Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Özet

İşte biz bütün fare karaciğer doku sindirim, hücre zenginleştirme ve flow sitometri izolasyonu gerektiren bir süreçten CD133 eksprese karaciğer kök hücre ve kanser kök hücrelerin izolasyonu tarif. Biz gelişmiş tek hücre izolasyonu ve klonal genişleme için yöntemler içerir.

Özet

Karaciğer kök hücre ya da oval hücreler, kronik karaciğer hasarı sırasında çoğalırlar ve hepatosit ve cholangiocytes hem içine ayırt önerilmiştir. Buna ek olarak, karaciğer kök hücreleri karaciğer kanseri, Hepatosellüler karsinoma bir altkümesi için öncüleri olarak öne sürülmüştür. Karaciğer gibi herhangi bir solid organ hücre çalışmaları kök başlıca güçlüklerden biri, ayrıntılı analizi için hücre nadir nüfus izolasyon. Örneğin, karaciğer hücrelerinin büyük çoğunluğu non-parankimal hücreler önemli ölçüde daha büyük olan hepatositler (parankimal fraksiyon), vardır. Karaciğer spesifik hücresel bölmeleri (yani parankimal ve non-parankimal kesirler) zenginleştirmek, ve CD45 negatif hücreler için seçerek, biz izin bu raporda proceduresdetailed 600-fold.The üzerinde kök hücrelerin başlangıç ​​popülasyonu zenginleştirmek mümkün bir katı organ hücrelerin nispeten nadir bir nüfus verimli bir şekilde sıralanması. Bu işlem, isolateli etmek için kullanılabilirartmış karaciğer kök hücre proliferasyonu göstermek, normal fare karaciğer ver kök hücrelerin yanı sıra kronik karaciğer hasarı modelleri. Canlı hücreleri kullanarak fonksiyonel çalışmalar ilk co-lokalizasyon deneyler sonrasında yapılabilir gibi bu yöntem, dondurulmuş veya formalin tespitli karaciğer standart immunohistokimyasal üzerinde açık avantajları vardır. FACS izolasyon detayları özel enstrümantasyon ve temel akım sitometri prosedürlerin güçlü bir çalışma bilgi bağımlı olarak bu raporda özetlenen yordamı gerçekleştirmek için, bir araştırmaya dayalı bir akım sitometri çekirdeği ile bir çalışma ilişkisi kuvvetle teşvik edilir. Bu sürecin belirli bir hedefe klonal in vitro açılabilir karaciğer kök hücrelerinin bir nüfus izole etmektir.

Protokol

Tüm çözümler, medya, araçlar, filtreler ve tüpler steril olmalı ve kontaminasyon riskini azaltmak için steril tekniği ile ele olmalıdır. 4 ° C'de önceden ve mağaza içinde her tamponları ve medya 24 saat hazırlayın

1. Bütün karaciğer parankim ve non-parankimal ayırma

1. 10 ml steril PBS 5 mg kollajenaz, 5 mg pronaz ve 1 mg DNAz içeren vida üst bir 15 cc tüp kullanarak sindirimi için enzim çözeltisi hazırlayın.
2. Kurum onaylı (Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu) CO ₂ boğulma gibi yöntemini kullanarak fare Euthanize. % 70 etanol çözeltisi ile ötenazi hayvanların karın bölgesinde silin. Steril aletler, açık karın boşluğu ve eksplant karaciğer en-blok kullanma. Eksplante karaciğerde gelen safra kesesi çıkarın. Kapalı steril çanak laminer akış kaputu tamamen karaciğer aktarın.
3. Bu prosedür bir laminer akış kaputu tamamlanır. Steril bir jilet kullanarak, karaciğer kıymasteril çanak 1 dakika için birden fazla yatay ve dikey kesim kombinasyonu. Sıra ¼ Yukarıdaki adım 1.1 'den 10 cc kollajenaz ile PBS, pronaz ve DNAz 15 cc tüp kıyılmış karaciğer hamuru. Her ¼ kıyılmış karaciğer ile tekrarlayın.
4. 37 su banyosuna ¼ kıyılmış karaciğer hamuru ve enzimler ° C'de 45 dakika süreyle, 1-2 devir / saniye 'de çalkalayıcı ile birlikte il tüpler. Laminer akış kaputu transferi öncesinde su banyosundan çıkarıldıktan sonra% 70 etanol ile tüpler silin.
5. Bu prosedür bir laminer akış kaputu tamamlanır. Steril bir tabak içine toplamak için 70 mikron mesh filtre ile sindirilir karaciğer hamuru süzün. Steril DMEM 2 ml alikotları Kullanma:% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu ile F12 medya, filtre durulama ve püre filtresi aracılığıyla sindirmek hamuru için bir şırınga pistonu arasında kauçuk uç kullanın. Süzülen madde yaklaşık olarak 20 mL toplam hacim yapmak için 5 kez tekrarlayın. 2 eşit 15 ml tüpler içine süzülen bölün.
6. Tüm transferler la tamamlanmış olmalıdırminar akış kaputu ve ° C varsa 4'te soğutmalı santrifüj kullanın. 1 dakika için 50 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant # 1 katılım ve parankimal pelet atın. 1 dakika için 50 xg'de süpernatant 1. santrifüjleyin. Süpernatant 2. kaydedin ve pelet atın. 1 dakika için 50 xg'de süpernatant 2. santrifüjleyin. Süpernatant 3. Kaydet ve pelet atın. Non-parankimal fraksiyon elde etmek 8 dakika boyunca 180 xg'de için nihai süpernatant 3. santrifüjleyin.

