NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Riepilogo

L'uso di sistemi NanoDrop microvolumi come alternativa pratica ed efficace ai tradizionali metodologia di quantificazione acidi nucleici è descritto attraverso la dimostrazione di due protocolli di acido nucleico quantificazione microvolumi.

Abstract

Analisi biomolecolari sono in costante sviluppo che usano quantità sempre più piccoli di materiale, spesso precludendo l'utilizzo di tradizionali strumenti basati cuvetta per la quantificazione degli acidi nucleici per coloro che possono eseguire quantificazione microvolumi.

Il NanoDrop microvolumi Sistema di ritenzione del campione (Thermo Prodotti NanoDrop Scientifica) le funzioni unendo tecnologia delle fibre ottiche e le proprietà naturali della tensione superficiale di catturare e trattenere piccole quantità di campione indipendente di apparecchi di contenimento tradizionali come cuvette o capillari. Inoltre, il sistema impiega lunghezze di percorso più breve, che si traducono in una vasta gamma di misure di concentrazione di acidi nucleici, essenzialmente eliminando la necessità di eseguire diluizioni. Riduzione del volume di campione per l'analisi spettroscopica facilita anche l'inserimento di ulteriori passi di controllo di qualità in molti flussi di lavoro molecolare, aumentando l'efficienza e, in definitiva portando ad una maggiore fiducia nei risultati a valle.

La necessità di alta sensibilità di analisi a fluorescenza di massa limitata è anche emerso con i recenti progressi sperimentali. Utilizzando la stessa tecnologia di ritenzione del campione microvolumi, misure fluorescenti possono essere eseguite con 2 ml di materiale, permettendo fluorescente requisiti volume di saggi di essere significativamente ridotta. Microreactions tale di 10 L o meno sono ora possibili utilizzando un fluorospectrometer dedicato microvolumi.

Due microvolumi acidi nucleici protocolli di quantificazione sarà dimostrato che l'uso integrato di sistemi di ritenzione del campione come alternative alle tradizionali pratiche cuvetta protocolli basati su. In primo luogo, un metodo diretto A260 assorbanza con uno spettrofotometro microvolumi è descritto. Questa è seguita da una dimostrazione di un metodo basato fluorescenza, che consente le reazioni fluorescenza ridotto volume con un fluorospectrometer microvolumi. Queste nuove tecniche permettono la valutazione delle concentrazioni degli acidi nucleici che vanno da 1 pg / mL a 15.000 ng / mL con un consumo minimo di campione.

Protocollo

1. Microvolumi Quantificazione degli acidi nucleici Utilizzando un NanoDrop 2000c Spettrofotometro

1. Per iniziare, pulire le superfici superiori ed inferiori ottica del sistema di ritenzione spettrofotometro microvolumi campione pipettando 2-3 ml di acqua deionizzata pulita sulla superficie inferiore ottica.
2. Chiudere il braccio di leva, assicurandosi che il piedistallo superiore entra in contatto con l'acqua deionizzata. Sollevare il braccio di leva e pulire entrambe le superfici ottiche con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire.
3. Aprire il software NanoDrop e selezionare l'applicazione di acido nucleico. Utilizzare un piccolo volume, pipettatore calibrato per eseguire una misurazione vuoto dispensando 1 ml di tampone sulla superficie inferiore ottica. Abbassare il braccio di leva e selezionare "vuoto" nella domanda di acido nucleico.
4. Una volta che la misura è vuoto completo, pulire entrambe le superfici ottiche con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire.
5. Scegli la costante appropriata per il campione che deve essere misurato.
   

   Tipo di campione	Selezionare l'opzione	Costante utilizzata per calcolare la concentrazione
   dsDNA	DNA-50	50
   ssDNA	DNA-33	33
   RNA	RNA-40	40
   Oligo	Costume	15-150

   Tabella 1. Tipici acidi nucleici gamme di concentramento diretto A280 misure assorbanza usando un NanoDrop microvolumi spettrofotometro, un tradizionale cuvetta a base di spettrofotometro usato con un Microcell TrayCell cuvetta, e un fluorospectrometer NanoDrop microvolumi in collaborazione con il saggio PicoGreen.
6. Dispensare 1 ml di campione di acido nucleico sul piedistallo più basso ottico e chiudere il braccio di leva. Poiché la misura è volume indipendente, il campione ha solo bisogno di colmare il divario tra le due superfici ottiche per una misura da effettuare.
7. Selezionare "misura" nel software applicativo. Il software calcola automaticamente l'acido nucleico rapporti di concentrazione e purezza. A seguito di misura, controlla l'emissione spettrale.
8. Il software calcola automaticamente l'acido nucleico rapporti di concentrazione e purezza. A seguito di misura, controlla l'immagine spettrale di valutare la qualità del campione.
9. Un esempio tipico di acidi nucleici avrà un profilo molto caratteristico.
   
