CompoZr Özel Çinko Parmak Nükleazlar ile Genom Düzenleme (ZFNs)

Özet

CompoZr Özel Çinko-Parmak Nükleaz (ZFN) Hizmet kullanıcı tarafından tanımlanan herhangi bir odağı herhangi bir organizma ya da hücre hattı hassas genom düzenlenmesini sağlar. Bu makale CompoZr Özel ZFN Hizmet tasarım, imalat, onaylanması ve uygulanması için süreci anlatılmaktadır.

Özet

Genom düzenleme gen fonksiyonu ve hastalığın genetik temeli aydınlatmak için kullanılan güçlü bir tekniktir. DNA dizilerinin kimyasal tabanlı mutajenez veya rasgele entegrasyonu gibi düzenleme yöntemleri Geleneksel gen genel verimsiz biçimde gelişigüzel genetik değişiklikler görüşmek ve istenmeyen sentetik dizilerinin kuruluş gerektiren veya potansiyel biyolojik çalışmada kafa karıştırıcı, sapkın kültür koşullarının kullanın. Buna karşılık, bir hücreye geçici ZFN ifadesi, hassas kolaylaştırabilir transgenlerin sentetik kimyasalların veya entegrasyon yönetimi için gerek kalmadan çok etkili bir şekilde gen düzenleme kalıtsal.

Çinko parmak nükleazlar (ZFNs) çift iplikli DNA (dsDNA), belirgin dizileri bağlanır ve kesilir enzimlerdir. Fonksiyonel bir CompoZr ZFN ünitesi yaklaşık 15-18 nükleotidlerin bir DNA "yarı-site" bağlamak iki ayrı monomerik proteinleri (bkz. Şekil 1) oluşur. Ne zaman iki ZFN monoDNA bölünme etki dimerize ve DNA çift iplikli sonu (DSB). genomunda ZFN aracılı DSBs ¹ Giriş yüksek verimli genom düzenleme için bir temel atar oluşturmak onların bitişik hedef sitelerine mers "ev". Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) DNA tamir yolu ile bir hücrede DSBs kusurlu onarım küçük eklemeler ve silmeler (indellerin) neden olabilir. Bu protokolün bir gen eleme oluşturmak için ZFNs kullanımı, transgenlerin entegrasyonu tarif ederken, bir hücrenin geninin kodlayıcı dizisinin içinde indellerin yaratılması da vasıtasıyla yapılabilir frameshift ve yüksek verimle bir gen yerinin. ² müteakip işlevsel eleme sonuçlanabilir ZFN kesim yerinde homoloji-yönettiği onarım.

CompoZr Özel ZFN Servis ZFN teknoloji ile bilimsel topluluk için hedeflenen gen düzenleme için, sistematik, kapsamlı ve iyi karakterize bir yaklaşımı temsil ediyor. Sigma bilim adamları) 1 araştırmacılar ile yakın çalışmak perfoproje hedefleri, 2 uyarınca ilgili gen yapısı, biyoloji ve model sistem analizi) dahil olmak üzere rm özeni analizi daha sonra tasarım, inşa ve işlevsel ilgili bir faaliyet için ZFNs doğrulamak) bir ses hedeflemesi, 3 geliştirmek için bu bilgiyi uygulama hücre hattı. Araştırmacı pozitif kontrol genomik DNA ve astar alır ve plazmid DNA hem de hem de in-vitro transkripsiyon mRNA formatında verilen ZFN reaktifler hazır kullanın. Bu reaktifler sonra araştırıcı hücre hattı veya tercih hücre tipi geçici ifadesi için teslim edilebilir. Örnekler daha sonra, PCR, enzimatik özet ve elektroforez gibi standart moleküler biyoloji teknikleri ile ilgi odağı az gen düzenleme için test edilmektedir. Gen düzenleme için olumlu bir sinyal ilk nüfus tespit edildikten sonra, hücreler klonlanmış tek hücreli ve mutant klonlar / alel belirlenmesi için genotipleme vardır.

