Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux

Résumé

Ici, nous avons établi une méthode pour tester l'efficacité des médicaments avec des spécimens chirurgicaux de tumeurs du cerveau, appelée «méthode des explants tumoraux». Avec cette méthode, nous pouvons évaluer l'efficacité des médicaments sans casser le microenvironnement des tumeurs solides. Afin de valider la fiabilité de cette méthode, nous décrivons les données représentatives de notre échantillon de gliome traités avec le courant de première ligne agent chimiothérapeutique, le témozolomide.

Résumé

Les thérapies actuelles pour gliome malin ont effet palliatif seulement. Pour le développement de thérapeutiques, un obstacle est l'écart d'efficacité déterminée par les tests d'efficacité des médicaments et l'efficacité sur des patients. Ainsi, de nouvelles méthodes et fiable pour évaluer l'efficacité des médicaments sont garantis dans la phase pré-clinique. La culture in vitro de tissus tumoraux, y compris les lignées cellulaires, a d'importantes modifications phénotypiques, génétiques et épigénétiques des cellules cancéreuses causées par l'environnement artificiel de culture cellulaire, qui peuvent ne pas refléter la biologie des tumeurs d'origine in situ. Modèles de xénogreffe avec la souris immunodéficientes ont aussi leurs limites, à savoir le manque de système immunitaire et interspécifiques divergences génétiques et épigénétiques dans le micro. Ici, nous démontrons une nouvelle méthode utilisant les spécimens chirurgicaux des gliomes malins comme des blocs de tumeurs non dissocié pour évaluer les effets du traitement. Pour valider cette méthode, les données avec le courant de première ligne agent chimiothérapeutique, le témozolomide (TMZ), sont décrits.

Nous avons utilisé l'échantillon fraîchement retiré chirurgicale de gliome malin pour nos expériences. Nous avons effectué injection intratumorale de TMZ ou d'autres médicaments candidats, suivie d'une incubation et des analyses sur les prélèvements chirurgicaux. Ici, nous avons cherché à établir une méthode tissu tumoral explant comme une plateforme pour déterminer l'efficacité du roman de thérapies anti-cancéreuses afin que nous puissions être en mesure de surmonter, au moins, certaines des limites actuelles et combler le fossé existant entre le groupe expérimental en cours données et l'efficacité sur la tumeur d'un patient est réelle. Cette méthode peut avoir le potentiel d'accélérer l'identification de nouveaux agents chimiothérapeutiques pour le traitement de cancers solides.

Protocole

1. Préparation des supports

1. Les médias ont été préparés en utilisant 10% de FBS (16140-071 - GIBCO) dans DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen) avec une solution Agar 0,6% purifiée, granulé (1.01614.1000-EMD ). Des conditions stériles ont été maintenus tout au long de l'expérience.
2. Pour la préparation des supports 5mL de FBS (16140-071 - GIBCO) a été ajouté à 45 ml d'DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen) faisant volume final de 50 ml. Les médias préparée a été maintenu au bain-marie à 37 ° C de température.
3. La solution d'agar a été préparé en utilisant la méthode micro-ondes de chaleur. 0,3 grammes d'agar granulé a été dissous dans 50 ml d'eau distillée en utilisant micro-ondes. La solution d'agar était refroidir à 37 ° C de température en gardant l'eau dans le bain.
4. Nous avons utilisé un volume égal de presse de l'étape 1.2 et 1.3 et la solution mère préparée. Le ratio d'agar 0,6% (0,5 ml) et 10% FBS-D-MEM/F-12 médias (0,5 ml) était de 1:1, ce qui rend le volume total de 1 ml dans chaque puits de plaque de 6 puits.