2. Kırmızı hücre parçalanmasını

Laminer akış kaputu çalışın, hücreleri soğuk tutmak ve kullanım çözümleri 4 ° C'ye soğutuldu

1. İşlemden önceki gece, 10X konsantrasyonda stok BD Ecz steril distile su ile 1:10 seyreltme ile tampon Lyse seyreltilerek kırmızı hücre lizis tamponu hazırlayın. 1X 4 ° C'de 30 gün süreyle saklanabilir solutionshould
2. İşlemden önceki gece, steril PBS, Albumin% 0.5 sığır serum ve 2mM EDTA kullanarak Miltenyi tamponu hazırlayın. Vakum filtre kullanarak Filtre çözümü0.45 mikron filtre ünitesi. Orijinal plastik kapaklı tilter ünitenin üst kapak ve plastik wrap ile sabitleyin. 4 de Storeentire filtre birimi ° gazdan arındırmak EDTA ile 12 saat için C'dir. Filtre ünitesinin 12 saat sonra standart bir steril kap ile değiştirilebilir.
3. Bu prosedür bir laminer akış kaputu tamamlanır. 5 ml steril tüp kullanarak, yukarıdaki 2.1 1X seyreltilmiş kırmızı kan hücre lizis tamponu 1 mL içine yukarıdaki adım 1.6 olmayan parankimal pelet yeniden askıya. Laminer akış kaputu üzerinden aktarmak için tüp kapak takın.
4. 4 de 15 dakika boyunca 5seconds ve inkübe için yavaşça girdap ° C'de ışıktan korunur.
5. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
6. Bu prosedür bir laminer akış kaputu tamamlanır. Süpernatant içinde parçalanan RBCs atın ve 1 ml buz-soğuk ve steril Miltenyi tampon yeniden askıya pelet.
7. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
8. Bu prosedür bir laminer akış kaputu tamamlanır. 1 ml buz-soğuk ve steril Süpernatantı atın ve yeniden askıya peletMiltenyi tampon.
9. PBS hücre süspansiyonu 10 ul çıkarın ve 10 ul Tryan mavi ekleyin. Hemasitometre kullanarak remainingnon-parankimal hücreleri saymak.

3. Non-parankimal fraksiyondan CD45 hematopoetik hücre tükenmesi

Laminer akış kaputu çalışın, hücreleri soğuk tutmak ve kullanım çözümleri 4 ° C'ye soğutuldu

1. Kadar 108 toplam hücrelere 107 hücre başına Miltenyi tampon 100 mcL hücreleri erteleyin.
2. Her 107 hücre için 20 mcL Miltenyi CD45 microbead antikor uygulayın ve 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
3. Ek 2 ml Miltenyi tamponunu ekleyin ve 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj. Süpernatantı. 1 ml Miltenyi tampon hücre pelet (en fazla 108 toplam hücreleri) yeniden askıya.
4. Laminer akış kaputu, filtre hücreleri Miltenyi LD manyetik sütun kullanarak. Manyetik tutucu (Miltenyi MidiMACS ya QuadroMACS) sütun yerleştirerek başlayın. Aşağıdaki süzüntü yakalamak için filtre steril 5 ml tüp yerleştirin. 2 ml Milte yükleyerek sütun hazırlayınNyi tampon.
5. Ön filtre yıkama tamamlandığında, LD kolona hücreleri yükleyin. Hücre süspansiyonu sütunda sonra, 1 ml Miltenyi tamponu ekleyin ve 1 ml Miltenyi tamponu ilave 2 kez yıkayın tekrarlayın. Filtrasyon hızını arttırmak için sütun ile sağlanan piston KULLANMAYIN. SADECE filtre manyetik tutucusuna yerleştirilmiştir filtrat toplanır.
6. 5 dakika için 200 x g'da CD45-azalmış olmayan parankimal hücreler yaklaşık olarak 5 ml'lik toplanan süzüntü (sütun kalan 1 ml alır) santrifüjleyin. Muhafaza CD45 pozitif hücreler ile sütun atın.

