Выделение CD133 + печень стволовых клеток для клональной экспансии

Резюме

Здесь мы описываем изоляции CD133 выражения печени стволовые клетки и раковые стволовые клетки из мышиных целом печени, процесс, который требует тканей пищеварения, клетки обогащения и изоляции проточной цитометрии. Мы включать методы для продвинутых одном изоляторе и клональной экспансии.

Аннотация

Печень стволовых клеток, или овальные клетки, размножаются при хроническом поражении печени, и предложил дифференцироваться в гепатоциты и как холангиоцитов. Кроме того, стволовых клеток печени предположили, что предшественниками для подмножества рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы. Одной из основных проблем в стволовые клетки произведения в любой твердый орган, как печень является выделение редких популяции клеток для детального анализа. Например, подавляющее большинство клеток в печени, гепатоциты (паренхиматозные фракции), который значительно больше, чем не-паренхиматозные клетки. По обогащения специфический клеточный отсеков печени (например, паренхиматозные и не паренхиматозных фракции), и выбрав для CD45 негативные клетки, мы можем обогатить начиная популяция стволовых клеток более чем 600-fold.The proceduresdetailed в этом отчет позволяет относительно редкие популяции клеток из твердого органа должны быть отсортированы эффективно. Этот процесс может быть использован для isolateliверсия стволовых клеток из нормальных мышиных печени, а также хронического поражения печени моделей, которые демонстрируют увеличение печени стволовых клеток. Этот метод имеет очевидные преимущества по сравнению со стандартными иммуногистохимии замороженных или фиксированных формалином и печени, функциональных исследований с использованием живых клеток может быть выполнено после первого совместного локализации экспериментов. Для выполнения процедуры, описанной в настоящем докладе, рабочие отношения с исследования на основе проточной цитометрии основной настоятельно рекомендуется, так как данные изоляции FACS сильно зависят от специализированных приборов и сильное знание основных проточной цитометрии процедур. Конкретная цель этого процесса заключается в изоляции населения печени стволовыми клетками, которые могут быть расширены клонально в пробирке.

протокол

Все решения, средств массовой информации, инструменты, фильтры и трубы должны быть стерильными и обращаться с стерильных, чтобы уменьшить риск заражения. Подготовьте все буферы и средств массовой информации 24 часа заранее и хранить при 4 ° C.

1. Паренхимы и не паренхиматозных отделения от целого печени

1. Подготовка раствора фермента для переваривания использованием 15 мл трубки с завинчивающейся крышкой в ​​10 мл стерильной PBS, содержащего 5 мг коллагеназы, 5 мг проназа и 1 мг ДНКазы.
2. Усыпить мыши, используя учреждении, утвержденном (Институциональные уходу и использованию животных комитета) методов, таких как CO ₂ удушья. Протрите брюшной области эвтаназии животных с 70% раствором этанола. Используя стерильные инструменты, открытые брюшной полости и печени эксплантов ан-блок. Удалить желчный пузырь от печени эксплантированных. Передача целом печени ламинарного потока капота в закрытом стерильную чашку.
3. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Использование стерильных лезвие бритвы, пропустить через мясорубку печень сКомбинация из нескольких горизонтальных и вертикальных разрезов в течение 1 минуты в стерильную чашку. Место ¼ измельченного целлюлозно печени в 15 мл трубки с 10 мл PBS с коллагеназы, проназа, и ДНКазы с шагом 1.1 выше. Повторите с каждой ¼ рубленой печени.
4. Место труб с ¼ фарш целлюлозно печени и ферментов в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 45 минут, шейкер на 1-2 циклов / секунду. Протирать трубки с 70% этанола после снятия с водяной бани до передачи в ламинарный поток капот.
5. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Процедить усваивается печенью пульпы через 70 микрон сетчатый фильтр, чтобы собрать в стерильную чашку. Используя 2 мл аликвоты стерильного DMEM: F12 среды с 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сывороткой, промыть фильтр и используйте резиновые конца поршень шприца, чтобы пюре перевариваются целлюлоза через фильтр. Повторите 5 раз, чтобы общий объем фильтрата примерно 20 мл. Разделите фильтрата на 2 равные 15 ламп мл.
6. Все переводы должны быть завершены в ла-Минар потоком воздуха, а также использовать охлаждаемой центрифуге при 4 ° C, если доступно. Центрифуга на 50 мкг на 1 минуту. Сохранить супернатант № 1 и выбросить паренхиматозных гранул. Центрифуга супернатант № 1 при 50 мкг на 1 минуту. Сохранить супернатант № 2 и отбросить гранул. Центрифуга супернатант № 2 при 50 мкг на 1 минуту. Сохранить супернатант № 3 и выбросить гранул. Центрифуга окончательного супернатант № 3 на 180 мкг в течение 8 минут, чтобы получить не-паренхиматозные фракции.

