Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi

Özet

Burada, beyin tümörlerinin cerrahi örnekleri, olarak adlandırılan "tümör eksplant yöntemi" ile ilaç etkinliğini test etmek için bir yöntem kurmuştur. Bu yöntemde, katı tümörlerin mikroçevresinin bozmadan ilaç etkinliğini değerlendirmek. Bu yöntemin güvenilirliğini doğrulamak için, ilk basamak kemoterapötik ajan, temozolomide tedavi glioma örnek temsili verileri açıklanmaktadır.

Özet

Malign glioma için mevcut tedaviler, sadece palyatif bir etkiye sahip. Terapötik gelişmesi için, bir engel mevcut ilaç etkinliği testleri ve hasta üzerinde etkinliği tespit etkinlik tutarsızlık. Böylece, ilaç etkinliğini değerlendirmek için yeni ve güvenilir yöntemleri klinik öncesi faz garantilidir. Tümör doku, hücre hatları da dahil olmak üzere in vitro kültüründe hücre kültürü yapay bir ortam neden olduğu kanser hücrelerinin önemli fenotipik, genetik ve epigenetik değişiklikler, in situ orijinal tümörlerin biyolojisi yansıtmıyor olabilir. Xenograftlarında bağışık yetmezliği olan farelere modelleri de, yani bağışıklık sistemi eksikliği sınırlamaları vardır ve mikroçevresinin genetik ve epigenetik farklılıklar interspecies. Burada, tedavi etkilerini değerlendirmek için undissociated tümör blok olarak malign glioma cerrahi örnekler kullanarak yeni bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntemi doğrulamak için, ilk satır mevcut kemoterapötik ajan, temozolomide (TMZ), ile veri açıklanmıştır.

Biz, deneyler için malign glioma taze kaldırıldı cerrahi örnek kullanılır. Kuluçka ve cerrahi örneklerin analizi ile takip TMZ veya diğer ilaç adayları, intratümöral enjeksiyon yapıldı. Burada, yeni anti-kanser tedavilerinin etkinliğini belirlemek için bir platform olarak biz, en azından bazı mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek ve mevcut deneysel arasındaki mevcut boşluğu doldurmak için mümkün olabilir, böylece tümör dokusu eksplant yöntemi kurmak için çalıştı veri ve gerçek bir hastanın tümör üzerindeki etkinliği. Bu yöntem, katı kanser tedavisi için yeni kemoterapötik ajanlar tespit hızlandırmak için potansiyeli olabilir.

Protokol

1. Ortam hazırlanması

1. Toz (1.01614.1000-EMD,% 0.6 Arıtılmış Agar çözüm - DMEM/F-12 (1X), Sıvı 01:01 (Invitrogen 10.565-042) - medya% 10 FBS (Gibco 16.140-071) kullanılarak hazırlanmıştır. .) Deney boyunca steril koşullar tutuldu.
2. FBS medya 5ml hazırlanması için (16.140-071 - Gibco) - 50ml son hacim Sıvı 1:1 (Invitrogen 10.565-042), DMEM/F-12 (1X) 45mL eklendi. Hazırlanan medya, 37 ° C sıcaklık su banyosunda tutuldu.
3. Agar çözüm ısı mikrodalga yöntemi kullanılarak hazırlanmıştır. 0.3 gram toz agar mikrodalga kullanarak 50ml distile su dağıldı. Agar çözüm su banyosu içine tutarak 37 ° C sıcaklığa kadar soğumaya oldu.
4. Biz medya adım 1.2 ve 1.3 ve hazır stok çözelti eşit hacimde kullandı. Oranı% 0.6 agar (0.5mL) ve% 10 FBS-D-MEM/F-12 medya (0.5mL), 1:1, 6 kuyucuğu her kuyuda toplam hacim 1 ml.