4. CD133 pozitif hücrelerinin akış sitometrik tecrit

1. Oval hücre ortamı hazırlayın. Baz olarak% 10 ısı inaktive edilmiş cenin dana serumu ile F12 ortamı, ve HEPES (5 mol / L), ve penisilin / streptomisin (% 1 hacim / hacim) insülini (1 ug / mL) eklenir: 1:1 DMEM kullanın. 0.45 mikron filtre ile vakum filtre ünitesi kullanılarak Filtre çözümü.
2. 100 μ de Miltenyi tampon yeniden askıya hücreleri10 ⁷ hücre başına L. CD133-PE konjuge antikor 2 mcL ekleyin. Hücrelerin bir ikinci grup kullanarak, bir kontrol olarak IgG-PE ile konjuge antikor inkübe edilir. FACS için bir kontrol olarak boyanmamış boyanma önce hücre üçüncü bir grup saklayın.
3. Karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. 2 ml boyama tampon yeniden askıya. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin. 1 ml Miltenyi tampon Süpernatantı atın ve yeniden askıya pelet.
4. Bu adım, kuruma özgü olabilir standart akım sitometri hücre sıralama prosedürleri kullanılarak yapılır. Boyanmamış hücreleri ve IgG PE boyanan hücreleri kullanarak, CD133 + hücre popülasyonunun optimize yolluk için parametreleri sıralama ayarlayabilirsiniz. PE (R-Phytoerythrin) genel olarak 488 nm dalga boyunda yayan bir lazer sahip herhangi bir akış sitometresi ile birlikte de kullanılabilir. PE için tepe emisyon 575 nm ve FL-2 kanal tespit edilir.
   
   Not: Biz İleri, veri toplama için Hücre Görev programı ile, bir BD FACS Calibur veya BD FACS Vantage makineleri kullanımı kullanma Scatter ve log ölçek Side Scatter görünümü 250 ayarlı yan dağılım ile, hücre popülasyonu tespit etmek. FL1 ve FL2 log ölçek ve 550 olarak ayarlanır her ikisi de. Bu parametreler karaciğer dışı parankimal hücrelerde görüntülemek için bir ilk başlangıç ​​yeri sağlamak, pozitif ve negatif nüfus yoğunluğu boyanması göre gerektiğinde ayarlanır.
5. CD133 + geçidini kullanarak CD133 + hücre popülasyonu izole ve steril filtre hücresi medyada hücreleri toplamak.

5. Hücre kültürü yöntemleri

1. Santrifüj FACS 5 dakika için 200 x g'da hücreler toplanır. Ml başına yaklaşık 5000 hücre oval hücre medyada hücre pelet yeniden askıya. Yüksek konsantrasyonlarda, 50,000 hücre / ilk deneyleri için ml ile başlar, ve teknik geliştirir ve genel hücre canlılığı ve verimini geliştirir olarak azaltabilir.
2. BD Biocoat laminin üzerine Plakalı hücreleri 1000 hücre / cm ² ile 96 kuyucuğu kaplanmıştır. _% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde yer,. 24 saat sonra, Hepatosit Büyüme Faktörü (50 ng / nl) ve Epidermal Büyüme Faktörü (20 ng / ml) ekleyin.
3. Tek bir hücre için, bir 96 laminin kaplanmış plakanın her olarak oval hücre ortamdan 50 ul doğrudan hücreler izole eder. Tek olumlu hücrenin sıkı bir seçim için tek hücre FACS ayarlarını kullanın. Adım 5.2 'de yukarıdaki gibi 24 saat sonra, HGF ve EGF ile oval hücre ortamdan 50 ul ilave edin. Tam 5-7 gün sonra medya değiştirin.
4. Büyüyen koloniler, genellikle kaplama hücreleri ve hücre viabilitesi, toplam sayısına bağlı olarak, 2 hafta sonra ortaya çıkan% 50 birleşmiş, daha büyük olan sonra, hücreler aşağıda olarak 01:03 bölünmüş olabilir.
5. Tripsin% 0.05-EDTA kullanılarak Bölünmüş hücreleri. 50-100 mcL / iyi 96 plaka, iyi alt kaplamak için yeterli miktarda uygulayın. 3-5 dakika 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin.
6. Her kuyucuğa medya 100 mcL ekleyin ve 5 ml tüp için tüm sıvı transfer edilir. 5 dakika için 200 x g'da santrifüj ile her bir tüp için 1 mL ortam ekleyin.
7. Medya plaka yeniden askıya hücreleri i3 adet yeni kuyunun (1:3 oranı) içine plakası iyi 1 hücreleri kullanarak n laminin kaplama tabak.

6. RT-PCR kullanarak iki olası durum Onayı

Bu prosedür RNeasy Kit ile sağlanan RNeasy protokolü el kitabı, detaylandırılmıştır.