2. Le traitement des tissus

1. Glioblastome multiforme (GBM) les tissus ont été reçus immédiatement après la chirurgie du Département de pathologie. Le tissu a été classé comme GBM du Département de pathologie.
2. Le tissu a été transféré à Patri-plaque à l'aide des pinces soin et lavé avec 5 mL 1XPBS glacée pour 3 fois.
3. Des coupes sériées des spécimens ont été coupés à partir des échantillons disséqués pour créer des blocs de tumeur (environ 10 mm de diamètre) avec une lame chirurgicale (Plume-2976 n ° 10) et pince (Fisher Scientific).
4. Les blocs ont été transférés dans une plaque à 6 puits. Chaque puits a été 1ml contenant des médias mentionnent à l'étape 1.4. Le tissu était suffisamment exposés à l'air de garder les tissus viables.
5. Tumeur blocs ont ensuite été injectées avec soit du DMSO (5%) ou TMZ (2,5 nM) et incubées pendant 16 heures à 37 ° C dans l'air humidifié contenant 5% de CO2. 0,1 ml de DMSO (5%) ou TMZ a été injecté 3 fois dans des blocs de tumeurs à différents endroits pour un traitement cohérent. Le médicament a été injecté à l'aide de 1 ml seringue à insuline 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Confort 26027 points).
6. Après 16 heures de blocs ont été lavées avec 5 ml pour 1XPBS 3 fois. Après le lavage des blocs ont été fixées avec 10 ml de 10% v / v de formol pendant 24 heures (Ricca Chemical Company) dans des tubes de 50 ml (Basix-5539802) et traitées pour paraffine 4μm sections.
7. La section du formol fixe a été placé dans le bécher sur la plaque de remuer avec "Pas de Chaleur" et traitées par les solutions suivantes pendant 30 minutes dans chaque solution. 30% d'éthanol, 50% d'éthanol, éthanol à 75%, 80% d'éthanol, 95% d'éthanol, l'éthanol à 100%, et le xylène.
8. Le tissu a été effacé sur du papier absorbant et placés dans de la paraffine fondue (58 à 60 ° C, Fisher Paraplast paraffine) pendant 30 minutes.
9. Le tissu a été embarqué dans des moules à l'aide de paraffine Surgipath Blue Ribbon, a été embarqué tissus refroidi à température ambiante.
10. Paraffine des coupes de tissus ont été prélevés et 4μm placées sur des lames plus Fisher.

3. L'immunohistochimie

L'immunohistochimie a été réalisée comme décrit précédemment. ¹

1. Déparaffinage et de la Place de réhydratation des lames dans un rack et exécutez les étapes suivantes. Xylène pour 3x5 minutes (3 fois pendant 5 minutes), l'éthanol à 100% pour les minutes 3x5, 95% d'éthanol pour les minutes 1x5, 70% d'éthanol pour les minutes 1x5, rincer à l'eau courante pendant 3 minutes.
2. Démasquage des antigènes avec la chaleur induite diapositives épitope Plongez dans un tampon citrate de récupération 1X (Thermo Scientific-AP9003-500) dilué dans de l'eau distillée dans un bécher de verre. Faire bouillir pendant 15 minutes sur une plaque chauffante (assurez-sections Don "t tomber la lame). Refroidir la solution pendant 30 minutes à température ambiante. Rincer les lames avec du PBS 1X pour les 3x5 minutes.
3. L'inhibition de peroxyde internes Immerger les lames dans du méthanol (Fisher Scientific-A-452-4) avec du peroxyde d'hydrogène de 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-dilué dans l'eau distillée) dans un récipient en verre pendant 15 minutes. Rincer dans du PBS 1X pour les 3x5 minutes.
4. Blocage Couvrir les tissus avec du sérum de chèvre normal à 10%. Placer les lames dans une boîte humide et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver les lames avec du PBS 1X pour les 3x5 minutes.
5. Les sections ont été incubées anticorps primaire nuit à 4 ° C avec l'anticorps primaire à des concentrations suivantes: humain de la Caspase-3 spécifiques (1:1000, la R & D Systems, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626), dilué avec du PBS 1X. Rincer les lames dans du PBS 1X 3x10 minutes le jour suivant.
6. Réaction d'anticorps secondaire Couvrir les tissus avec 2-3 gouttes d'anticorps secondaire marqué HRP (imaginer des systèmes). Mettez diapositives dans une boîte humide et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver avec du PBS 1X pour le 3x10 minutes.
7. Détection Développer pour le kit de chromogène DAB (Vector Laboratories-SK-4100) pour la détection des anticorps primaire selon le protocole du fabricant.
8. Contre coloration Plonger les diapositives à l'hématoxyline (10-15 s econdes, assurez-Don "t dépassement signal DAB). Rincer à l'eau du robinet pendant 3 minutes.
9. Plongez Déshydratation les diapositives dans l'ordre suivant, l'éthanol à 70% pendant 5 minutes, l'éthanol à 95% pendant 5 minutes, l'éthanol à 100% pour les minutes 3x5, 3x5 pour les Xylène minutes.
10. Lamelle les diapositives avec le réactif de montage Permount (Fisher Scientific-SP-15-100).
11. Les images ont été prises à l'aide Olympus microscope à fluorescence (DP-72) .3.11). Dans toutes les expériences, un étiquetage spécifique a été confirmée par le contrôle négatif sans anticorps primaire.

