Gerilim duyarlı Boyalar ile Yengeç Stomatogastric Ganglion Nöronlar Optik Görüntüleme

Özet

Burada yengeç stomatogastric ganglion nöronlar detaylı aktivite, hızlı ve yüksek çözünürlüklü floresan voltaj duyarlı boya görüntüleme için bir metodoloji mevcut.

Özet

Gerilim duyarlı boya görüntüleme nöron nöron ağları nasıl organize edilir anlamak için anahtar bir metodoloji ve katılan nöronların eş zamanlı aktivite nasıl ayrılmaz bir ağ işlevselliğini ortaya çıkmasına yol açar. Burada tespit desen üreten nöronların yengeç stomatogastric ganglion bu tekniğin uygulama metodoloji mevcut. Biz gerilim duyarlı floresan boya Di-8-ANEPPQ ile bu nöronların yükleme göstermek ve nasıl görüntü MiCAM02 yüksek hız ve yüksek çözünürlüklü CCD kamera görüntüleme sistemi kullanarak boya yüklü nöronların faaliyet göstermektedir. Biz MiCAM02 görüntüleme sistemi ile ilişkili BVAna görüntüleme yazılımı kullanarak kaydedilen görüntüleme verileri analiz göstermektedir. Yengeç stomatogastric ganglion birden fazla nöron detaylı bir faaliyetin eşzamanlı voltaj duyarlı boya görüntüleme ile birlikte geleneksel elektrofizyoloji teknikleri (hücre içi ve hücre dışı kayıtları) merkezi desen nasıl jeneratör sinir ağları çalıştığını anlamak için radikal yeni fırsatlar açar uygulanır.

Protokol

1. Yengeç Stomatogastric Sinir Sistemi Hazırlanması

Yetişkin Kanser pagurus L. (10 - 12 ° C) yerel kaynaklardan elde edilen (Newcastle Üniversitesi, Deniz Laboratories Dove) ve filtrelenmiş gazlı deniz suyu tutuldu. Diseksiyonu 40 dakika önce - Hayvanlar 20 buz ambalaj anesteziye edildi. Biz izole stomatogastric sinir sistemi (STNS ¹⁾ kullanılır. Soğutulmuş tuzlu su (10-13 ° C) - STNS (12 mg / dak 7) silikon elastomer kaplı (Elastosil RT-601, Wacker, Münih, Almanya) Petri kabı tutturulmuş ve sürekli superfused oldu. MgCl _2, 26; CaCl _2, 13; KCl, 11, trisma baz, 10 maleik asit, 5 NaCl, 440: serum fizyolojik (mMol * L-1) oluşuyordu. 13 ° C ve pH 7.4 - 7.6 Saline 11, sabit bir sıcaklıkta tutuldu.

STNS diseksiyon ve hazırlık stomatoastric ganglion (STG) desheathing dahil olmak üzere ayrıntılı adımlar, vallahi Guttierez ve Grashow ¹ makalede sunulmuştur. Bütün deneyler, 24 ^Kasım 1986 (86/609/EEC) ve Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi uyarınca yürütülmüştür. Şekil 1A ve Şekil 1B STNS bir şema, nöronlar ganglion arka kısmı düz bir yarım daire olarak düzenlenmiş olan tipik bir desheathed STG gösterir.

Modelleme kil ile; STNS Petri kabı görüntüleme mikroskobu (Olympus, Tokyo, Japonya BW51 WI) işletim platformu sabittir. Her ikisi de, mikroskop sahne ve mikroskop optik kayıt sırasında hareket eserler önlemek için (Scientifica, Uckfield, Birleşik Krallık) bir titreşim izole masanın üzerine monte edilir. Stomatogastric ganglion (STG) üretilen motor desenlerini ekstrasellüler kayıtları kullanarak ^2-4 izlenmektedir. Bu aşağıdaki adımları izleyin aracılığıyla yapılır:

1. Vazelin tabanlı bir silindirik bölmesi, ana motor sinir (LVN) banyo (Petri kabı görüntüleme mikroskop işletim platformu üzerinde yerleştirilmeden önce bu diseksiyon aşamada yapılır sinir elektriksel olarak izole etmek için bir bölüm etrafında inşa edilmiştir .)
2. Bir, iki paslanmaz çelik elektrot tellerin diğeri bir referans elektrot olarak banyo, bu bölmeye yerleştirilir.
3. Diferansiyel sinyali kaydedildi süzülmüş ve bir AC diferansiyel amplifikatör (Univ. Kaiserslautern, Almanya) ile yükseltilir.
4. Ganglion motor aktivite, bir osiloskop (DL708E; Yokogawa, Tokyo, Japonya) kullanılarak takip edilir ve ayrıca bir veri toplama kartı (CED Güç, 1401, Cambridge Elektronik Tasarım, Cambridge, Birleşik Krallık) ve Spike 2 6.10 kullanılarak kaydedilen yazılımı (Cambridge Elektronik Tasarım, Cambridge, UK). Files Spike 2 6.10 (Cambridge Elektronik Tasarım, Cambridge, UK) kullanılarak analiz edilmektedir.