1. 96 plaka koloniler için RNeasy mikro sütunları kullanın. Her kuyudan kültür medya aspire. Doğrudan her bir kuyunun 75 ul Tampon RLT (RNeasy Kit) ekleyin. Steril lastik polis ile plaka alt kazıyın. 1 dakika için mikro-santrifüj tüp ve vorteks karışım içine Pipettelysate. Lizatları% 70 etanol ekleyin ve pipetleme tarafından karıştırın.
2. 10,000 rpm'de 15 saniye için 2 ml toplama tüpü (as RNeasy Kiti'nde) ve mikro-santrifüj santrifüj yerleştirilen RNeasy sütun çözüm aktarın. Yıkanan süzüntü atın.
3. Toplama tüpüne yeniden kullanabilirsiniz. Sütun yıkamak için 10.000 rpm'de 15 saniye RNeasy sütun ve santrifüj 350 mcL Tampon RW1 (RNeasy Kiti) eklemembran. Yıkanan yıkama atın.
4. 70 mcL tampon RDD (hem RNeasy Takımı verilen) 10 mcL DNaz I stok solüsyonu. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca RNeasy sütun membran ve inkübe için 80 mcL DNaz I Tampon RDD inkübasyon karışımı ekleyin.
5. Membran yıkamak için 10,000 rpm'de 15 saniye RNeasy sütun ve santrifüj 350 mcL Tampon RW1 (RNeasy kiti) ekleyin. Yıkanan yıkama ve toplama tüpü atın.
6. Yeni bir 2 ml toplama tüpü (RNeasy kitinde) olarak RNeasy sütun yerleştirin. Membran yıkamak için 10,000 rpm'de 15 saniye RNeasy sütun ve santrifüj 500 mcL tampon RPE (RNeasy Kiti) ekleyin. Yıkanan yıkama atın.
7. RNaz içermeyen su (RNeasy Kit) kullanılarak% 80 etanol hazırlayın. 10,000 rpm'de 2 dakika için RNeasy columnand santrifüj ila% 80 etanol ve 500 ul ekleyin. Yıkanan yıkama atın.
8. Yeni bir 2 ml toplama tüpü (RNeasy Kit) ve 5 dakika boyunca tam hızda santrifüj RNeasy sütun yerleştirin. Herhangi Elüsyonlanan yıkama ve col atınlection tüpü.
9. Yeni bir 1.5 ml'lik bir tüpte (RNeasy kiti) içinde RNeasy sütun yerleştirin. Tam devir 1 dakika için kolon zar ve santrifüj merkezi 14 mcL RNase içermeyen su (RNeasy Kiti) ekleyin. Saflaştırılmış RNA ile süzüntü toplayın ve ° C ileride kullanmak için eksi 80 hemen veya mağaza cDNA oluştururken eğer buz aktarmak.
10. Buz gibi soğuk tampon 1x RT içinde 10 birim / ul nihai konsantrasyon için Omniscript.Dilute RNaz inhibitörü kullanılarak ters transkripsiyon. 5 saniye, 5 saniye boyunca nabız santrifüj vorteksleyin. Omniscript protokol sayfa 13'e göre buz üzerinde yeni bir ana karışımı hazırlayın. 5 saniye, 5 saniye boyunca nabız santrifüj vorteksleyin. Bütün reaksiyonlar için gerek duyulan toplam için gerekli olandan% 10 daha fazla bir hacim master hazırlamak için önerilir.
11. Ana karışımı içeren bireysel tüplerine şablonu RNA ekleyin. 5 saniye, 5 saniye boyunca nabız santrifüj vorteksleyin. 37 de 60 dakika inkübe ° C.
12. Hepatosit PCR amplifikasyonu(Albumin) ve HotStarTaq DNA polimeraz kullanılarak epiteli özgü genler. HotStarTaq protokolü kitabın sayfa 15 başına reaksiyon karışımı hazırlayın. 20 pm / ul konsantrasyonu stok primerler seyreltilmesi tavsiye ve 1 mcL / reaksiyon tüpü ile ileri ve geri primerler kullanılmıştır. Başlangıçta RNA ekstraksiyonu için kullanılan hücre sayısına bağlı olarak, biz başlatmak için 3 reaksiyon tüpleri (, denetimi yüklemeden Albumin ve KRT19 için β-aktin) arasında cDNA nihai bölünmesi öneririz.
13. PCR primer dizaynı Tablo 1'de listelenmiştir.
14. PCR reaksiyon tüpleri içine yerleştirin. İlk deneyler için aşağıdaki programın tavsiye: 95 ° Cfor 15 dakika, ardından 95 x 1 döngü 30 saniye süreyle ° C, 55 ° C de 30 saniye, 72 ° C 30 saniye için 72 x tarafından izlenen 35 döngü, 10 ° C dakika.
15. PCR ürünleri agaroz jel emprenye etidyum bromür kullanılarak analiz edilir.