4. Les résultats représentatifs:

Nous avons recueilli des spécimens chirurgicaux du glioblastome multiforme (GBM). Les patients ont subi la première intervention chirurgicale sans chimiothérapies antérieures, y compris le témozolomide (TMZ). L'image pondérées en T1 de l'IRM avec gadolinium dans la figure 1a démontré une tumeur renforcée dans le lobe frontal droit avant la chirurgie. L'image post-opératoire (figure 1b-) a confirmé l'enlèvement subtotale de la lésion après la chirurgie. Les tissus chirurgicaux ont été envoyées au Département de pathologie à des fins de diagnostic clinique, et les échantillons restants ont été traités pour l'obtention des tissus sous l'Institutional Review Board a approuvé (CISR) du protocole à l'Ohio State University Medical Center. Hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration démontré la présence de nécrose, les cellules pseudopallisading, et la prolifération microvasculaire (figure 1-c). Ainsi, ces tumeurs ont été diagnostiquées comme histopathologiquement GBM. Fait à noter, les explants tumoraux suivants incubation sans TMZ jusqu'à 48 heures maintenu la cytoarchitecture du GBM. En revanche, avec une incubation pendant 72 heures ou plus, nous avons remarqué l'augmentation du nombre de noyaux de condensation dans les échantillons, ce qui suggère quelques-unes des cellules tumorales commencent à apoptose. En conséquence, les tissus tumoraux suivants incubation plus longue contenues régions inégales qui ont perdu les cellules tumorales, qui ont été préférentiellement observée à et autour des zones nécrotiques (données non présentées).

Afin d'étudier si ces échantillons explant tumoral peut être utilisée de manière fiable dans le but de tester l'efficacité des médicaments, nous avons testé l'effet du traitement TMZ. Figure-2 représente le flux des expériences dans cette étude. Une étude récente a montré que l'injection intratumorale de TMZ a un effet plus puissant sur ​​le contrôle de la croissance des gliomes malins que celle de l'administration systémique de ce médicament ^2. Après incubation pendant 16 heures, ces explants ont été intégrées à la paraffine et des coupes sériées ont été préparés pour la coloration. Immunohistochimie des tissus GBM TMZ-traités ont montré une réduction substantielle des cellules tumorales Ki-67-positifs en comparaison avec les échantillons de contrôle. À son tour, l'immunohistochimie avec un marqueur apoptose, la caspase-3, n'a pas donné aucune différence significative entre les échantillons de gliome TMZ-traitées et les échantillons de contrôle (Figure 3).