2. Красный лизис клеток

Работа в ламинарный поток капота, держать клетки холодно, и использование решений охлаждают до 4 ° C.

1. В ночь перед процедурой подготовки красного буфера для лизиса клетки путем разбавления в 10 раз концентрации складе BD Pharm Lyse буфер разведении 1:10 стерильной дистиллированной водой. 1X solutionshould храниться в течение 30 дней при 4 ° C.
2. В ночь перед процедурой подготовки Miltenyi буфера с помощью стерильного PBS, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, и 2 мМ ЭДТА. Фильтр решения с помощью вакуум-фильтраблок с фильтром 0,45 мкм. Крышка верхней части кантователь устройство с оригинальной пластиковой крышкой и закрепите с помощью пластиковой пленкой. Storeentire фильтра при 4 ° С в течение 12 часов для дегазации EDTA. Фильтрующий блок может быть заменен на стандартную стерильной крышкой после 12 часов.
3. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Используя 5 мл стерильной пробирке, вновь приостановить без паренхиматозных гранул, начиная с шага 1.6 выше в 1 мл 1X разбавленный красных клеток крови лизис буфера с 2,1 выше. Закрывают трубку для передачи из ламинаре.
4. Аккуратно вихря для 5 сек и инкубировать 15 минут при 4 ° C в защищенном от света.
5. Центрифуга при 200 х г в течение 5 минут.
6. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Откажитесь лизированных эритроцитов в супернатант, и вновь приостановить гранул в 1 мл ледяного буфера и стерильные Miltenyi.
7. Центрифуга при 200 х г в течение 5 минут.
8. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в 1 мл ледяной и стерильныйMiltenyi буфера.
9. Удалить 10 мкл суспензии клеток PBS и добавить 10 мкл синие tryan. Граф remainingnon-паренхиматозных клеток с использованием гемоцитометра.

3. CD45 гемопоэтические клетки от истощения, не паренхиматозных фракции

Работа в ламинарный поток капота, держать клетки холодно, и использование решений охлаждают до 4 ° C.

1. Приостановить клеток в 100 мкл буфера Miltenyi на 107 клеток до 108 общего числа клеток.
2. Применяют 20 мкл Miltenyi CD45 Microbead антител для каждого 107 клеток и инкубировали при 4 ° С в течение 15 минут.
3. Добавить еще 2 мл Miltenyi буфера и центрифугируют при 200 х г в течение 5 минут. Удалить супернатант. Повторное приостановить осадок клеток (до 108 общего числа клеток) в 1 мл буфера Miltenyi.
4. В ламинарного потока капот, фильтр клеток с использованием магнитных Miltenyi LD колонки. Начнем с размещения колонки в магнитный держатель (Miltenyi MidiMACS или QuadroMACS). Поместите стерильный 5 мл трубки ниже фильтра поймать фильтрата. Подготовка колонки при загрузке 2 мл MilteNyi буфера.
5. После предварительного фильтра стирки завершится, загрузите клеток на колонке LD. После клеточной суспензии находится в пределах колонки, добавляют 1 мл Miltenyi буфер и повторить 1 мл промывочного буфера Miltenyi 2 дополнительных раза. Не используйте поршень снабжен колонке, чтобы увеличить скорость фильтрации. Только собирают фильтрат, когда фильтр помещен в магнитный держатель.
6. Центрифуга собранных фильтрата примерно 5 мл (столбец содержит оставшиеся 1 мл) CD45-обедненного без паренхиматозных клеток при 200 х г в течение 5 минут. Откажитесь от колонки с сохранены CD45-положительных клеток.