7. CD133 + kök hücreler tümör potansiyel Onayı

1. Bu işlem yapabilirsinizAdım 4 veya 5. adımdan itibaren kültüre oylandı hücreleri kullanılarak taze izole hücreler ile yapılabilir. Biz kültür hücreleri ile ilk deneyleri yapmak tavsiye olarak taze izole hücre canlılığı ve azalan verim düşer.
2. Yukarıdaki adım 5.5 'ten% 0.05 tripsin-EDTA kullanılarak hücrelerin Trypsinize. 37 ° C'de 3-5 dakika inkübasyondan sonra, her bir kuyunun medya 100 mcL ekleyin ve bireysel 5 ml tüpler (1 sıra = 1 tüp) her kuyudan tüm sıvı transfer edilir. 5 dakika için 200 x g'da santrifüj ve her bir tüp için 1 mL ortam ekleyin.
3. 1 ml buz gibi soğuk PBS hücreleri yeniden askıya. PBS hücre süspansiyonu 10 ul çıkarın ve 10 ul tripan mavi ekleyin. Tripan mavi dışlama kullanarak, canlı hücre sayıları belirler. FACS izole edilmiş hücreler kullanılarak, hücre sayısı FACS izolasyon sayımı ile tespit edilir.
4. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin hücreleri ve 1 x 10 ⁶ canlı cells/100 ul 'lik bir konsantrasyonda PBS içinde yeniden askıya alınmıştır. 100 ul Matrigel ekleyin. Altı haftalık bağışıklık eksikliği NudE farelerde subkütan 28 gague iğne ile enjekte edildi. Site başına 200 ul 1 x 10 ⁶ hücre enjekte edilir.
5. Fare günlük tümör büyümesi için izlenir. Bir kez tümörler genellikle 3-4 hafta inkübasyondan sonra, oluşturmak, tümör hacmi (yükseklik x uzunluk x genişlik) kumpas kullanılarak ölçülür.

8. Temsilcisi Sonuçlar:

Normal, sağlıklı fare karaciğer itibaren, CD133 + karaciğer kök hücrelerinin beklenen hücresel verimi karaciğer başına 1.000 ila 5.000 'dir. Bu hücreler sakin karaciğer nispeten nadirdir ve kültürü iyi yayılmaz. Biz normal karaciğer ve genişletmek yaşayan hücrelerin verimi son derece düşük olup üzerinde tek hücre analizi kullanmanızı tavsiye etmiyoruz.

^{/ - -} Veya karaciğer özel PTEN ^{- / -} farelerde, ^2-4 cel beklenen sayısı, 6 hafta ¹ veya MAT1a gibi kronik yaralanma ile sonuçlanan genetik modifikasyonu için DDC% 0.1 diyeti gibi önemli kronik yaralanma ciğeri için100,000 hücreler izole / karaciğer (Şekil 2) ile ls izole artar. Eğer karaciğer kök hücre izolasyonu için bu prosedürlerin tümörsüz hayvanlarda yapılmalıdır gibi spontan tümör oranının bilinmesi, kritik, genetik modeller kullanarak. Örneğin, MAT1a eğer ^{- / -} model formları 18 ayda spontan tümörler, önceden bildirilen herhangi bir spontan tümörlere, en geç 15-16 aydan hayvanlar kullanmanızı öneririz.

Kronik zedelenme modelleri tek hücre izolasyonu prosedürü hakim olup, hücre canlılığı sağlanır kez tek hücreden genişletin (3-9 colonies/96 plaka) çeşitli koloniler verecektir. 7 gün sonra genişletilmiş tek CD133 + hücreleri türetilmiş kolonilerin 3 bugünkü temsilcisi faz kontrast görüntüleri Şekil.

Iki potansiyel durum Onay Albumin ve Krt19 RT-PCR kullanılarak yapılır. Genişletilmiş tek hücreden Kolonileri (hepatositler belirteçleri için iki ifadeyi gösterecektir AlBumin) ve cholangiocytes (Krt19). Şekil 4 7 günde yaklaşık 25 hücre / koloni ile, üç izole koloniler gelen iki potansiyel ifadesi gösteriyor.

CD133 + normal karaciğer ve kimyasal bağlı karaciğer hasarında (6 hafta örneğin DDC 0.1% diyet) kök hücre çıplak farelerde tümörlerin oluşturmayacaktır. CD133 + belirli genetik modeller alınan kök hücreler (MAT1a ^{- / -} veya karaciğer özel PTEN ^{- / -} fareler) Geç ön-tümör kronik zedelenme fazında geç izole eğer çıplak farelerde tümörleri oluşturacaktır. Bu tümör oluşturucu fenotip şu anda bir kanser kök hücre olarak tanımlanan ^2-4 Örneğin, MAT1a ^{-. / -} Fareler için 18 haftalık spontan karaciğer tümörleri oluştururlar. Karaciğer hastalığının geç kronik yaralanma aşamasında, 15-16 hafta izole CD133 + karaciğer kök hücrelerinin, çıplak farelerdeki tümörlerde oluşturacaktır. Şekil 5 tek CD133 + karaciğer kök hücre in vitro büyütülebilir 1 x 10 ⁶ hücre bilateral enjeksiyon temsilcisi tümörleri gösterirs.

Gen	İleri Astar	Astar Ters
β-Aktin	5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 '	5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 '
Albümin	5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 '	5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 '
Keratin 19	5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 '	5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 '

Tablo 1: RT-PCR için primer tasarımı

Şekil 1: Genel yöntem şematik.