Protokol

1. Özel ZFN Tasarım Süreci

1. ZFN tasarım sürecini hızlandırmak için, bir araştırmacı vermelidir:
• Bu tür gen adı, tür ve gen açıklama / kimlik numarası olarak hedef geni hakkında bilgi.
• Deney A açıkça ifade üzerinde tüm nesnel (örneğin, Knockout veya Knockin)
• Atipik gen yapısı, genetik odağına karışmış özel biyolojisi veya başka herhangi bir genomu homolog bölgeleri içerir geninin hedef herhangi bir spesifik faktörler.
• Çinko parmak için DNA sırası aralığını hedef nükleazlar.
2. Sigma biyoinformatik ekibi ilk çinko parmak hedef siteleri geliştirmek için siliko ZFN tasarım yapar.
3. İlk ZFN hedef siteleri ZFN bilimsel, teknik danışman verilmektedir. Teknik açıdan daha karmaşık projeler için bu Sigma bilim Proje stratejisi geliştirmek için araştırmacılar ile çalışır.
4. Sigma biyoinformatik ekibi silico ZFN tasarımlar üretmek için ZFN algoritmaları ile bir analizini yapar. Bu, her bir potansiyel ZFN hedef site için bir bütün off-hedef siteler için genom arama, tekrar maskeleme ve SNP analizleri içerir.
5. Biyoinformatik inceleme için araştırmacı için üst ZFN hedef siteleri sağlar. Potansiyel ZFN hedef siteleri onayı üzerine, bu bilgiler ZFN imalat işlemine başlamak için ZFN Üretim ekibimiz sağlanır.

2. Özel ZFN Üretim

1. Çinko parmak modüllerinin Sigma arşiv onaylanmış ZFN tasarımlar monte etmek için kullanılır.
2. Her ZFN tasarım ve montajı dizisi yüksek kapasite klonlama platformda doğrulanır.
3. Tüm ZFN tasarımları üretimi her ZFN tamamlandıktan sonra doğrulama gönderilir.

3. Özel ZFNs Geçerliliği

1. Içinde ZFN projelerinsan, fare, sıçan veya CHO türlerin her bir tür için iyi karakterize hücresi hatlarında doğrulanır, bir maya bazlı analiz diğer organizmalara veya hücre tipleri kullanılır.
2. ZFN yapıları nucleofection tarafından uygun bir hücre çizgisi içine dağıtılır ve ZFNs ifade edilir.
3. DNA ZFN Transfekte hücre havuzu hasat ve faiz bölge PCR amplifiye olduğu edilir.
4. Cel-1 deney daha sonra, PCR ürünleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Jel elektroforez valide ZFN aktiviteye Cel-1 testi çalıştırın.
5. Cel-1 testi ile doğruladı, en yüksek aktivite ZFN tasarım daha sonra müşteriye sunulmaktadır. ZFNs bir pozitif kontrol olarak Cel-1 deneyi ve genomik DNA için PCR primerleri ile birlikte mRNA ve plazmid DNA ile temin edilir.

4. Nucleofection tarafından geçerliliği ZFNs teslim

1. 2x10 ⁵ hücre / ml nucleofection bir gün önce bir yoğunlukta tohum hücreleri.
2. Nucleofection gününde,Hücre Hattı Nucleofector Takımı V çıkarıp oda sıcaklığına getirin sağlar.
3. Üreticinin protokolüne göre Nucleofection Çözelti V takviyesi ekleyin.
4. Hücreleri hesaplama. Hücre yoğunluğu 2,5-5x10 ⁵ hücre / ml arasında olmalıdır.
5. Önceden nucleofection için en azından 20 dakika süreyle 37 ° C 'de _bir CO2 inkübatöründe her oyuğa ve pre-ılık orta 2ml sahip bir 6-kuyucuklu plak doldurun.
6. 5 dakika 200xg az transfeksiyon başına 2x10 ⁶ hücre (8x10 ⁶ toplam) santrifüjleyin.
7. Hank'in dengeli tuz Çözelti (HBSS) 20 ml ile iki kez yıkanır hücreleri.
8. Deney tüpleri hazırlayın: (Özel ZFN teknik bülten tabloya bakınız)
9. Inkübatör gelen adım (6.5) medya içeren 6-iyi plaka çıkarın.
10. Nucleofection Çözüm 400 ul (100 ul / reaksiyon) hücreleri yeniden süspanse edin V.
11. Her seferinde bir reaksiyon, her bir DNA veya RNA içeren tüp hücreleri 100 ul ilave edin. Transfuygun bir program içeren bir Nucleofector bir küvet 2 mm ve elektroporasyon nucleofect için er karışımı.
12. Hemen her numunenin nucleofection sonra küvetine adımda 6-iyi plaka (6.9) den önceden ısıtılmış orta ~ 500 ul eklemek için bir transfer pipet kullanın. Sonra, 6-kuyucuklu plak içinde kalan önceden ısıtılmış orta küvet hücreleri dikkatli bir şekilde transfer.
13. Bütün reaksiyonlar bitirmesini ve 37 ° C'de ₂ CO inkübatöre 6-kuyulu plakalı dönmek