2. Doku işleme

1. Glioblastoma Multiforme (GBM) dokuları Patoloji Anabilim Dalı ameliyattan sonra hemen alındı. Doku Patoloji Anabilim Dalı GBM olarak sınıflandırıldı.
2. Doku dikkatlice forseps kullanarak patri plakalı aktarılır ve buz 5ml 1XPBS ile 3 kez yıkandı.
3. Disseke örneklerinden bir cerrahi bıçak (Feather-2976 # 10) ve forsepsle (balıkçı bilimsel) ile tümör bloklar (çapı yaklaşık 10 mm) oluşturmak için numuneler seri bölümleri kesilmiştir.
4. Blokları 6 plaka aktarılır. Her ortam de içeren oldu 1mL 1.4 adım söz. Doku doku canlı tutmak için hava yeterince maruz vardı.
5. Tümör bloklar sonra DMSO (% 5) veya TMZ (2.5 nM) enjekte edilir ve 37 ° 16 saat süreyle inkübe edildi ° C,% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş hava. DMSO 0.1ml (% 5) veya TMZ tutarlı tedavisi için farklı yerlerde tümör bloklar 3 kez enjekte edildi. 28G1 / 2 0.37X12.7mm İnsülin Şırınga 1mL (Rahatlık noktası 26.027) kullanarak ilaç enjekte edildi.
6. 16 saat sonra blok 3 kez 5 ml 1XPBS ile yıkandı. Bloklar yıkadıktan sonra 10 ml, 50 ml tüpler 24 saat için v / v% 10 formalin (Ricca kimya şirketi) (BASIX 5.539.802) ile tespit edildi ve 4μm bölümleri gömülü parafin için işlenmiş.
7. "HAYIR ISI" formalin sabit bölümünde heyecan plaka beher yerleştirilir ve 30 dakika her çözüm için aşağıdaki çözümleri yoluyla işlenmiş. % 30 etanol,% 50 etanol,% 75 etanol,% 80 etanol,% 95 etanol,% 100 etanol, ksilen.
8. Doku kağıt havlu, lekelenen ve 30 dakika boyunca erimiş parafin (58 - 60 ° C, Fisher paraplast parafin) yerleştirildi.
9. Doku Surgipath Blue Ribbon parafin kullanarak kalıpları gömülü, gömülü doku oda sıcaklığına kadar soğutulur.
10. Parafin 4μm doku kesitlerinde alınan ve Fisher Plus, slaytlar yerleştirildi.