4. Проточной цитометрии изоляции CD133-положительных клеток

1. Подготовка овальной СМИ ячейки. Используйте 1:01 DMEM: F12 среду с 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки в качестве базового, а также добавлять инсулин (1 мкг / мл) HEPES (5 моль / л) и пенициллина / стрептомицина (1% объем / объем). Фильтр решения с использованием вакуумного фильтра с фильтром 0,45 мкм.
2. Повторное приостановить клеток в буфере Miltenyi при 100 μЛ на 10 ⁷ клеток. Добавить 2 мкл CD133-PE конъюгированных антител. Использование второй группы клеток, инкубировали с IgG-PE конъюгированных антител в качестве контроля. Сохранил третью группу клеток без окрашивания, как неокрашенные управления для FACS.
3. Инкубировать при 4 ° C в течение 15 минут в темноте. Повторное приостановить в 2 буфера окрашивания мл. Центрифуга при 200 х г в течение 5 минут. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в 1 мл буфера Miltenyi.
4. Этот этап проводится с использованием стандартных проточной цитометрии сортировки клеток процедур, которые могут быть конкретные учреждения. Использование неокрашенных клеток и IgG PE окрашенных клеток, настроить параметры сортировки для оптимизации стробирования CD133 + клетки населения. PE (R-Phytoerythrin) в общем случае может быть использован с любым проточной цитометрии, который имеет лазер, который излучает при 488 нм. Пик эмиссии для ПЭ 575 нм и обнаруживается в FL-2 канала.
   
   Примечание: Использование BD FACS Calibur или BD FACS Vantage машины, с помощью программы Cell Quest для сбора данных, мы используем вперед Scatteг и бокового рассеяния зрения в логарифмической шкале для выявления клеточных популяций, с боковой разброс установлен в 250. FL1 и FL2 оба в логарифмической шкале и установить до 550. Эти параметры обеспечивают начальную отправную точку для просмотра печени, не паренхимных клеток, и корректируются по мере необходимости на основе интенсивности окрашивания положительных и отрицательных населения.
5. Изолировать CD133 + клеток населения, использующего CD133 + ворота и собирают клетки в стерильной фильтрации СМИ ячейки.

5. Методы клеточной культуры

1. Центрифуга FACS собранные клетки при 200 мкг в течение 5 минут. Повторное приостановить осадок клеток в клетки овальной СМИ, приблизительно с 5000 клеток на мл. Может начать с более высокими концентрациями, до 50000 клеток / мл в течение первых экспериментов, а также уменьшить как техника улучшает и общую жизнеспособность клеток и улучшает выход.
2. Пластина клеток на BD Biocoat Ламинин покрыты 96-луночные планшеты с использованием 1000 клеток / см ^2. Место в увлажненном культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO ₂. После 24 часов, добавить фактор роста гепатоцитов (50 нг / п) и эпидермальный фактор роста (20 нг / мл).
3. Для одной клетки, изолировать клетки прямо в 50 мкл овальной СМИ ячейки в каждую лунку 96-луночных Ламинин покрытием пластины. Используйте одну ячейку FACS параметры строгий отбор одного положительного клетки только. После 24 часов, добавить 50 мкл овальной СМИ ячейки с HGF и EGF, как указано выше в пункте 5.2. Изменение СМИ полностью через 5-7 дней.
4. После расширения колоний более 50% вырожденная, что обычно происходит через 2 недели, в зависимости от общего числа посеянных клеток и жизнеспособность клеток, клетки могут быть разделены 1:03, как показано ниже.
5. Сплит клеток, используя трипсин 0,05%-EDTA. Примените достаточно, чтобы покрыть дно колодца, 50-100 мкл / лунку на 96-луночный планшет. Место в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 3-5 минут.
6. Добавить 100 мкл средств массовой информации в каждую ячейку и передать все жидкости 5 мл трубки. Добавить 1 мл среды в каждую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 минут.
7. Повторное приостановить клеток в пластине средств массовой информации яп ламинин покрытием блюдо, с использованием клеток от 1 и до тарелки на 3 скважинах новые (1:3 отношение).

6. Подтверждение би-статус потенциального использования RT-PCR

Эта процедура подробно описана в RNeasy протокол руководство, которое поставляется в комплекте с RNeasy Kit.