2. Boya Çözüm hazırlanması

Biz, olumlu akım darbeleri kullanarak Mikroelektronlar ile boya yükleme kolaylaştıran bir çift pozitif yüke sahip floresan, voltaj duyarlı boya Di-8-ANEPPQ (Bioscience ^Cambridge) 5, kullandı. Boya çözüm, mümkün olduğu kadar çok ışık korunmalıdır. Boya çözüm şu şekilde hazırlanır:

1. Boya 5 mg 1 ml, DMSO (Invitrogen) çözümü F-127 Pluronic asit ile karıştırılır.
2. Çözünmüş boya içeren plastik flakon Sigma Mikrosantrifüj 1-14 devir / dakika (Sigma, Osterode, Almanya) mikroelektrot tıkayabilir büyük boya parçacıkları ayırmak için 12.000 'den az 20 dakika süreyle santrifüj.
3. Boya çözüm supernatant (üst 200 mcL) bir pipet ile ayrılmış ve ayrı bir plastik şişe içinde saklanır. Her ikisi de şişeleri Işığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile sarılır.
4. Boya çözüm -20 ° C'de dondurulmuş
5. Önce boya çözüm kapalı ve sarılı flakon 10-15 dakika süreyle sıcak (25 ° C) su koyarak eritilir.

3. Hücre içi enjeksiyon kullanarak Sharp Mikroelektronlar Boya Yükleme

Biz boya ile nöronların yüklemek için keskin Mikroelektronlar kullandı. MiCAM02 görüntüleme sistemi (SciMedia, Tokyo, Japonya) ⁶ kullandığımız boya yükleme kontrol etmek için. HS kamera görüntüleme sistemi, iki adet CCD kamera: İK kamera 1,4 ms olan en iyi temporal çözünürlük ile daha iyi uzaysal çözünürlüğü sağlayarak, daha büyük bir sensör çipi (6,4 mm x 4,8 mm), küçük bir (2,9 mm x 2,1 mm), ancak iyi temporal çözünürlük olarak 0,7 ms daha hızlı görüntüleme sağlayan hızlı sensör çipi. Boya yükleme adımları aşağıdaki gibidir:

1. Mikroelektronlar ile çekilmiş bir P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA), 10 cm uzunluğunda kullanarak elektrot çektirme, filament (GB100TF 8P, Bilim Ürünler, Hofheim, Almanya) ile 1 mm dış çaplı cam tüpler. Elektrotlar, bir direnç çekti25 aralık - 40 MOhm 3M KCl (elektrot çektirmenin üreticisi tarafından sağlanan uygun çekerek parametre ayarları pipet yemek kitabı takip için).
2. Dondurulmuş boya çözüm erimiş ve bunun çok küçük bir miktar Microfil iğne (Microfil - 34g, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, USA) - emdi emdi boya 2 / 3 ^'üncü Microfil iğne etrafında doldurur .
3. Boya çözüm Microfil iğne, bir mikroelektrot ucu içine enjekte edilir. Mikroelektrot 15 dakika boyunca karanlık bir kutu yerleştirilir.
4. Mikroelektrot 3M KCl çözeltisi ile yeniden toprakla. Elektrot, başka bir 10-20 dakika sonra boya çözüm mikroelektrot hareket kılcal kuvvet emme elektrot ince ucu ulaşmak için izin karanlık bir elektrot saklama kutusu içine yerleştirilir.
5. Hazır mikroelektrot, bir elektrot tutucu yerleştirilir ve hücre içi amplifikatör (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, ABD) üzerine headstage sabittir.
6. Intrasellüler amplifikatör mikroelektrot akım darbeleri sürücüye bir darbe sinyali sağlar veri toplama kuruluna bağlıdır.
7. Mikroelektrot mikroelektrot manipülatör (PatchStar Scientifica Ltd Uckfield, İngiltere) kullanarak bir STG nöronun membran içine yavaşça yerleştirilir. 10x objektif çalışma mesafesi (UMPLFL10XW, NA 0.30, WD 3.3mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) bu yana görüntüleme mikroskop çok küçük mikroelektrot, eğik bir pozisyonda konumlandırılmış (yaklaşık 30 °) ve hareket edilmelidir doğru pozisyonda içine mikroelektrot mikroskop amacı yeniden odaklanma ve hareketli mikroelektrot birkaç adım gerektirir. Mikroelektrot başlatmak için ucu STG üzerinde olduğu gibi bir konuma taşınır. Mikroskop objektif, elektrot ucu odak görünene kadar indirilir. Sonra daha da düşürdü ama mikroelektrot dokunmak kadar değil. Mikroelektrot objektif odak yeniden görünene kadar indirilir. Bu adımlar, nöronlar objektif odak düzlemi açıkça ortaya çıkıncaya kadar tekrarlanır. Sonra bu dokunuşlar ve nazik bir şekilde seçilen STG nöron membranı deler kadar mikroelektrot indirilir. Bu osiloskop kullanılarak izlenebilir.
8. Intrasellüler elektrot nöron verilen faaliyet profili ve faaliyet ve ekstrasellüler elektrot ^2,3,7 kaydedilen STG aktivite arasındaki ilişkiyi belirlemek amacıyla seçilen STG nöron aktivitesini kaydetmek için kullanılır.
9. Intrasellüler amplifikatör mevcut enjeksiyon moduna açıldığında ve 30 dakika 1 saniye için son mikroelektrot içine enjekte 1 saniye boşluklar ile ayrılmış olduğunu mikroelektrot içine pozitif geçerli adımları nA 10 enjekte etmek için kullanılır. Kaydedilen nöron içine enjekte güncel sürücüler, pozitif yüklü boya molekülleri. Donanımları mevcut ise aynı anda birden fazla nöron enjekte edilebilir.
10. Enjeksiyon dönemi içine enjeksiyon bitiminden sonra on dakika nöron içinde boya yayılmasını kontrol edilir. Filtre küp MSWG2 aracılığıyla, (Bunu yapmak için ultra-düşük dalgalanma halojen ışık kaynağı (Moritex, Tokyo, Japonya HL-151), 10x objektif ve aydınlatma MiCAM02 görüntüleme sistemi (SciMedia Ltd, Tokyo, Japonya) 480-550 nm eksitasyon filtresi; Olympus Corporation, Tokyo, Japonya). Görüntüleme sistemi, 192 x 128 piksel çözünürlük, 40 ms görüntüleme zaman, 'hbin' modu ve görüntü oturum başına 10 kare ile İK kamera kullanmak üzere ayarlayabilirsiniz. Boya dolum başarılı olursa, mikroelektrot konum etrafında nöron görüntüleme boyalı yama göstermeli ve bu boyalı yama ve 30 dakika sonra 10 dakika sonra çekilen görüntüler arasında büyümek gerekir. 30 dakika sonra boyanın yayılması yeterli değilse, daha fazla enjeksiyon süresi verilir. Alternatif olarak, yeni bir boya elektrodu kullanılıyor olabilir.
11. Elektrot nöron çıkardı ve nöron en az 20-30 dakika dinlenmek için bırakılır. Bu süre içinde, bir sonraki nörona boya ile enjekte edilebilir.

4. Boyalı Nöronlar görüntüleme

Tek nöron aktivitesini boya dolum işlemden sonra görüntülü olabilir. Alternatif olarak iki veya daha fazla nöron görüntü birkaç STG nöronların eş zamanlı aktivite dolu olabilir. Prensip olarak, çok sayıda ve büyük olasılıkla tüm STG nöronlar boya ile dolu olabilir. Nöron görüntüleme İK kamera kullanarak MICAM 02 görüntüleme sistemi ile yapılır. Görüntüleme prosedürü aşağıdaki gibidir:

1. Mikroskop amacı değişti ve yüksek ışık iletim verimliliği 20x objektif (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) görüntüleme veri toplama için kullanılır. Bu hedef, 10x objektif ve de nöronların daha ayrıntılı görüntü sağlayan yüksek büyütme veren çok daha fazla ışık toplar. Bein küçük miktarda boya yükleme zaten biz görüntüleme boya ile nöronların neden olabilecek potansiyel fotoğraf hasarı azaltmak için daha düşük ışık yoğunluğu da bu amaç ve görünür olduğunu g daha verimli ışık anlamına gelir.
2. Mikroskop işletim aşaması görüntülü olması gerekiyordu nöronların objektif görüş alanında olan ve amacı üzerine odaklanmıştır böyle bir konuma sahiptir.
3. Ekstraselüler kayıt verileri de MICAM 02 görüntüleme sistemi, analog giriş kanalı yoluyla beslenir. Bu analiz aşaması optik sinyalleri ve buna karşılık gelen motor desen veya ekstraselüler kaydedilen ani nispeten kolay ilişkin sağlar.
4. MICAM 02 sistemi, 2.2 ms görüntüleme süresi ya da 1,5 ms görüntüleme süresi ile 48 x 32 piksel çözünürlük ile 96 x 64 piksel çözünürlük kullanmak üzere ayarlayabilirsiniz. Her iki durumda da nöronların boyama çok güçlü değilse 'hbin' ayarı kullanılabilir.
5. Işık seviyesi fotoğraf modülasyon ve kaydedilen nöronların foto hasarı önlemek için mümkün olduğu kadar düşük (yani nöronların boya hala görüntüleme için yeterli floresan oluşturmak gerekir) olarak ayarlanır.
6. Oda aydınlatma ve geriye kalan tüm ışık kaynakları kapatılır. Buna ek olarak, dış kaynaklardan gelen ışığa maruz önlemek için kayıt teçhizat etrafında siyah bir perde kapatılır.
7. 16 saniye uzunluğunda - görüntüleme oturumları 4 arasında ayarlanır.
8. Çeşitli görüntüleme oturumda boyalı nöronların spontan aktivitesi kaydedilir.

5. Optik Görüntü Veri Analizi

MICAM 02 görüntüleme sistemi ile ilgili; görüntüleme verileri analiz etmek BVAna yazılımı (SciMedia Ltd, Tokyo, Japonya sürüm 10.08). Görüntüleme veri görselleştirme yazılımları destekler ve analiz araçlarının yanı sıra bir dizi sağlar. Veri analizi ve yorumlama adımları aşağıdaki gibidir:

1. Kaydedilen her nöron ilgi uygun bir dairesel bölge seçilir. Genelde biz 2 - 3 nöronlar, 48 x 32 piksel çözünürlükte ve 6 araştırmak için ilgi piksel yarıçapı bölgeler - 96 x 64 çözünürlükte nöronlar soruşturma ilgi 8 piksel yarıçapı bölgelerde.
2. Verilerin geçici yumuşatma boya veri floresan (düşük arka plan değeri nispeten düşük miktarda üretir Bu durum, özellikle gerekli olabilir; kullanılan ışık seviyesi düşük ya da düşük seviyede boya yükleme nedeniyle olabilir, örneğin neurite kaydedilen nöron). Genellikle bu gibi durumlarda biz 3 zamansal yumuşatma - 5 zaman birimi.
3. Optik kayıtların yanı sıra biz de ekstraselüler kayıt ekranını görüntüleme sistemi analog giriş görüntülemek için seçerek.
4. Bilgisayar ekranında tüm kayıtları görmek için, optik veri ve analog giriş görselleştirme için parametreler uygun şekilde ayarlanması gerekir.
5. Nöronlar, LVN ekstraselüler kayıt ve önceki hücre içi kayıt dayalı nöron sınıflandırma optik kayıtları göz önüne alındığında, nöron kimliğini belirlemek ve kaydedilen sinirsel faaliyetleri için faaliyet ilişkilendirmek mümkün. sinir.
6. Optik kayıtları açıkça gösteriyor ki, beklenen ve gerek kalmadan çok benzer olaylar, ekstraselüler kaydedilen ani ve aynı zamanda, diğer nöronların aktivitesi ile oluşan inhibitör post-sinaptik potansiyeller gibi eşik altı olaylar karşılık gelen sinirsel faaliyetleri üzerinde ortalama.
7. BVAna yazılım veri ihracat özellikleri, ilgi seçilen bölge ve aynı zamanda LVN kayıt içeren analog giriş için hesaplanan optik kayıtları ihracat kullanılabilir. Ihraç veri işleme ve diğer veri analiz yazılımı (örneğin basit durumda, Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ABD) ek görselleştirme ve veri işleme için kullanılan olabilir) kullanılarak analiz edilebilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 2 iki nöron (PD, pilorik dilatör nöron LP, lateral pilorik nöron) eş zamanlı kayıt LVN kayıt ile birlikte STG bir yengeç pilorik merkezi desen jeneratör gösterir. Intrasellüler kayıtları esas alınarak belirlenen LP ve PD nöronların optik kayıtları gösteriyor ki, LP ve PD nöronların ilgili ekstrasellüler kayıtları ile de gerçekten bu maç. Ganglion ve ekstraselüler kayıt sitesi arasında aksonal iletim gecikmesi nedeniyle tutarlı bir başak zirvelerinden optik ve LVN kayıtları arasında 12 ms gecikme (bkz. Şekil 2 iç) vardır. Sunulan veriler de açıkça saptanabilir kaydedilen nöronların ani karşılık soma nöral aktivitenin olduğunu gösterir.