3. İmmünohistokimya

Daha önce açıklandığı gibi İmmünohistokimya ^yapıldı. 1

1. Deparaffinization ve rehidrasyon rafa yerleştirin slaytlar ve aşağıdaki adımları uygulayın. 3x5 dakika (5 dakika boyunca 3 kez), 3x5 dakika süreyle% 100 etanol, 1x5 dakika boyunca% 95 etanol, 1x5 dakika boyunca% 70 etanol, ksilen, 3 dakika boyunca çalışan musluk suyu ile durulayın.
2. Bir cam behere distile su ile seyreltilmiş 1X sitrat tamponu (Thermo bilimsel-AP9003-500), ısıya bağlı epitopu alma daldırın slaytlar ile antigen retrieval. Sıcak bir tabak (emin bölümleri don "t slayt düşmek olun) 15 dakika boyunca kaynatın. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle soğuk çözüm. Slaytlar 3x5 dakika için 1X PBS ile yıkayın.
3. Iç peroksit inhibisyonu, 15 dakika boyunca cam beher% 0,3 hidrojen peroksit (distile su Fisher Scientific-BP2633-500-seyreltilmiş), metanol slaytları (Fisher Scientific-A-452-4) bırakın. 3x5 dakika için 1X PBS içinde durulayın.
4. % 10 normal keçi serumu ile dokuların Kapak engelleme. Nemli bir kutuya aktarın ve slaytlar az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Slaytlar, 3x5 dakika için 1X PBS ile yıkayın.
5. 1X PBS ile sulandırılmış insan özel Kaspaz-3 (1:1,000, Ar-Ge sistemleri, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15.626): Primer antikor Bölüm ° C primer antikor ile aşağıdaki konsantrasyonlarda 4 gece inkübe edildi. Ertesi gün 1X PBS 3x10 dakikalık slayt durulayın.
6. İkincil antikor reaksiyonu dokuların HRP etiketli ikincil antikor 2-3 damla (tahayyül sistemleri) ile kaplayın. Slaytlar nemli bir kutuya koyun ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 3x10 dakika için 1X PBS ile yıkayın.
7. Algılama üreticinin protokolü takiben primer antikor tespiti için kromojen DAB kiti (Vektör laboratuarlar-SK-4100) geliştirin.
8. Sayaç boyama (hematoksilen ile slaytlar daldırın 10-15 s saniye basılı tutun) emin don "t taşması DAB sinyali olun. 3 dakika şebeke musluk suyu ile durulayın.
9. Dehidrasyon daldırın aşağıdaki sırayla slaytlar, Ksilen 3x5 dakika için 5 dakika, 5 dakika boyunca% 95 etanol, 3x5 dakika süreyle% 100 etanol,% 70 etanol.
10. Kapak permount montaj reaktifi (Fisher Scientific-SP-15-100) ile slaytlar kayma.
11. Görüntüler Olympus floresan mikroskobu (DP-72) .3.11) kullanarak alınmıştır. Tüm deneyler, özel etiketleme primer antikor olmadan negatif kontrol tarafından da teyit edildi.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Glioblastoma multiforme (GBM) cerrahi örneği toplandı. Temozolomide (TMZ) dahil olmak üzere önceden kemoterapi olmadan hastalarda ilk cerrahi uygulandı. Şekil-1a Gadolinyum geliştirme ile MRI T1 ağırlıklı görüntü, ameliyattan önce sağ frontal lob gelişmiş bir tümör saptandı. Ameliyat sonrası görüntü (Şekil-1b), cerrahi sonrası lezyonun subtotal çıkarılması doğruladı. Cerrahi dokuların klinik tanı amaçlı Patoloji Anabilim gönderildi ve kalan örnekleri onaylanan Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK), Ohio State Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından da protokol kapsamında doku ihale işlendi. Hematoksilen ve Eosin (H & E) ile boyanarak nekroz varlığı pseudopallisading hücreleri, ve mikrovasküler proliferasyon (Şekil 1-c) gösterdi. Böylece, bu tümörlerin histopatolojik GBM olarak teşhis edildi. Notu, 48 saate kadar TMZ olmadan inkübasyon tümör eksplantlar GBM hücre mimarisini korumuştur. Aksine, 72 saat veya daha uzun kuluçka, bazı tümör hücreleri başlayan düşündüren örneklerinde yoğunlaşmış çekirdeklerin artan sayıda fark apoptozis tabi. Sonuç olarak, uzun inkübasyon sonrası tümör dokularında tümör hücrelerinin, tercihen nekrotik alanlar (veriler gösterilmemiştir) ve çevresinde gözlenmiştir kaybetti yamalı bölgeleri içeriyordu.

Bu tümör eksplant örnekleri güvenilir ilaç etkinliğini test amaçlı kullanılabilir araştırmak amacıyla, TMZ tedavi etkisi test edilmiştir. Şekil-2 Bu çalışmada deneyler akışını temsil eder. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, TMZ intratümöral enjeksiyon, ^bu ilacın 2 sistemik yönetiminin daha malign glioma büyüme kontrolü daha güçlü etkiye sahip olduğunu belirtti. 16 saat inkübasyon sonrasında, bu eksplantlar parafin ve seri bölümleri boyama için hazırlanmıştır gömüldü. TMZ tedavi GBM dokuların İmmünohistokimya kontrol örnekleri ile karşılaştırılması Ki-67 pozitif tümör hücrelerinin önemli bir azalma göstermiştir. Buna karşılık, bir apoptozis marker, Kaspaz-3, ile immünohistokimya TMZ tedavi glioma numuneler ve kontrol numuneleri (Şekil-3) arasında anlamlı bir fark elde edemedim.