1. Используйте RNeasy микро-колонки для 96-луночных колонии пластины. Аспирируйте культуру средств массовой информации из каждой лунки. Добавить 75 мкл буфера RLT (от RNeasy Kit) непосредственно в каждую лунку. Очистите нижней плиты со стерильными резиновыми полицейский. Pipettelysate в микро-центрифуге трубки и вихрем смеси в течение 1 минуты. Добавить 70% этанола лизатов и перемешать с помощью пипетки.
2. Передача решения RNeasy колонку помещали в 2 мл пробирки (поставляется в RNeasy Kit) и центрифуги в микро-центрифуге в течение 15 секунд при 10000 оборотах в минуту. Откажитесь Элюированную фильтрата.
3. Повторное использование коллекции трубки. Добавить 350 мкл буфера RW1 (RNeasy Kit) для RNeasy колонку и центрифуги в течение 15 секунд при 10000 оборотов в минуту, чтобы вымыть колонкимембрану. Откажитесь Элюированную стирки.
4. Добавить 10 мкл ДНКазы I маточного раствора до 70 мкл буфера RDD (оба поставляются в RNeasy Kit). Добавить 80 мкл ДНКазы I буфера RDD инкубации смеси для RNeasy мембраны колонки и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
5. Добавить 350 мкл буфера RW1 (RNeasy комплект) к RNeasy колонку и центрифуги в течение 15 секунд при 10000 оборотов в минуту для мытья мембран. Откажитесь Элюированную стирки и пробирки.
6. Поместите RNeasy колонке в новом 2 мл пробирки (поставляется в комплекте RNeasy). Добавить 500 мкл буфера RPE (RNeasy Kit) для RNeasy колонку и центрифуги в течение 15 секунд при 10000 оборотов в минуту для мытья мембран. Откажитесь Элюированную стирки.
7. Подготовить 80% этанола использованием РНКазы воды (RNeasy Kit). Добавить 500 мкл 80% этанола в RNeasy центрифуги columnand в течение 2 минут при 10000 оборотах в минуту. Откажитесь Элюированную стирки.
8. Поместите RNeasy колонке в новом 2 мл пробирки (RNeasy Kit) и центрифугу на полной скорости в течение 5 минут. Откажитесь от любых Элюированную стирки и коллеглекция трубку.
9. Поместите RNeasy колонку в новой 1,5 мл пробирки (RNeasy комплект). Добавить 14 мкл РНКазы воды (RNeasy Kit) к центру мембраны колонны и центрифуги в течение 1 минуты на полной скорости. Сбор фильтрата с очищенной РНК и передать на лед, если создание кДНК сразу или хранить при температуре минус 80 ° C для дальнейшего использования.
10. Обратная транскрипция использованием ингибитора РНКазы Omniscript.Dilute до конечной концентрации 10 ед / мкл в ледяной 1x буфер РТ. Vortex в течение 5 секунд, и пульс центрифуги в течение 5 секунд. Подготовка свежей смеси мастер на льду в соответствии с стр. 13 протокола Omniscript. Vortex в течение 5 секунд, и пульс центрифуги в течение 5 секунд. Рекомендовать подготовить объема Mastermix 10% больше, чем требуется для полного обязательным для всех реакций.
11. Добавить матричной РНК на отдельные пробирки, содержащие основную смесь. Vortex в течение 5 секунд, и пульс центрифуги в течение 5 секунд. Инкубировать в течение 60 мин при 37 ° C.
12. ПЦР-амплификации гепатоцитов(Альбумин) и cholangiocyte конкретных генов с помощью HotStarTaq ДНК-полимеразы. Подготовка реакционной смеси на странице 15 книги HotStarTaq протокол. Рекомендовать разбавления складе праймеров для концентрации 20 часов / мкл, а с 1 мкл / реакционной трубы используются для прямого и обратного праймеров. В зависимости от количества клеток первоначально использовались для выделения РНК, мы рекомендуем деления окончательного кДНК среди 3 реакционных труб (β-актин для контроля загрузки, альбумин и KRT19), чтобы начать.
13. ПЦР-праймеров приведены в таблице 1.
14. Поместите реакционных труб в амплификатор. Рекомендовать следующую программу для начальных экспериментов: 95 ° КСОР 15 минут х 1 цикл следуют 95 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 30 секунд х 35 циклов, затем 72 ° С в течение 10 минут.
15. Продукты ПЦР анализировали с помощью бромистого этидия пропитанные агарозном геле.