Şekil 2: CD133 yüksek zenginleştirilmiş CD45 tüketilmiş olmayan parankim fraksiyonu belirlenmiştir + karaciğer kök hücreleri Kontrol yaralanmamış karaciğer wild-tip. fareler% 0.4 zenginleştirilmiş CD45 tüketilmiş olmayan parankimal fraksiyon içindeki CD133 + hücreler gösterir. Knock-out genetik olarak MAT1a ^{- / -,} kronik karaciğer hasarının bir modeldir, CD133 nüfusun aynı yüksek oranda zenginleştirilmiş fraksiyonu içinde 10 kat veya daha fazla genişler.

Şekil 3: Tek CD133 + klonlar koloniler Genişleyen laminin kaplı 96 kuyucuğu genişletti tek CD133 + hücreleri türetilmiş dört kolonilerin Faz kontrastlı görüntüler..

Şekil 4:. CD133 + 'dan karaciğer kök hücre klonal genişletti koloniler Gün 7 azından, kolonilerin yaklaşık 25 hücrelerdir Bi-potansiyel gen ekspresyonu. Gen ekspresyonu CD133 + hücreleri iki potansiyel durumunu doğrularken, hepatosit işaretleyici Albumin ve epiteli işaretleyici Krt19 ifade gösterir.

ve_content ">
Şekil 5: CD133 + karaciğer kök hücreleri çıplak farelerde tümörleri oluştururlar Oklar MAT1a enjekte 1x10 ⁶ CD133 + hücreler 4 hafta sonra büyüyen tümörleri gösterir ^{- / -} modeli.. CD133 + örneğin CCl ₄ ya da% 0.1 DDC diyet olarak toksin kaynaklı kronik karaciğer hasarı hücreleri, tümörler şeklinde değildir. Tümör oluşumu kök hücre nüfus içinde malign potansiyeli, ya da kanser kök hücre fenotipi tanımlamak için kullanılır.

Tartışmalar

Hematopoietik sistem aksine, hangi hematopoetik kök hücre replacesnormal fizyolojik turn-üzerinde lökositler, kırmızı kan hücreleri ve trombositler, karaciğer kök hücre, veya yetişkin karaciğer progenitör hücrelerin, normal karaciğer katılmayan bir hücresel farklılaşma sistemi korumak için sorumludur homeostasis. ^5,6 akut karaciğer hasarı veya kısmi hepatektomi, hepatositler, sonra farklılaşmış karaciğer epitel olarak, kayıp karaciğer kitlesi yerine yayılması birkaç tur geçmesi. ^5,6 Sadece kronik zedelenme sırasında gözlenen karaciğer kök hücreler çoğalmaya. ^{1,5 -11} Bunlar yetişkin, organ spesifik kök hücreler ^1,5-8 İlginçtir, karaciğer kanseri büyük çoğunluğu kronik yaralanma arka plan üzerinde gelişir. hepatosit ve cholangiocytes hem içine ayırt etmek için önerilmiştir ve bu nedenle karaciğer kök hücreleri de olduğu öne sürülmüştür karaciğer kanseri bir altkümesi için öncüleri. ^2-4,12-17

Okaraciğer hücre çalışmaları kök önemli sorunlardan ne fonksiyonel analizi için hücrelerin nadir populasyon izolasyonu olduğunu. Örneğin, karaciğer hücrelerinin büyük çoğunluğu cholangiocytes ve diğer küçük olmayan parankimal hücreler önemli ölçüde daha büyük olan hepatositler, vardır. Hücrenin bölmelere (- parankimal fraksiyon ve küçük hücreler - büyük hepatositlerin olmayan parankim fraksiyonu) içine bütün karaciğer kırarak, ve daha fazla CD45 negatif hücrelerin (non-hematopoetik hücreler) için seçerek, biz kök hücrelerin başlangıç ​​popülasyonu zenginleştirmek mümkün 600 kat fazla. Unutmayın ki ^1,18-21, biz CD133 + nüfusunun% 100 saf kök hücre popülasyonu, ama açıkça farklı soy ve repopulation potansiyeli ile, hücrelerin heterojen nüfus temsil ettiğini belirten hiçbir şekilde vardır. Alanın önemli sınırlamalar biri kök hücre ve progenitör hücrelerin tanımlarını olduğunu. Biz bu çalışmada daha geniş terim "kök hücre" kullanabilirsiniz, ancak sıkı tanımı, CD133 + non-parenchymal hücreler iki soy progenitör nüfusu temsil eder. Karaciğerde mevcut kök ve progenitör araştırma durumu göz önüne alındığında, bu rapor bu alanda ilgilenen araştırmacılar için bir başlangıç ​​noktası sağlamaz. Bu tür yeni belirteçler EpCAM, ^22,23 ya da bu gibi SOX9 gibi transkripsiyon faktörleri, ²⁴ gibi, çıktıkça bunlar dahil edilebilir. Örneğin, biz EpCAM + hücreleri ve CD133 + hücreler arasındaki örtüşme oldukça yüksek oranda bulduk.