TMZ ile tedavi etkisi daha fazla in vitro kültür veya flow sitometri ile birlikte bu eksplant tahlil birleştirerek karakterize edildi. Özellikle, kök hücre gibi tümör hücrelerinin (SCLTC) üzerindeki etkisini belirlemek için çalıştı. Bu nedenle, TMZ ile intratümöral tedaviyi takiben, küre oluşturan bu tümör eksplant tahlil ve flow sitometri yapıldı. TMZ muamele örnekleri tek tek tek hücrelerin içine ayrışmış ve bu tek hücre, serum serbest ortamda bFGF ve AGF ile desteklenen 96-kuyucuğu (1 mikrolitrelik hücre başına veya daha düşük) bir düşük yoğunluklu ekilirler. Kontrol grubunda ise 7 günlük inkübasyondan sonra, tümör eksplantlar tümör alanlarında oluşumu gözlenmiştir. Kürenin oluşumu SCLTC ^{3 4} bir özellik olduğu göz önüne alındığında, bir ilaç tedavisi ile tümör küre sayısında değişiklikler SCLTC üzerindeki etkisini gösterir. Benzer şekilde, bir hücre yüzey marker, CD133 ile ayrışmış tümör eksplant flow sitometri, SCLTC üzerindeki etkisini doğrulamak amacıyla yapılmıştır. GBM heterojen tümör hücrelerinde SCLTC seçici bir ilaç tedavisi ile ortadan kaldırılması ise, bir tedavi (veriler gösterilmemiştir) flow sitometri CD133 pozitif kesir azalma tespit tahmin olabilir.

Bir hasta GBM Şekil.1 Manyetik rezonans görüntüleri (MRG), operasyon öncesi Şekil-1a ve post-işlem Şekil-1b Temsilcisi rakamlar . Şekil-1c, taze GBM doku örneği H & E boyama. Orijinal büyütme, 40X.

Şekil. 2 blok kültür deney deneysel akışı Şekil-2a. Image taze cerrahi GBM patoloji bölümü alınan. Şekil-2b yardım cerrahi bıçak ile 10mm küçük parçalar halinde Diseksiyon tümör bloğu gösterir. Şekil-2c insülin şırınga kullanarak tümör blokları (TMZ) ilaç tedavi yöntemidir.

e 3 "/>
Şekil. 3 İmmünohistokimya aktif Kaspaz-3 ve Ki67 DMSO veya TMZ enjekte GBM doku blokları İmmünohistokimya. Hematoksilen nükleer boyanma için kullanılmıştır. Orijinal büyütme, 40X.

Tartışmalar

Ilacın etkinliği ve klinik öncesi deneysel modeller hastalarda etkinliği arasında bir boşluk vardır. Daha spesifik olarak, beyin tümörü araştırma alanında, roman ve güvenilir yöntemler mevcut yöntemleri ile ilaç değerlendirme ve hastalarda etkinliği arasındaki mevcut boşluğu doldurarak yardımcı olacağını gereklidir. Bu çalışmada açıklanan tahlil, etkilenen hastaların deneysel veriler ve sonuç tutarsızlık doldurarak kolaylaştırmak için bir çözüm değilse, ek bir varlık.

, In vitro hücre kültürleri Tercihen kültür koşulları ne olursa olsun belirli bir tümör hücre türleri genişletmek ve ek olarak ^sadece bir tümörün tamamını ICSI'nin 5 temsil eden yapay hücre genişleme, genetik ve fenotipik dönüşüm gerçekleşir ve uzun vadeli hücre kültürleri ile kaçınılmaz . Malign glioma tedavi için en önemli engellerden biri, tek bir tümör içinde ve tümör ^{örnekleri 6,} 7 arasında iki tümör hücrelerinin, heterojen . Bu nedenle, selektif zenginleştirme, ne olursa olsun bir tür veya başka bir tümör hücreleri belirli bir nüfusun heterojen tümör hücreleri üzerinde herhangi bir kemoterapötik ajanların etkinliğini belirlemek için uygun bir araç olamaz. Beyin tümörlerinin bir ICSI'nin türetilen ^{8 9} Herhangi bir hayvan modeli tümör hücrelerinin ICSI'nin ilaç etkinliği üzerine ışık tutacak, ancak tümörün tamamını.