7. Подтверждение опухоли потенциал CD133 + стволовых клеток

1. Эта процедура можетбыть сделано с свежевыделенных клеток, начиная с шага 4 или с использованием клеток, которые культивировали с шага 5. Мы рекомендуем выполнять первые эксперименты с культивируемых клеток, а свежевыделенных клеток будет сокращен жизнеспособности и снижению урожайности.
2. Trypsinize клеток, используя трипсин 0,05%-EDTA с шагом 5.5 выше. Через 3-5 минут инкубации при 37 ° С, добавить 100 мкл среды в каждую лунку и передать всю жидкость из каждой лунки отдельных труб 5 мл (1 а = 1 трубка). Добавить 1 мл среды в каждую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 минут.
3. Повторное приостановить клеток в 1 мл ледяной PBS. Удалить 10 мкл суспензии клеток PBS и добавить 10 мкл трипанового синего. Использование исключения трипанового синего, определяют количество живых клеток. При использовании FACS изолированных клеток, число клеток будет определяться по количеству изоляции FACS.
4. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 минут и повторно суспендируют в PBS в концентрации 1 х 10 ⁶ живых клеток/100 мкл. Добавить 100 мкл Matrigel. Шесть-недельных иммунной дефицитом Nudэлектронной мышам вводили подкожно использовании 28 gague иглы. Вводят 1 х 10 ⁶ клеток в 200 мкл на сайте.
5. Мыши контроль роста опухоли ежедневно. После образования опухолей, как правило, после инкубации 3-4 недели, объем опухоли измеряют с помощью суппортов (высота х длина х ширина).

8. Представитель Результаты:

Из нормальных, здоровых мышиной печени, ожидаемая доходность сотовой CD133 + клеток печени стволовыми в 1000 до 5000 в печень. Эти клетки являются относительно редкими в печени и покоя не будет расширяться и в культуре. Мы не рекомендуем использовать одну ячейку на анализе нормальной печени и выход жизнеспособных клеток, что будет расширять является крайне низким.

Для печени со значительной хронической травмы, такие, как DDC 0,1% диету в течение 6 недель ¹ или генетической модификации в результате хронической травмы, такие как MAT1a ^{- / -} или печени конкретные Pten ^{- / -} мышей, ^2-4 ожидаемое число челLs изолированным увеличением до 100000 клеток изолированного / печень (рис. 2). При использовании генетических моделей, знание спонтанных опухолей является критическим, так как эти процедуры для печени изоляции стволовых клеток должны проводиться в опухоли бесплатно животные. Например, если MAT1a ^{- / -} типовые формы спонтанных опухолей на 18 месяцев, мы рекомендуем использовать животных не позднее чем через 15-16 месяцев, до любого сообщил спонтанных опухолей.

Выделение отдельных клеток от хронической травмы моделей даст несколько (3-9 colonies/96 и пластины) колонии, которые расширяются от отдельных клеток после процедуры освоены, и жизнеспособность клеток обеспечивается. Рисунок 3 настоящего представителя фазового контраста изображения колонии, полученные из одного CD133 + клеток расширена через 7 дней.

Подтверждение би-статус потенциального проводится с использованием альбумина и Krt19 RT-PCR. Колонии с расширенным одной клетки будут демонстрировать как выражение для маркеров гепатоцитов (AlБумин) и холангиоцитов (Krt19). Рисунок 4 показывает би-потенциал выражение из трех изолированных колоний, около 25 клеток / колонию на 7 дней.

CD133 + стволовые клетки из нормальной печени и химически индуцированных повреждений печени (например, DDC 0,1% диету в течение 6 недель) не образуют опухолей у голых мышей. CD133 + стволовые клетки из специфических генетических моделей (MAT1a ^{- / -} или печени конкретные Pten ^{- / -} мышей) образуют опухолей у голых мышей, если изолирован поздно в конце предварительной опухоли хронической фазе травмы. Эта опухоль формировании фенотипа в настоящее время определены как стволовые клетки рака ^2-4 Например, MAT1a ^{-. / -} Мышей образуют спонтанных опухолей печени в возрасте 18 недель. CD133 + печень стволовые клетки, выделенные в 15-16 недель, в течение поздней хронической фазе травмы заболевания печени, образуют опухолей у голых мышей. На рисунке 5 показано, представитель опухоли из двусторонних инъекции 1 х 10 ⁶ клеток в пробирке расширен с одного CD133 + стволовых клеток печенис.