Karaciğer kök hücre çoğalması artışı gösteren normal bir fare karaciğer gibi kronik karaciğer hasarı modellerinden kök hücre izolasyonu için bu yazıda ayrıntılı bir süreç. Canlı hücreleri kullanarak fonksiyonel çalışmalar izolasyonu sonra yapılabilir gibi bu yöntem, dondurulmuş veya formalin tespitli karaciğer standart immunohistokimyasal üzerinde belirgin avantajları vardır. ^1,3,4 Bu sürecin belirli bir amaç olabilir karaciğer kök hücrelerin nispeten saf nüfusu izole etmektir klonal vitro yaygınlaştırılmalıdır.

Bu prosedüre birincil sınırlama izole hücrelerin çoğunluğu (Sorun Giderme bölümüne bakınız) akım sitometri sonra geçerli olmayacak olmasıdır. Bu hücrelerini hazırlamak için gereken saat sonucudur ve önceki izolasyon için nüfus arıtmak için gerekli olan çok sayıda prosedürleri. Karaciğer acil FACS analizi için tek bir hücre süspansiyonu sindirilir ise, hepatosit ve diğer non-parankimal hücreler arasındaki boyut farkı etkili FACS kapısı yaratılması imkansız hale getirecek. Karaciğer dışı parankimal hücrelerin hematopoetik hücrelerin ortadan kaldırmadan, kullanılan varsa, CD133 + hücreler önemli sayıda kesir kirletebilir hematopoetik kökenli olabileceği riski vardır. Ayrıca, Miltenyi filtre yoluyla hücreler işleme göre, tek tek hücreler ve hücre kümeleri oldukça küçük toplanır. Bu örnek FACS alımı iğne tıkamaz sağlar.

Bu prosedür için Alternatifler m dahilgibi belirteçler, herhangi bir alternatif hücre yüzeyi gibi CD49f, EpCAM olarak işaretleyici, ya da kombinasyon için odification CD133 + EpCAM + ikinci bir yayınlanan raporda olmayan bir parankimal fraksiyondan karaciğer kök hücreleri izole etmek için bir yoğunluk gradiyenti kullanır. Bu prosedür Ultra-santrifüj (8000 xg) gerektirir, prosedürü için önemli bir zaman ekler ve bizim deneyim, büyük ölçüde ön FACS hücresel verimi ve post-FACS canlılığı azalır. ⁸

Gelecekteki deneyler fetal böyle HNF3, HNF4α gibi karaciğer genlerin ve αfp.In ek olarak, Western blot analizi ile ifade edilen proteinlerin immünsitokimya kültürdeki hücre RT-PCR sonuçları teyit etmek için kullanılabilir içeren gen ekspresyon analizi daha geniş bir aralıkta bulunmaktadır.

Unutulmaması gereken bir konu Biz artık rutin stellat hücreleri belirteçleri (Sorun Giderme bölümüne bakınız) yönelik örnekler taranması ^25. Karaciğer yıldızsı hücreleri üzerinde CD133 ekspresyonu tespit son eseridir ve kimliği yokBizim kesirler önemli kontaminasyon yazısından. Bu karaciğer sindirim ve hücre izolasyonu farklı teknikleri. ^2,3,26 ilgili olabilir

Hücrelerin çoğunluğu hemen FACS izolasyon sonrasında uygulanabilir olmayacağı gerçeğine dayanarak, biz hayvanlarda kullanmadan önce, toplu CD133 + hücreleri veya tek hücre şeklinde, ya hücreler kaplı olmasını öneririz. In vitro 5-7 gün anlamlı tümörü analiz sonuçları iyileştirecektir. Koloniler toplu CD133 + izole hücrelerinden açılabilir kez ek olarak, tek bir hücre izolasyonu zorluklarına verilen, bu yalnızca yapılmalıdır. Kültür karaciğer kök ve progenitör hücreler için kullanılan olabilir, çeşitli kültür koşulları ve iskele proteinlerinin bir daha kapsamlı bir tartışma sıra Lola Reid ile karakterize edilmiştir. Bu çalışma temel izolasyon teknikleri öğrenilebiliyor kez araştırmacıların kendi araştırma programı içine dahil olabilir alternatif koşulları ve değişiklikler sağlar. ^27,28 Dr Reid kelk da karaciğer kök hücreleri ve kararlı ataları arasında soy biyoloji ve olgunlaşma daha ayrıntılı bir analiz sunmaktadır.