L'effet du traitement avec Temodal a été en outre caractérisé en combinant cette analyse avec explant soit en culture in vitro ou par cytométrie en flux. Plus précisément, nous avons cherché à déterminer l'effet sur les cellules souches, comme les cellules tumorales (SCLTC). Par conséquent, après un traitement avec Temodal intratumorale, nous avons effectué d'essai sphère formant et cytométrie de flux de ces explants tumoraux. Les spécimens ont été traitées à TMZ dissociées en cellules individuelles unique et ces cellules simples ont été ensemencées dans une faible densité (1 cellule par microlitre ou moins) dans des plaques de 96 puits dans un milieu sans sérum complété avec bFGF et EGF. Dans le groupe contrôle, la formation de tumeurs sphères de la tumeur a été observée explants après une incubation de 7 jours. Étant donné que la formation de la sphère est une propriété de SCLTC ^{3 4,} des altérations dans le nombre de sphères de tumeurs par un traitement médicamenteux indique l'effet sur ​​SCLTC. De même, la cytométrie en flux des explants tumoral dissocié avec un marqueur de surface cellulaire, CD133, a été réalisée afin de vérifier l'effet sur SCLTC. Si SCLTC dans les cellules tumorales hétérogènes dans le GBM sont sélectivement éliminées par un traitement médicamenteux, on peut prédire que la cytométrie en flux devrait détecter diminution de la fraction CD133-positif par un traitement (données non présentées).

Figure.1 images par résonance magnétique (IRM) d'un GBM patient. Représentant de chiffres pré-opération figure 1a et post-opératoire Figure 1b. Figure-1c est coloration H & E de l'échantillon GBM tissu frais. Grossissement original, 40X.

Figure. 2 Le flux expérimentaux de l'expérience de la culture du bloc. Figure-2a. Image du GBM chirurgicale frais reçus du département de pathologie. Figure 2b montre dissection du bloc tumorales dans 10mm petits morceaux avec l'aide de la lame chirurgicale. Figure-2c est la drogue (TMZ) le traitement des tumeurs à l'aide de blocs seringue à insuline.

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Figure. 3 immunohistochimie. Immunohistochimie des blocs de tissus GBM injecté avec du DMSO ou TMZ avec activé la caspase-3 et Ki67. Hématoxyline a été utilisé pour la coloration nucléaire. Grossissement original, 40X.

Discussion

Il ya un écart entre l'efficacité du médicament dans le courant pré-clinique des modèles expérimentaux et l'efficacité chez les patients. Plus précisément, dans le domaine de la recherche de tumeurs cérébrales, de nouvelles méthodes et fiables sont nécessaires qui permette de combler le fossé existant entre l'évaluation des médicaments avec les méthodes actuelles et l'efficacité chez les patients. L'essai décrit dans cette étude est un atout supplémentaire, sinon une solution, afin de faciliter le remplissage de la divergence des données expérimentales et les résultats des patients affectés.

Dans les cultures de cellules in vitro préférentiellement d'élargir certains types de cellules tumorales indépendamment des conditions de culture, et ne représentent qu'une sous-population de toute la tumeur. ⁵ De plus, la transformation génétique et phénotypique de l'expansion des cellules artificielles se produit et qu'elle est inévitable avec les cultures cellulaires à long terme . Un des obstacles majeurs pour traiter les gliomes malins est l'hétérogénéité des cellules tumorales, tant au sein d'une tumeur unique et entre les échantillons tumoraux ^{6, 7.} Par conséquent, l'enrichissement sélectif d'une certaine population de cellules tumorales, indépendamment d'un type ou un autre, peut-être pas un moyen approprié pour déterminer l'efficacité de toute agents chimiothérapeutiques sur les cellules tumorales hétérogènes. ^{8 9} Tout modèle animal de tumeurs cérébrales provenant d'une sous-population de cellules tumorales versé lumières sur l'efficacité des médicaments sur une sous-population, mais pas toute la tumeur.

