzeyler temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin silin.
3. NanoDrop yazılımını açın ve Nükleik Asit uygulamayı seçin. Optik alt yüzeye tampon 1 mcL dağıtım boş bir ölçüm gerçekleştirmek için küçük bir hacim, kalibre pipet kullanın. Alt kol ve Nükleik Asit uygulaması "Boş" seçeneğini seçin.
4. Sonra boş bir ölçüm tamamlandığında, optik yüzeyler hem de temiz temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin.
5. Ölçülecek numune için uygun sabit seçin.
   

   Örnek Türü	Seçenek Seçin	Konsantrasyonunun hesaplanması için kullanılan sabit
   dsDNA	DNA-50	50
   ssDNA	DNA-33	33
   RNA	RNA-40	40
   Oligo	Özel	15-150

   Tablo 1: Tipik bir NanoDrop microvolume spektrofotometre, TrayCell Microcell küvet ile kullanılan geleneksel bir küvet tabanlı spektrofotometre ve PicoGreen testi ile birlikte bir microvolume NanoDrop fluorospectrometer kullanarak doğrudan A280 absorbans ölçümleri için nükleik asit konsantrasyon aralıkları.
6. 1 mcL nükleik asit örnek optik alt kaide üzerine koyun ve kol kapatın. Ölçümü bağımsız ses olduğundan, örnek, sadece yapılacak bir ölçüm için iki optik yüzeyler arasında köprü gerekir.
7. Uygulama yazılımı "Ölçü" i seçin. Yazılım otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonu ve saflık oranları hesaplar. Örnek ölçüm ardından, spektral çıktısını gözden geçirin.
8. Yazılım otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonu ve saflık oranları hesaplar. Örnek ölçüm ardından, örnek kalitesini değerlendirmek için spektral görüntü gözden geçirin.
9. Tipik bir nükleik asit örneği çok karakteristik bir profile sahip.
   
   Şekil 1: Tipik bir nükleik asit örneği çok karakteristik bir profile sahip.
10. Ortak spesifik nükleik asit izolasyon teknikleri ile ilişkili bulaşanların kaynakları Fenol / Trizol ve sütun çıkarma içerir. Fenol / Trizol çıkarma durumda, kalıntı reaktif kontaminasyonu 220 - 240 nm arasında anormal spektrumları yanı sıra 260-280 nm bölgede vardiya endike olabilir. Tersine, sütun çıkarma artık guanidin tepe ve çukur bir kayma yaklaşık 240 nm 230 nm 230 nm yakın bir katkıda bulunabilir.
    
    Şekil 2, B ve C örnekleri zirveler ve dipler vardiya olarak kirleticiler, nükleik asit örneklerinin spektrumları nasıl etkilediğini göstermek örnek kıyasla.
11. Doğru örnek kalitesini değerlendirmek için, 260/280 ve 260/230 oranları genel spektral kalite ile birlikte analiz edilmelidir. Saf nükleik asitler genellikle sırasıyla ~ 1.8 oranı 260/280 ve 260/280 oranı ~ 2.0 DNA ve RNA için bir verim. Bu oran, boş ve örnek ölçümleri yapmak için kullanılan tampon pH ve iyonik kuvvet bağlıdır. Asidik çözümler temel bir çözüm 0.2-0.3 oranı fazla temsil edecek iken, 0.2-0.3 oranı altında temsil edecek. Önemli ölçüde farklı saflık oranları, 280 nm veya yakınındaki kuvvetle absorbe protein, fenol ya da diğer kirleticiler varlığına işaret edebilir. 260/230 saflık oranı 1.8-2.2 aralığında yaygın bir "saf" nükleik asit değerleri ile DNA saflık ikinci bir ölçüsüdür. Saflık beklenen değerlere göre anlamlı derecede düşük oranlar kullanılan izolasyon tekniği daha fazla optimizasyon isteyebilir gösterebilir.
12. NanoDrop spektrofotometreler da doğrudan absorbans kullanarak protein ya da protein kolorimetrik testleri ile ölçmek için kullanılabilir. Uygun sütun oluşumu ve tekrarlanabilirlik sağlamak için, 2-ul örnekleri protein örnekleri için tavsiye edilir. Aşağıdaki vallahi video bakın: Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610 NanoDrop Spektrofotometre