   Figura 1. Un esempio tipico di acidi nucleici avrà un profilo molto caratteristico.
10. Le fonti comuni di contaminanti associati a specifiche tecniche di acidi nucleici isolamento includono l'estrazione fenolo / Trizol e colonna. Nel caso di estrazione fenolo / Trizol, la contaminazione dei reagenti residuo può essere indicato da spettri anomali tra 220-240 nm e dagli spostamenti nella regione 260-280 nm. Al contrario, guanidina residuo dall'estrazione colonna possono contribuire a raggiungere un picco vicino a 230 nm e un cambiamento nella vasca da 230 nm a circa 240 nm.
    
    Figura 2. I cambiamenti nella alti e bassi dei campioni B e C rispetto al campione A illustrare come contaminanti possono influenzare gli spettri di campioni di acidi nucleici.
11. Per valutare accuratamente la qualità del campione, 260/280 o 260/230 rapporti devono essere analizzati in combinazione con la complessiva qualità spettrale. Pure acidi nucleici tipicamente produrre un rapporto di 260/280 ~ 1,8 e un rapporto di 260/280 ~ 2.0 per DNA e RNA, rispettivamente. Questo rapporto dipende dal pH e forza ionica del tampone usato per fare il vuoto e le misure del campione. Soluzioni acide sarà sotto-rappresentano il rapporto di 0,2-0,3, mentre una soluzione di base si sovra-rappresentare il rapporto di 0,2-0,3. Rapporti di purezza significativamente differenti possono indicare la presenza di proteine, fenolo o altri contaminanti che assorbono fortemente nei pressi o 280 nm. Il rapporto di 260/230 purezza è una seconda misura di purezza del DNA con i valori di un acido "puro" nucleici comunemente nel range di 1,8-2,2. Rapporti di purezza che sono significativamente inferiori ai valori attesi possono indicare la tecnica di isolamento utilizzato può richiedere un'ulteriore ottimizzazione.
12. Spettrofotometri NanoDrop può anche essere utilizzato per quantificare le proteine ​​mediante assorbanza direttamente o tramite test colorimetrici proteine. Per garantire una corretta formazione della colonna e riproducibilità, 2-microlitri campioni si consiglia di campioni di proteine. Fare riferimento al seguente video jove: Determinazione delle proteine ​​microvolumi Concentrazione Utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