Ген	Прямой праймер	Обратный праймер
β-актина	5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 '	5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 '
Альбумин	5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 '	5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 '
Кератин 19	5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 '	5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 '

Таблица 1: грунтовка дизайн для RT-PCR

Рисунок 1: Общая схема методов.

Рисунок 2: CD133 + печени стволовыми клетками, выявленных в высокообогащенного CD45 обедненного без паренхиматозных фракции управления неповрежденной печени от дикого типа. мышах показано, 0,4% CD133 + клеток в высоко обогащенного CD45 обедненного без паренхиматозных фракции. В генетическом нокаут MAT1a ^{- / -,} который представляет собой модель хронического поражения печени, население CD133 расширяется в 10 раз и более в то же высоко обогащенного фракции.

Рисунок 3: Расширение колоний от одного CD133 + клоны фазового контраста изображения четырех колоний, полученные из одного CD133 + клеток расширил покрытие на ламинине 96-луночных планшетах..

Рисунок 4: Bi-потенциал экспрессии гена CD133 + из печени стволовыми клетками клонально расширен колоний на 7 день, колонии около 25 клеток.. Экспрессия генов демонстрирует выражение гепатоцитов маркер альбумин и cholangiocyte маркер Krt19, подтверждающие би-потенциал статус CD133 + клеток.

ve_content ">
Рисунок 5: CD133 + клеток печени стволовыми образуют опухолей у голых мышей Стрелки указывают опухоли, растущие через 4 недели после 1x10 ⁶ CD133 + клетки, введенные с MAT1a ^{- / -} модель.. CD133 + клеток от токсинов индуцированные хроническим поражением печени, таких как CCl ₄ или 0,1% DDC диету, не образуют опухолей. Образование опухолей используется для идентификации злокачественным потенциалом, или раковые стволовые клетки фенотипа в популяции стволовых клеток.

Обсуждение

В отличие от кроветворной системой, в которой гемопоэтических стволовых клеток несут ответственность за поддержание системы сотовой дифференциации, replacesnormal физиологических оборот лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов, клеток печени стволовыми или взрослых клеток-предшественников печени, не участвуют в нормальной печени гомеостаза. ^5,6 после острого повреждения печени или частичной резекции печени, гепатоциты, как дифференцированный эпителий печени, проходят несколько этапов распространения, чтобы заменить потерянные массы печени. ^5,6 Только при хронической травмы являются печень стволовых клеток наблюдалось распространяться. ^{1,5 -11} Эти взрослые, орган конкретные стволовые клетки предложил дифференцироваться в гепатоциты и как холангиоцитов. ^1,5-8 Интересно, что подавляющее большинство рак печени развивается на фоне хронических травм, и, таким образом стволовых клеток печени также предположил, что прекурсоры для подмножества рака печени. ^2-4,12-17

Oдной из основных проблем стволовых клеток работе в печени изоляции редких популяций клеток для функционального анализа. Например, подавляющее большинство клеток в гепатоциты печени, которая значительно больше, чем холангиоцитов и другие более мелкие без паренхиматозных клеток. Разбив весь печени в клетки отсеков (большой гепатоцитов - паренхиматозный фракции и более мелкие клетки - не паренхиматозных фракции), и далее выбрав для CD45 негативные клетки (не гемопоэтических клеток), мы можем обогатить начиная популяция стволовых клеток более 600 раз. ^1,18-21 Следует отметить, что мы ни в коем случае о том, что CD133 + населения является 100% чистой популяции стволовых клеток, но очевидно, представляет собой гетерогенную популяцию клеток с различными линии и заселение потенциал. Одним из основных ограничений поле определения стволовых клеток и клеток-предшественников. Мы используем термин "стволовая клетка" в более широком плане эта работа, но в строгом определении, CD133 +, не parenchymal клетки представляют собой би-линии предшественников населения. Учитывая нынешнее состояние стволовых и прогениторных исследований в печени, этот доклад не предусматривает отправной точкой для следователей, которые заинтересованы в этой области. Как появляются новые маркеры, такие как EpCAM, ^22,23 или транскрипционных факторов, таких как Sox9, ²⁴ они могут быть включены. Например, мы обнаружили довольно высокий уровень перекрытия между EpCAM + клеток и CD133 + клеток.