2. NanoDrop 3300 Fluorospectrometer Yüksek Hassasiyet Microvolume Nükleik Asit kantitasyonu

1. NanoDrop 3300 kullanarak yüksek hassasiyetli microvolume nükleik asit kantitatif göstermek için, bir PicoGreen floresan kiti kullanılır. Başlamak için, oda sıcaklığına kadar kiti standartları ve nükleik asit örneklerinin dengelenmesi. Floresan örnekleri ışığa duyarlı ve kehribar veya alüminyum sarılmış tüpler tutulmalıdır.
2. , Gerekli olacak PicoGreen çalışma çözeltisinin yanı sıra ölçülebilir tüm standartlar ve örnekler için yeterli 1x TE tampon hazırlayın. 20x TE tampon üreticinin protokol başına nükleaz içermeyen su ile seyreltilmesi ile 1xTE tampon hazırlayın. Reaksiyon hacmi 200 mcL kadar az 10 ul uzanabilir. Bu örnekte, 10 mcL reaksiyon hacmi hazırlanacaktır.
3. Nükleaz şişeleri ya da tüpler 2x nihai istenen konsantrasyona seri seyreltilmiş dsDNA standartları hazırlayın. Nükleaz içermeyen amber veya folyo kaplı tüp etiketli bir birey haline seyreltilmiş dsDNA standartlarını her 5 mcL aktarın.
4. Uygun etiketli nükleaz içermeyen sarı veya folyo kaplı tüpler içine ilgi her dsDNA örnek kısım 5 mcL.
5. Üretici firmanın protokolüne göre PicoGreen çalışma çözeltisi hazırlayın. PicoGreen çalışma çözeltisi eşit hacimde bir ilgi standart ya da numune (bu örnekte 5 mcL) da içeren her tüp aktarın.
6. Bir referans çözüm olarak hizmet veren negatif kontrol hazırlamak, 1x TE tampon ve PicoGreen çalışma çözeltisi eşit hacimlerde birleştirin.
7. Nazik pipetleme ile iyice karıştırın ve Her reaksiyon tüpü içeriğini reaksiyonların, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Floresan sinyal sıcaklığından etkilenir gibi tüm standartlar ve örnekler önce aynı ölçüm sıcaklığına gelmesi beklenmelidir.
8. Alet hazırlamak ve ölçümlerini yapmak, ilk numune tutma sistemi alt ve üst yüzeyleri temizlemek. Optik alt yüzeye deiyonize su pipetleyin 2 3 mcL yakın, sonra kol ve temiz, havsız ile alt ve üst kaideleri blot, laboratuvar silin. Yüzeyleri tüy bırakmayan bir floresan bir uyarım kaynağının varlığını gösterirler ve ölçümü ile karışabilir geçmeden önce tüy bırakmayan ücretsiz olun.
9. , Cihazın yazılımını açın "Nükleik Asitler" uygulamasını seçin ve "PicoGreen-dsDNA" seçeneğini seçin.
10. Araç boş için, alt kaide 1x TE 2 mcL ekleyin, kol kapatın ve cihaz yazılımı alanında "Boş" seçeneğini seçin. Boş komple sonra, numune tutma sistemi her iki yüzeyine boş bir çözüm kurulayın.
11. Nazik pipetleme referans çözüm karıştırın. Alt kaide üzerine düşük tutma ipuçları, pipet 2 mcL kullanma ve kol yakın.
12. Ölçüm tipi "Referans" seçin ve istenilen birimleri seçin. Ölçüm döngüsü başlatmak için "Ölçü" ı tıklayın.
13. Ölçüm döngüsü tamamlandığında, kol açık ve iyice kurulayın numune tutma sistemi yüzeyler. Beş kadar ölçüm her çoğaltmak için taze bir kısım kullanarak, referans çoğaltır.
14. Standart bir eğri oluşturmak için ek standartlar için bu işlemi tekrarlayın. Kadar yedi standartları kullanılıyor olabilir. Bu yazılım, her standart için beş çoğaltır kadar saklamak için tasarlanmıştır. Standartların çoğaltır örnek konsantrasyonları otomatik olarak belirlendiği ve standart bir eğri oluşturmak için ortalaması alınır.
15. Standart eğri tamamlandıktan sonra, "Örnekler" sekmesini seçin, ilgili örnek kimlik bilgilerini girin ve her bilinmeyen numune ölçün.

Tartışmalar

Burada sunulan kantitatif protokolleri en yaygın kabul gören microvolume sistemleri dayanmaktadır. Bu tür sistemler daha fazla numune hacimleri ve çevreleme cihazların kullanımı güveniyor geleneksel nükleik asit kantitatif metodoloji için pratik alternatifler sağlar.

NanoDrop microvolume teknolojisi, yüzey gerilimi özellikleri üzerine bir sıvı sütunu oluşturmak için ölçülen örnek güvenir bir örnek tutma sistemi kullanmaktadır. Bu örnek, uygun sütun oluşumu için alt ve üst optik ölçüm yüzeyleri ile temas yaptığı esastır. Eğer herhangi bir noktada ölçüm sonuçlarının yanlış ya da tekrarlanabilir değil gibi görünüyor, büyük olasılıkla örnek heterojenite veya sıvı sütun kırılması sonucu.

Deterjan ve temizlik maddeleri, kaide ölçüm yüzeyleri uncondition olarak izopropil alkol tavsiye edilmez. Koşulsuz kaide örnek damlacık bir düzleşme, kaide hidrofobik yüzey özellikleri uzlaşılan olduğu zaman oluşur. Koşulsuz kaideleri ölçüm sırasında sıvı sütunun kırılmaya yol açabilir.

Şekil 3 koşulsuz yüzey, bir su damlasının bir düzleşme tarafından karakterize edilir .

Uncondtioned kaide yüzeyleri NanoDrop Ayak Yenileme Bileşik (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Ürünleri) kullanılarak yenilenmiş olabilir. ~ 30 saniye süreyle kurumasına izin, üst ve alt kaide yüzeyleri, bileşik yenileme ince bir tabaka uygulanır, daha sonra temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin kullanarak ovuşturdu. Başarılı bir şekilde yenilenmiş bir devlet, bir su damlacığı alt kaide yüzeyine uygulandığında kadar boncuk ile karakterizedir.

Şekil 4 yenilenmiş bir yüzey, bir su damlasının bir boncuk tarafından karakterize edilir .

Microvolume kantitatif sistemleri büyük ölçüde örnek tüketimini azaltmak ve daha geleneksel kantifikasyon sistemleri ile kıyaslandığında önemli ölçüde konsantrasyon aralığı artırmak. Microvolume kantitatif genellikle iğne biyopsileri ve lazer yakalama mikrodiseksiyon sınırlı hücre gibi kütle, verimlilik ve kolaylığı bu metodoloji yaptı yaygın olarak kabul gören alternatif geleneksel nükleik asit kantitatif yöntemleri içeren durumlar için elverişli bir teknoloji haline gelmiştir rağmen bile Örnek bol olduğu zaman.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-2000C
NanoDrop 3300	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300