In vivo tümör analizi açısından, öncelikle 1x10 ⁶ hücre kullanılarak, in vitro klonal genişletti CD133 + hücreleri taze izole hücreler ve hücreleri kullanılarak başarı oldu. ^{/ - -} Ve karaciğer özel PTEN ^{- / -} Biz kronik karaciğer hasarının ontwo genetik suşları, MAT1a odaklanmıştır fareler ve biz çıplak farelerin ve tümör büyümesi için hosts olarak wild-tip farelerden iki faydalanmış. Onlar pre-malign belirgin karaciğer hasarı modellerinde izole ise bizim deneyimlerimize göre, CD133 + karaciğer kök hücreleri sadece tümörleri oluşturacaktır. Unutmayın CD133 oluşan tümörler + hücrelerin genel tümörleri için bir kök hücre veya progenitör hücre kökenli düşündüren, hepatoselüler karsinom ve kolanjiokarsinom özellikleri de var. ^2-4,29

Tümörler sonra takip çalışmaları inclu belgelenmiştirdes standart tümör dokusunun patolojik analizi (H & E boyama) ve immünohistokimyasal boyama. Buna ek olarak, tümörler FACS analizi ya da yeniden kültür için kıyılmış ve sindirilebilir. ^2-4,30

Sonuç olarak, biz CD133 + karaciğer kök hücreleri ve CD133 + kanser kök hücrelerinin izolasyonu, genişleme, ve temel karakterizasyonu için bir prosedür detaylandırılmıştır.

Çekim Trouble:

CD45 kontaminasyon:

Önceki FACS analizi ve izolasyon bir CD45-FITC Ab ekleyerek değerlendirilebilir CD45 + hücreleri, kirlenme varsa Adım 3 için, CD45 antikoru microbead süresinin dolmadığından emin olmak için kontrol edin ve süzüntü toplandı sadece ederken filtre manyetik tutucu idi. Filtre manyetik tutucu CD45 + hücreler içerir değilken herhangi bir süzüntü toplanır.

Düşük hücre sayısı:

Yaralanmamış karaciğer, toplam numbe içinCD133 r + non-parankimal izole 10.000 daha az olabilir. Bu hücreler sakin karaciğerde nadirdir. Bu tür DDC% 0.1 diyet gibi bir kronik yaralanması modeli için, 100.000 hücre sayısı önemli ölçüde artacaktır. Toplam hücre sayısı önemli ölçüde bu sayıların altında ise, dikkate alınması gereken bir konu FACS Ab boyama olduğunu. Yoksul boyama yoksul bir randıman vereceğini gibi, CD133 Ab dolmamış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Ayrıca, biz FACS izolasyon açmadan önce göreli nüfusu belirlemek için karaciğer dışı parankimal hücreler FACS analizi gerçekleştirerek öneririz.

FACS sonrası Düşük hücre canlılığı:

Canlılığının konulardan biri hücreleri nasıl işlendiğini bağlı ve ne zaman içinde. Olabilir İdeal olarak, tüm hücre izolasyon prosedürü, 1-4 adımları, adımlar arasındaki herhangi bir gecikme olmadan yapılmış ve aynı gün içinde tamamlanması gerekir. 1-4 adımları arasında herhangi önemli bir gecikme büyük ölçüde hücre canlılığı azaltacaktır. C ile ilgili ikinci bir konuell canlılığı FACS izolasyonu için kullanılan kılıf basıncı ile ilişkili olabilir. Biz daha düşük bir kılıf basınç kullanmanızı öneririz. Hücreler izole edilir kez sıralama sonrasında buz üzerinde önemli bir depolama alanı da canlılığı azaltacaktır gibi Son olarak, onlar, hemen kaplı olmalıdır.

CD133 + non-parankimal heterojenite:

Son raporlar hepatik stellat hücreler de CD133 ekspresyonu ve bazı plastisite var olabileceğine işaret etmektedir. Dolayısıyla ^25, Albumin ve Krt19, ek doğrulama ile iki potens genleri doğrulayan ek olarak bu tür glial fibriler asidik protein olarak stellat hücreler ile ilişkili genlerin, içerebilir hareketsiz stellat hücreleri ve aktive edilmiş hücreler stellat ve alfa-aktin ve desmin. ^3,4,26 Buna ek olarak, CD133 + nüfusun daha geniş bir projenitör nüfus temsil eder. Böyle EpCAM gibi ikinci bir işaretçi, ve aynca nüfus düzeltilmesine yardımcı ve sınır heterojenite olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
DMEM: F12	Invitrogen	10565-018	Fenol kırmızısı ile
CD45 mikroboncukları	Miltenyi	130-052-301
Hepatosit Büyüme Faktörü	Sigma	H1404
Epidermal Büyüme Faktörü	Sigma	E4127
DNaz	Sigma	DN25	1 gram
Kollajenaz D	Roche	1088874
Pronazın	Roche	0165921
70 mikron mesh süzgeç	Balıkçı	352350
Omniscript RT	Quaigen	205111	50 reaksiyon
HotStarTaq	Quaigen	203203
Miltenyi LD sütunu	Miltenyi	130-042-901
CD133-PE FACS Ab	eBioscience	12-1331-82
Laminin kaplı plakalar	BD	354410	De 96
Tripsin% 0.05 EDTA	Invitrogen	25300-354	100 mL
RNeasy Mikro Kiti	Quaigen	74004	5x10 5 hücre veya daha az için 50 sütun
Lyse Ecz	BD	555899	10X konsantrasyonda