В этом отчете мы подробно процесс стволовых клеток изоляции от нормальной мышиной печени, а также хронического поражения печени моделей, которые демонстрируют увеличение печени стволовых клеток. Этот метод имеет очевидные преимущества по сравнению со стандартными иммуногистохимии замороженных или фиксированных формалином и печени, функциональных исследований с использованием живых клеток могут быть выполнены после изоляции. ^1,3,4 конкретная цель этого процесса заключается в изоляции относительно чистой населения печени стволовыми клетками, которые могут клонально быть расширен в пробирке.

Основное ограничение для этой процедуры является то, что большинство клеток, выделенных не будет жизнеспособной после проточной цитометрии (см. раздел Поиск и устранение неисправностей). Это результат часов, необходимых для подготовки клеток, и многочисленные процедуры, необходимые для уточнения населения до изоляции. Если печень переваривается в одной клеточной суспензии для немедленного анализа FACS, размер разницы между гепатоцитами и других не-паренхиматозные клетки будут эффективно ворота FACS создание невозможно. Если печень не-паренхиматозные клетки используются, без устранения гемопоэтических клеток, существует риск, что значительное количество CD133 + клеток может быть гемопоэтических происхождения могут загрязнить фракции. Кроме того, при обработке клеток через Miltenyi фильтр, только одно клеток и очень небольшие скопления клеток были собраны. Это гарантирует, что образец не будет забивать FACS иглы потребления.

Альтернативы для этой процедуры включают м.odification для любого альтернативного маркера клеточной поверхности, такие как CD49f, EpCAM, или комбинация маркеров, таких как CD133 + + EpCAM второй опубликовала отчет использует градиент плотности, чтобы изолировать стволовые клетки печени от не-паренхиматозные фракции. Эта процедура требует Ultra-центрифуга (8000 мкг), добавляет значительное время процедуры, и по нашему опыту, значительно снижается предварительно FACS сотовой выход и пост-FACS жизнеспособность ^8.

Дальнейшие эксперименты включают более широкий спектр генного анализа выражений, в том числе плода гены печени, таких как HNF3, HNF4α, и αfp.In того, Вестерн-блоттинга и иммуноцитохимия выраженной белки могут быть использованы для подтверждения RT-PCR результаты клеток в культуре.

Один из вопросов, следует отметить, последние работы, которые определены CD133 выражение звездчатых клеток печени ^25. Сейчас мы регулярно скрининга наши образцы на маркеры звездчатых клеток (см. раздел Поиск и устранение неисправностей), и не имеют IDentified значительное загрязнение в нашей фракции. Это может быть связано с различными технологиями пищеварения и печени изолятор. ^2,3,26

Основываясь на том факте, что большинство клеток не будет жизнеспособной сразу после выделения FACS, мы рекомендуем, чтобы быть покрыты клетками, как и большая часть CD133 + клеток или отдельные клетки, до использования в животных. 5-7 дней в пробирке позволит значительно улучшить результаты анализа опухоли. Кроме того, учитывая суровость одном изоляторе, это должно проводиться только один раз колоний могут быть расширены с объемной CD133 + изолированных клеток. Более подробное обсуждение различных условий культуры и леса белки, которые могут быть использованы для культуры стволовых печень и клетки-предшественники были также характеризуется Lola Рид. Эта работа дает альтернативные условия и модификации, которые исследователи могут включать в свои программы исследований раз основные методы изоляции освоены. ^27,28 доктора Рейд пристаА также обеспечивает более детальный анализ биологии происхождение и созревание между печеночной стволовых клеток и совершенные прародителями.