5.. ZFNs teslimi sonrası Genomik DNA Hasat

1. 6-iyi plakası - toplanmış bütün hücre hasat yoktur. Bu size Cel-1 sindirim ürünlerinin olduğunu onayladıktan sonra tek hücre seyreltme klon hücreleri olması için kültürü korumak için önemlidir. Bir ila üç gün sonra nucleofection GenElute Memeli Genomik DNA kit'i kullanılarak Miniprep kromozomal DNA hazırlamak için hücreler toplanır.

6. Cel-1 Testi

1. PCR primerleri kullanılarak sağlanan, ZFN transfekte örnekleri ve kiti içinde sağlanan pozitif kontrol genomik DNA'dan genomik DNA'yı çoğaltmak. (Özel ZFN teknik bülten tabloya bakınız): PCR reaksiyonu aşağıdaki koşullar ile kurulur.
2. PCR homoduplexes gelen heteroduplexes oluşturmak için her ZFN tedavi numune artı kontrolünden PCR reaksiyonu 10 ul almak ve bir termalcycler aşağıdaki programı kullanabilirsiniz:
   95 ° C'de, 10 dakika
   95 ° C ila 85 ° C, -2 ° C / dakika
   85 ° C ila 25 ° C, -0.1 ° C / dakika
   4 ° C, süresiz
3. 42 her bir reaksiyon ve inkübe ° C'de 20-40 dakika için artırıcı madde 1 ul ve Nükleaz S 1 ul (Katalog No: 706.025 Transgenomic gelen) eklenir.
4. Böyle DirectLoad widerange DNA Ladder (Katalog No: D7058) gibi uygun belirteçler, (Özel ZFN teknik bülteninde sonuçları görmek) ile% 10 SAYFA-TBE jel sindirimler çalıştırın.
5. Üzerindece pozitif sinyal cel-I testi ile ZFN tedavi edilen nüfus tespit edilmiş, klonal izolasyonu ve karakterizasyonu geçin.

7. Klonal İzolasyonu ve Karakterizasyonu

1. FACS ve seyreltme klonlama gibi standart yöntemlerle Tek hücreli klon ZFN tedavi örnekleri.
2. Klonlar öbekli malzemesi olarak geri kalanı dondurma, genomik DNA hasat için bazı hücrelerin oranı bölmek, sonra yeterince genişletmek için izin verin.
3. Cel-I primerler kullanılarak klonlar genomik DNA'yı çoğaltmak ve Cel-I assay (in çivili WT DNA olan ve olmayan) tarafından amplikon analiz, veya alternatif genotipleme doğrudan devam etmek için bu amplikon kullanın.
4. Genotipine aday klonlar tercih edilen bir yöntemine göre düzenlenmiş allelleri sahip olarak tanımlanır.

8. Temsilcisi Sonuçlar

Tüm CompoZr ZFN akışı için bir örnek, Şekil 2'de verilmiştir. ZFNs teslim edilirbunlar, çift-damarlı sonu (DSB) oluşturur uygun bir DNA sekansı ve bağlama çatlatma hücrelere. Doğal onarım sürecini, homolog olmayan (NHEJ), onarım DSB katılmadan bitirmek. Silme, ekleme veya nükleotidlerin yerine bazı durumlarda anormal NHEJ sonuçlarında. Denatürasyon / PCR reaksiyon tavlama aşamasından sonra vahşi tip ve modifiye amplikonlar arasındaki heteroduplex oluşumu hasat genomik DNA sonuçlarının PCR amplifikasyonu. Herhangi bir heteroduplex moleküllerin yarılması in Cel-1 enzim sonuçlar eklenmesi. Cel-1 sonuçları ZFN bölünme onaylamak için PAGE analizi ile çözümlenir. Şekil 3 Cel-1 testi ile beklenen sonuçlar şematik sağlar.

Temsilci Cel-1 sonuçları Şekil 4 ve 5'te bulunur Şekil 4 K562 hücrelerinin ZFNs çok aktif bir çift (21%) elde edilen sonuçlar içerir;. Şekil 5'te ZFNs daha az aktif bir çift (% 2.4) elde edilen sonuçlar içerirK562 hücrelerinde. ZFN aktivitesi ebeveyn PCR fragmanı aşağıdaki iki PCR parçaları varlığı ile iki şekil ile teyit edilir.