Çeşitli sınırlamalar, diğer taraftan, hala bu tümör eksplant yöntemi olmaya devam etmektedir. Böyle bir sınırlama tedavi nispeten kısa bir süre. Malign tümör hücreleri değil, tüm tedaviler zamanla, kısa vadeli tümör hücre büyümesini ilk kontrolü uzun süreli hasta prognozu yansıtılacaktır olmayabilir eğer, çoğu direnç elde etmek için kabul olduğundan, yakın zamanda bir anti-rapor edildi anjiyogenik ajan, ¹⁰ bevacizumab. Böylece, uzun bir süre için dokuları korumak için bu eksplant tayini için protokol iyileştirilmesi, daha ileri araştırmalar gereklidir. Diğer bir soru, belirli bir tümör SCLTC üzerinde test edilen ilaç etkisi. SCLTC malign glioma, kuvvetli SCLTC garanti ortadan kaldırılması, yeni anti-kanser ilaçlar belirlenmesi için mevcut tedaviler oldukça dayanıklı olduğu göz önüne alındığında. Bu bağlamda, şu anda, neurosphere oluşturan assay (veriler gösterilmemiştir) gibi in vitro deneyler, sonraki bu eksplant tahlil birleştirmek için çalışırlar . Biz, bu kombine testleri aracılığıyla SCLTC bir ilaç adayı varsa, etkileri hakkında daha fazla bilgi edinmek almak için bekliyoruz. Son olarak, tümör örneklerinin küçük bloklar kullanılarak, geleneksel cerrahi örneklerinden tümör hücre hatları veya primer kültürlerinde olduğu gibi, tüm tümör hücre popülasyonlarının yansıtmıyor olabilir. Bu konular bir yana, vasküler niş de dahil olmak üzere tümör stroma, koruyarak, tümör hücreleri için çevresel faktörler karakterize yararlı olur. Bu nedenle, bu testte daha fizyolojik ilgili bir koşul altında herhangi bir tedavi stratejileri değerlendirmek için potansiyeli olabilir.

Burada, GBM cerrahi örneklerin eksplantlar ilaç etkinlik testleri için bir test kurdu. Aslında, test edilen cerrahi numuneler, TMZ direkt enjeksiyon GBM örneklerin çoğalması azalttığı bulundu. Bu doku eksplant yöntemi teorik diğer katı kanser uygulanabilir ve umarım bize kanserler için klinik çalışmalarda bir başarısızlık kaçınarak yardımcı olacak bir hastanın tümör ilaç etkinliği belirlemek için varlık sağlar.

Malzemeler

Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
Fetal Bovine Serum, Nitelikli, Isı-İnaktive	Gibco	16140-071
D-MEM/F-12 (1X) Sıvı 01:01	Invitrogen	10565-042
Agar-Agar Saflaştırılmış, Granül	EMD	1.01614.1000
Boyama DPBS	Invitrogen	14190
Hematoksilen	Richalrd allan BİLİM	7211
% 10 w / v formalin Kaspaz-3	Ricca kimyasal şirketi	3810
Kaspaz-3	Ar-Ge sistemleri	AF835
Ki67	Dako	15626
DMSO	Sigma	D2650
Sistem anti-fare imgeleyin	Dako	2012-07
Imgeleyin sistem anti-tavşan	Dako	2011-12
DAB-kit	Vektör Lab.	SK-4100

Ekipman Adı	Şirket	Katalog numarası
6 plaka	Greiner-biyolojik bir	657160
Petri kabı	VWR	25384-302
Serolojik pipet	Axygen
Filtre ipuçları	ABD bilimsel
500 mikron polyester mesh Netwell insert	Costar	3480
Matrigel Matrix	BD Biosciences	354230
BD 10 ml şırınga	BD biyoloji	309604
Hipodermik iğne Alüminyum Hub.	Tyco Health Care	2000029
Doku kültürü şişesi	Corning
Santrifüj tüpleri	BASIX	5539800
İnce borular	Eton	1107A
Cerrahi Bıçak paslanmaz çelik	Tüy	2976 # 10
İnsülin Şırınga	Rahatlık noktası	26027
50ml düz üst vidalı kapaklı tüp	BASIX	5539802
Diseksiyon mikroskobu	TriTech
Floresan mikroskop	Olympus	DP-72
Forsepsle	Fisher Bilim