2. Ad alta sensibilità microvolumi quantificazione degli acidi nucleici Utilizzando il NanoDrop 3300 Fluorospectrometer

1. Per dimostrare ad alta sensibilità quantificazione degli acidi nucleici microvolumi utilizzando il NanoDrop 3300, un kit PicoGreen fluorescenza viene utilizzato. Per iniziare, equilibrare gli standard kit e tutti i campioni di acidi nucleici a temperatura ambiente. Campioni fluorescenti sono sensibili alla luce e deve essere conservato in ambra o tubi avvolti in alluminio.
2. Preparare abbastanza 1x tampone TE per tutti gli standard ed i campioni da misurare, nonché per la soluzione PicoGreen di lavoro che saranno necessarie. Preparare tampone 1xTE diluendo il fornita 20x TE buffer con acqua priva di nucleasi per protocollo del produttore. Volumi di reazione può variare da 200 ul a un minimo di 10 ul. In questo esempio, 10 volumi di reazione microlitri sarà preparato.
3. Preparare in serie standard diluita dsDNA a 2x la concentrazione finale desiderata nucleasi-free fiale o provette. Trasferire 5 ml di ciascuna soluzione standard di dsDNA diluito in un individuo etichettato nucleasi-free ambra o alluminio coperto di tubo.
4. Aliquota 5 ml di ogni campione dsDNA di interesse in adeguatamente etichettati nucleasi-free ambra o foglio coperto di tubi.
5. Preparare la soluzione PicoGreen di lavoro secondo il protocollo del produttore. Trasferire un volume uguale della soluzione PicoGreen di lavoro ad ogni provetta contenente sia uno standard o campione di interesse (5 microlitri in questo esempio).
6. Combina volumi uguali di 1x tampone TE e PicoGreen soluzione di lavoro per preparare il controllo negativo, che serve come soluzione di riferimento.
7. Mescolare il contenuto di ogni provetta accuratamente pipettando dolce e incubare le reazioni a temperatura ambiente per 5 minuti. Tutti gli standard ed i campioni devono essere equilibrati per la stessa temperatura prima della misurazione come segnale di fluorescenza è influenzata dalla temperatura.
8. Per preparare lo strumento e di eseguire le misurazioni, in primo luogo la pulizia delle superfici inferiore e superiore del sistema di ritenzione del campione. Pipettare 2-3 ml di acqua deionizzata sulla superficie inferiore ottica, chiudere quindi aprire il braccio di leva, e cancella i piedistalli superiore e inferiore con un panno pulito, privo di lanugine, pulire laboratorio. Assicurarsi che le superfici siano prive di lanugine prima di procedere come niente può esibire fluorescenza in presenza di una fonte di eccitazione e possono interferire con la misurazione.
9. Aprire il software dello strumento, selezionare l'opzione "Nucleic Acids" applicazione e selezionare l'opzione "PicoGreen-dsDNA".
10. Al vuoto dello strumento, aggiungere 2 ml di TE 1x al piedistallo più basso, vicino al braccio, e selezionare "Vuoto" nel campo del software dello strumento. Una volta vuota è completo, macchia al largo della prova in bianco su entrambe le superfici del sistema di ritenzione del campione.
11. Mescolare la soluzione di riferimento pipettando gentile. Utilizzando punte bassa ritenzione, pipetta 2 microlitri sul piedistallo più basso e chiudere il braccio.
12. Selezionare "di riferimento" nel tipo di misura, e selezionare le unità desiderate. Fare clic su "misura" per avviare il ciclo di misurazione.
13. Quando il ciclo di misura, aprire completamente il braccio e macchia le superfici Sistema di ritenzione del campione. Misura fino a cinque repliche di riferimento, su una nuova aliquota per ogni replica.
14. Ripetere la procedura per gli standard aggiuntivi per costruire una curva standard. Fino a sette norme possono essere utilizzati. Il software è progettato per memorizzare fino a cinque repliche per ogni standard. Replica degli standard viene calcolata la media per generare una curva standard da cui concentrazioni del campione sono determinati automaticamente.
15. Una volta che la curva standard è completo, selezionare la scheda "Campioni", inserire le rispettive informazioni ID campionamento e la misurazione di ogni campione sconosciuto.

Discussione

I protocolli di quantificazione qui presentati sono basati sul più diffuso dei sistemi microvolumi. Tali sistemi offrono alternative pratiche per la tradizionale metodologia di quantificazione acidi nucleici, che si basano su maggiori volumi di campione e l'impiego di attrezzature di contenimento.

NanoDrop microvolumi tecnologia si avvale di un sistema di ritenzione del campione che si basa sulle proprietà tensione della superficie del campione da misurare a formare una colonna di liquido. E 'essenziale che il campione entra in contatto con le superfici superiori ed inferiori misura ottica per la formazione di colonna corretta. Se in qualsiasi momento i risultati delle misurazioni sembrano imprecisi o non riproducibili, è probabilmente il risultato di eterogeneità del campione o la rottura della colonna liquida.

Detergenti e alcool isopropilico non sono consigliati detergenti in quanto potrebbero uncondition le superfici piedistallo di misura. Un piedistallo incondizionata si verifica quando le proprietà di superficie idrofoba del piedistallo sono stati compromessi, con un conseguente appiattimento della goccia campione. Piedistalli incondizionato può portare alla rottura della colonna di liquido durante la misurazione.

Superficie Figura 3. Incondizionato è caratterizzata da un appiattimento di una goccia d'acqua.

Superfici piedistallo Uncondtioned possono essere revisionati con Compound NanoDrop piedistallo Ricondizionamento (PR-1, Thermo Scientific Prodotti NanoDrop). Un sottile strato di composto ricondizionamento viene applicata alle superfici piedistallo superiore e inferiore, lasciato asciugare per circa 30 secondi, poi strofinando con un panno pulito, asciutto e privo di laboratorio di pulire. Uno stato con successo ricondizionati è caratterizzato da una goccia d'acqua perline quando applicato sulla superficie in basso piedistallo.

Figura 4. Ricondizionati Una superficie è caratterizzata da una bordatura di una goccia d'acqua.

Sistemi di quantificazione microvolumi ridurre notevolmente il consumo di campione e aumentare notevolmente il range di concentrazione rispetto ai più tradizionali sistemi di quantificazione. Anche se la quantificazione microvolumi è diventato spesso una tecnologia abilitante per le circostanze che coinvolgono la massa limitata di cellule, come le biopsie ago e laser-capture microdissezione, l'efficienza e la facilità d'uso di questa metodologia ha reso un ampiamente accettato alternativa ai tradizionali metodi di quantificazione acidi nucleici anche campione quando è abbondante.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoDrop 2000c	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-2000C
NanoDrop 3300	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300