Şekil 1.. Bağlı çinko parmak nükleazlar gösterimi. ZFNs FokI restriksiyon endonükleaz arasında bölünme etki kaynaşmış DNA bağlayan bir çinko parmak oluşan proteinler tasarlanmıştır. Heterodimerleri olarak bağlandığında, ZFNs bir kullanıcı belirtilen DNA dizisinin bir çift sarmallı sonu yaratmak.

Şekil 2. Özel ZFN Hizmet İş Akışı şematik. CompoZr ZFNs kullanarak genetiği değiştirilmiş hücre dizisi oluşturmak için iş akışı grafik gösterimi.

Şekil 3. Cel-1 testi ve sonuçların şematik. A) ZFN plazmid o r mRNA hücreleri teslim edilir. B) ZFNs bind ifade ve hücrelerin bir kısmı bir çift sarmallı sonu (DSB) oluşturarak hedef sahnelerini kestiler. C) homolog olmayan bazı DSBs aberran onarım nükleotid ekleme veya silme sonuçları katılmadan bitirmek. D) Genomik DNA hücrelerin transfekte havuzundan hasat ve ilgi odağı olarak yükseltilir. EF) PCR ürünü denatüre olduğu ve yabani tip ve modifiye amplikonlar arasındaki heteroduplex formasyonu oluşturarak yeniden tavlanır. G) heteroduplex moleküllerin yarılması in Cel-1 uyumsuzluğu endonükleazlar deneyi sonuçları. H) Cel-1 enzimi digests SAYFA çözümlenir. ImageJ yazılım tarafından belirlenir parenteral bandına ayrışma ürünü oranı gözlemlenmiş, fraksiyon kesilmiş ve ZFNs etkinliğini gösterir.

Şekil 4. % 21 aktif ZFNs gelen Cel-1 sonuçları ImageJ yazılım mevcuttur.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Şekil 5. % 2.4 aktif ZFNs gelen Cel-1 sonuçları ImageJ yazılım mevcuttur. http://rsbweb.nih.gov/ij/ .

Tartışmalar

Bir kez ZFN modifiye hücreleri bunlar kalıcı olması ve DNA değişiklikler kalıtsal izole edilmiştir. Araştırma yapmak için istenilen genetik değişiklikler ile stabil bir şekilde değiştirilmiş hücre hatları veya ırk hayvanlar oluşturma yeteneği ile sonuçlanır. CompoZr Özel ZFNs genom hücre tipleri çok çeşitli düzenleme için sağlam bir yöntem sağlar. ZFNs ile düzenleme başarılı genomunun Yayın oluşturmak için yeteneği vardır ama insan hücre hatları, fare, sıçan, Zebra balığı, kurbağa, domuz ve CHO araştırma modelleri ile sınırlı değildir. ^{3,4,5,6,7,8,9} ZFNs düzgün bir hücreye ulaştığında Belirtilen hücre tipinde istenen hedef yerinde çift sarmallı mola sağlanır. Bir hücrenin içinde birden fazla genetik modifikasyon sahip olmak için bir hücreye sıralı çinko parmak değişiklikler yapmak da mümkün. ¹⁰ belirli bir hedef sırası seçin ve yalnızca o belirli odağı birden yaratma yeteneği için birincil nedenidir değiştirme yeteneği modifikatyonlar.

Analiz CompoZr Özel ZFN belgesi böylece kiti tüm bileşenleri iyice müşteri başarı için onaylanmıştır güvence altına kiti sağlanan çok reaktifleri ile oluşturulur. Başından sonuna kadar, iş akışının önemli adımlar aşağıda sunulmuştur:

Hücre klonlama

Belirli bir hücre hattı izole etmek ve genişletmek için yeteneği herhangi bir ZFN deneyler başlamadan önce test edilmelidir. Tek hücreleri izole edilmiş ve bir klon-türevi nüfusu mümkün olduğundan emin olmak için genişletilmiş edilmelidir. Bazı hücre hatları bu konuda inatçı, ve bu şartlı medya ile düzenlenmiş klonlar için zenginleştirme, ya da kültür gibi hileler bu zorlukları aşmak için yardımcı olabilir.