С точки зрения опухолей в естественных условиях анализа, мы имели успех, используя недавно изолированных клеток и клеток из клонированных расширен CD133 + клеток в пробирке, в первую очередь использованием 1x10 ⁶ клеток. Мы сосредоточились ontwo генетических штаммов хронического поражения печени, MAT1a ^{- / -} и печень конкретных Pten ^{- / -} мышей, и мы использовали оба голых мышей и мышей дикого типа в качестве хозяев для роста опухоли. По нашему опыту, CD133 + клеток печени стволовыми только образуют опухолей, если они изолированы от значительного повреждения печени моделей, которые предварительно злокачественные. Обратите внимание, что опухоли образуются из CD133 + клетки имеют как общие гепатоцеллюлярной карциномы и холангиокарцинома особенности, предлагая стволовых клеток или клеток-предшественников происхождения к опухолям. ^2-4,29

Последующие работы после опухолей документально включенийде стандартного патологического анализа опухолевых тканей (H & E окрашивание) и иммуногистохимического окрашивания. Кроме того, опухоль может быть фарш переваривается и для FACS анализа или повторного культуры. ^2-4,30

В заключение, мы подробно процедуру изоляции, расширение и основных характеристик CD133 + печени стволовыми клетками и CD133 + раковые стволовые клетки.

Поиск и устранение неисправностей:

CD45 загрязнения:

Для шага 3, если есть загрязнения CD45 + клеток, которые могут быть оценены путем добавления CD45-FITC Ab до FACS анализа и изоляции, убедитесь, что CD45 Microbead антитела не истек и что фильтрат собирали только тогда, Фильтр был в магнитном держателе. Любой фильтрата, собранного в то время как фильтр не в магнитный держатель будет содержать CD45 + клеток.

Низкое количество клеток:

Для неповрежденной печени, общее количесг CD133 + без паренхиматозных изолированные может быть меньше чем 10000. Эти клетки являются редкими в спокойном печени. Для модели хронического поражения, как DDC 0,1% диете, число увеличится до 100.000 значительно клеток. Если общее количество клеток значительно ниже этих цифр, один вопрос, чтобы рассмотреть, является окрашивание FACS Ab. Убедитесь в том, что Ab CD133 не истек, а бедные окрашивания может привести к плохой урожай. Кроме того, мы рекомендуем выполнять FACS анализ печени, не паренхимных клеток для определения относительной населения до попытки FACS изоляции.

Низкая жизнеспособность клеток после FACS:

Один из вопросов, жизнеспособность может быть связано с тем, как клетки обрабатываются и за какое время. В идеале, вся процедура изоляторе, шаги 1-4, должны проводиться без каких-либо задержек между шагами и завершится в тот же день. Любая значительная задержка между шагами 1-4 позволит значительно сократить жизнеспособность клеток. Второй вопрос связан с сELL жизнеспособности могут быть связаны с оболочкой давления используется для изоляции FACS. Мы рекомендуем использовать оболочку нижнего давления. Наконец, когда клетки выделяют, они должны быть немедленно покрытием, как и любое значительное хранения на льду после сортировки будет также уменьшить жизнеспособность.

CD133 + без паренхиматозных неоднородности:

Последние отчеты показывают, что звездчатые клетки печени также могут иметь CD133 выражения и есть пластичности ^25. Таким образом, в дополнение к проверке би-потенции генов альбумина и Krt19, дополнительная проверка может включать в себя гены, связанные с звездчатых клеток, таких как глиальных фибриллярный кислый белок в покоящихся клеток звездчатого и альфа-актин гладких и десмин в активированных клеток звездчатого. ^3,4,26 Кроме того, CD133 + населения представляет собой широкую предшественников населения. Добавление второго маркера, таких как EpCAM, может помочь уточнить населению дальше, и предел неоднородности.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
DMEM: F12	Invitrogen	10565-018	С фенолом красным
CD45 микрошарики	Miltenyi	130-052-301
Фактор роста гепатоцитов	Сигма	H1404
Эпидермального фактора роста	Сигма	E4127
ДНКазой	Сигма	DN25	1 грамм
Коллагеназа D	Roche	1088874
Проназа	Roche	0165921
70 микрон сетчатый фильтр	Рыбак	352350
Omniscript RT	Quaigen	205111	50 реакций
HotStarTaq	Quaigen	203203
Miltenyi LD колонки	Miltenyi	130-042-901
CD133-PE FACS Ab	eBioscience	12-1331-82
Ламинин покрытие пластин	BD	354410	96-луночные
Трипсин 0,05% ЭДТА	Invitrogen	25300-354	100 мл
RNeasy Micro Kit	Quaigen	74004	50 столбцов для 5x10 5 клеток или менее
Фарм Lyse	BD	555899	10X концентрации