s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1 A) stomatogastric sinir sistemi (STNS) şematik. Cog, commissural ganglion, RG, özofagus ganglion; STG stomatogastric ganglion; stn, stomatogastric sinir; LVN, lateral ventriküler sinir. B) yengeç stomatogastric ganglion (STG) - görüntü STG nöronların posterior semisirküler düzenleme gösterir.

Şekil 2 LVN kayıt ile birlikte PD tek bir süpürme Eşzamanlı kayıt ve LP nöron. Veri ve optik sinir kayıtları çok iyi maç olduğunu ve sinir forma kaydedildi ani gelen sinirsel faaliyetleri belirlemek olduğunu gösterir. Optik ve elektriksel olarak kaydedilerek faaliyetler arasındaki maç gösteren ve ortalama hem optik ve elektriksel olarak kaydedilen içerlek bir bindirme LP aksiyon potansiyelleri çeşitli tarama gösterir. Optik kayıt yöntemi biz de ¹⁴ PD ve LP nöronlar için karakteristik yavaş membran potansiyel değişiklikleri kaydetmek için veri düşük frekanslı bileşenlerini süzmek olmadığı gerçeği nedeniyle.

Tartışmalar

Elektrofizyoloji geleneksel yöntemler (hücre içi ve dışı elektrot kayıtları) ile birlikte nöronlar STG voltaj duyarlı boya görüntüleme ^8,9, bu küçük, çok iyi bilinen ve hala karmaşık sinir sistemi çalışır gelişmiş bir anlayış sağlar . STG merkezi desen jeneratör (CPG) nöron ağları ^{10, 11,} böylece daha iyi bir anlayış STG ortaya çıkan fonksiyonel özellikleri aynı zamanda genel olarak nasıl anlamak için yardımcı olacaktır (pilorik ve mide değirmen ritim ağları dahil olmak üzere) bir prototip . CPG ağları ağ seviyesi işlevselliği oluşturur. CPG ağlar ve aynı zamanda yüksek bilişsel işlevler ¹³ motor kontrolü ¹² kritik bir rol oynamaktadır, dolayısıyla onların acil özelliklerinin daha iyi anlaşılması sinirbilimin birçok alanda önemli bir etkisi olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MiCAM02	SciMedia		Imaging system
BVAna v.10.08	SciMedia		Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system
HL-151	Moritex, Tokyo, Japan		Ultra-low ripple halogen light source
BX51 WI	Olympus Corporation		Upright microscope for epifluorescence imaging
20x imaging objective	Olympus Corporation	XLUMPLFL20XW/0.95	NA 0.95, WD 2.0mm
10x imaging objective	Olympus Corporation	UMPLFL10XW	NA 0.30, WD 3.3mm
Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter	Olympus Corporation	MSWG2
Antivibration table	Scientifica Ltd	63-534
PatchStar electrode manipulator	Scientifica Ltd	PS-7000C	Micro-electrode manipulator
CED Power 1401	Cambridge Electronic Design		Data acquisition board
DL708E Oscilloscope	Yokogawa		Intracellular amplifier
AC differential amplifier	University of Kaiserslautern, Germany		Extracellular amplifier
P-97 Flaming – Brown type electrode puller	Sutter Instrument Co.		Electrode puller
Sigma Microcentrifuge 1-14	Sigma-Aldrich		Centrifuge
Genex Pipettors Mline	Scientific Laboratory Supplies LTD	PIP7774	PIP7774
Glass micropipette with filament	Science Products	GB100TF 8P	Glass for micr–lectrodes
MicroFil – 34G	World Precision Instruments, Inc.		Microfil needle
Spike 2 v6.10	Cambridge Electronic Design		Electrophysiology software
Di-8-ANEPPQ	Cambridge BioScience	BT61014	Fluorescent voltage sensitive dye
F-127 Pluronic Acid, DMSO	Invitrogen	P-3000MP	Solvent
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Crab saline component
CaCl2 . 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	Crab saline component
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	Crab saline component, electrolyte solution
MgCl2 . 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Crab saline component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	Crab saline component
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375	Crab saline component
Elastosil RT-601	Wacker, Munich, Germany		Lining of Petri dishes