Plusieurs limites, d'autre part, restent dans cette méthode des explants tumoraux. Une telle limitation est la période relativement courte de traitement. Depuis cellules tumorales malignes sont considérés à acquérir une résistance à la plupart, sinon tous, les thérapies au fil du temps, le contrôle initial de la croissance à court terme des cellules tumorales ne peut être reflétée par le pronostic du patient à long terme, comme l'a récemment rapporté avec un anti- agent angiogénique, le bevacizumab ^10. Ainsi, l'amélioration du protocole pour ce dosage explant de préserver les tissus pour une plus longue période est nécessaire avec d'autres investigations. Une autre question est un effet spécifique d'un médicament testé sur SCLTC dans la tumeur. Étant donné que SCLTC sont relativement résistantes aux thérapies actuelles pour gliome malin, l'identification de nouveaux médicaments anti-cancéreux qui puissamment éradiquer SCLTC est justifiée. À cet égard, nous cherchons actuellement à combiner ce test explant avec la suite des expériences in vitro, tels que le dosage formant Neurosphère (données non présentées). Nous nous attendons à en apprendre davantage sur les effets, le cas échéant, d'un candidat médicament sur SCLTC travers ces tests combinés. Enfin, à l'aide de petits blocs d'échantillons de tumeur peut ne pas refléter l'ensemble des populations de cellules tumorales, comme c'est le cas avec les lignes classiques des cellules tumorales ou des cultures primaires à partir de spécimens chirurgicaux. Ces questions de côté, la préservation du stroma tumoral, y compris la niche vasculaire, est utile dans la caractérisation des facteurs environnementaux pour les cellules tumorales. Par conséquent, ce test peut avoir un potentiel pour évaluer les stratégies thérapeutiques dans une condition plus physiologiquement pertinents.

Ici, nous avons établi un essai pour tester l'efficacité des médicaments avec des explants de prélèvements du GBM. En fait, avec les échantillons testés chirurgicale, nous avons constaté que d'une injection directe de TMZ réduit la prolifération dans les échantillons de glioblastome. Cette méthode explant tissulaire est théoriquement applicable à d'autres cancers solides et fournit des actifs afin de déterminer l'efficacité des médicaments sur la tumeur d'un patient, qui nous l'espérons, de nous aider à éviter un nouvel échec dans les essais cliniques pour le cancer.

matériels

Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
Sérum de veau fœtal, qualifié, inactivé par la chaleur	GIBCO	16140-071
D-MEM/F-12 liquides (1X) 01:01	Invitrogen	10565-042
Agar-Agar purifié, cristallisé	EMD	1.01614.1000
DPBS pour la coloration	Invitrogen	14190
Hematoxyllin	Richalrd Allan science	7211
10% p / v Caspase-3 du formol	Ricca Chemical Company	3810
Caspase-3	R & D de systèmes	AF835
Ki67	Dako	15626
DMSO	Sigma	D2650
Envision système anti-souris	Dako	2012-07
Envision système anti-lapin	Dako	2011-12
DAB-Kit	Vecteur Lab.	SK-4100

Nom de l'équipement	Société	Numéro de catalogue
6 plaques à puits	Greiner Bio-une	657160
Boîte de Petri	VWR	25384-302
Pipette sérologique	Axygen
Pointes à filtre	USA Scientific
500 um filet de polyester Netwell insérez	Costar	3480
Matrigel Matrice	BD Biosciences	354230
BD seringue de 10 mL	BD Biosciences	309604
Moyeu en aluminium aiguille hypodermique.	Tyco Health Care	2000029
Flacon de culture tissulaire	Corning
Tubes à centrifuger	Basix	5539800
Mince tubes à paroi	Eton	1107A
Lame en acier inoxydable chirurgical	Plume	2976 # 10
Seringue à insuline	Point de Confort	26027
50mL plate top tube bouchon à vis	Basix	5539802
Microscope à dissection	Tritech
Microscope à fluorescence	Olympus	DP-72
Pince	Fisher Sci