Uygulama randımanına

Teslimat verimlilik Optimizasyonu ZFNs tesliminden önce bir zorunluluktur. Pek çok yöntem lipid bazlı transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofecti dahil olmak üzere kullanılabileceküzerinde. İdeal dağıtım yöntemi uygulama randımanına ve hücre canlılığı en optimal bir karışım elde edildi oluşur. Bu verimlilikler miktarlarının görsel denetim veya FACS 24-48hrs teslimat sonrası bir GFP kontrolü plazmid ve miktarlarının sunarak tahmin edilebilir.

Cel-I testi

Bu Cel-I PCR testi, sindirim ve elektroforezi parametreleri ZFN deneyi yorumlanması engel olmayacak emin olmak için uygun kontrollerin paralel olarak yapılır şarttır. Her kit analiz sertifikası Cel-I görüntü oluşturmak için kullanılan kontrolü genomik DNA içerir. Cel-I testi ile takip sağlanan primer ile kontrol DNA Amplifikasyon kullanıcı Analiz Sertifikası (CofA) görüntü kaydıyla birlikte sonuçları karşılaştırmak için, izin ve bir deneme bu açıdan herhangi bir potansiyel verimsizlik izole olacaktır. Böyle bir sahte veya GFP gibi uygun bir negatif kontrol hücre muameleÖrnek aynı zamanda herhangi bir spesifik olmayan parçalanma ürünleri ile aydınlatılması izin verilmelidir.

Tek hücreli klon Nicel / nitel analizi

ZFN tedavisi ve tek bir hücre Klonlamadan sonra, hücrelerin popülasyonlarının bir dizi yöntem ile, ilgilenilen loküsündeki düzenleme bakımından uygun şekilde taranabilmektedir. Cel-I tayini daha genotipleme için aday klonlar belirlenmesi amacıyla klonlar genomik DNA üzerinde yapılabilir. Bu, bir uygulamadan önce 1:01 oranında Örnek amplikonlar içine spike WT PCR amplikon önemlidir Cel-I homozigot mutant molekülleri klonlar homojen içerecek şekilde sindirilmesi, ve böylece bir negatif Cel-I test sonucu iletir. Bu aday klonlar taranması için alternatif bir yöntem doğrudan ZFN hedef site üzerinde bir PCR primer iniş tasarlamaktır. Kontrol primerler biri ile birlikte kullanılan bir negatif assay sonucu WT sekansı kaybına göstermektedir. En az bir WT alel içeren bir heterozigot klonu y olacaktırield PCR sinyali, fakat SYBR qPCR bağlamında PCR yapılarak tamamen WT klonlar ayrılacaktır olabilir.

Aday klonlar yukarıdaki yöntemleri ile tespit edilmiş olan bir kez, standart pyrosequencing, derin sekans, ya da diğer yöntemler ile sekans genotyped edilebilir. Tüm sekanslama için yöntemlerle, klonal genomik DNA oluşturulan bir amplikon oluşturulan edilmelidir. Geleneksel pyrosequencing allelleri için TA-klonlama PCR ürünü ile ayrı ve tek tek koloniler sıralama olabilir. Derin bu adımı sıralama gibi yöntemler için gerekli değildir.

Homoloji Yönetmen Onarım (HDR)

Bu protokol, NHEJ yoluyla ZFN aracılı gen boşaltma için bir yöntem sağlar. Transgenlerin entegrasyonu da kanadında bir kesim ZFN sitesi. ^11. Bu senaryoda, ZFN çift sarmallı mola HDR yerine NHEJ ile tamir edilir oluşturduğunuz homoloji silah ile plazmid bir donör tanıtımı tarafından yapılabilir. HDR i yönettitransgenlerin of ntegration bu protokol içinde yer alan prosedürlere benzer yöntemlerle teyit edilebilir.

Sorun Giderme

ZFNs teslim

ZFN teslimat ve ifade teslim bir GFP veya diğer görselleştirme ve / veya kantitatif için plazmid gibi. Teslimi ile de kontrol edilebilir Ilgi ile hücre tipi organizatörü uyumsuzluğu nedeniyle Düşük ifade mRNA formatında ZFNs teslimi ile çözmek mümkün olabilir. Buna ek olarak, soğuk şok yöntem ayrıca hücreleri ZFNs etkinliğini arttırmak için kullanılabilir. ¹² mRNA kullanılması durumunda bu hücreler her serum kaynaklı Rnases çıkarıldı sağlamak için gerçekleştirilmesinden önce yıkanıp şarttır. Bu buz üzerinde mRNA çözülme ve bozulmanın için herhangi bir şansı en aza indirmek için son anda hücrelere eklemek için de isabetli olmuştur.

Cel-I testi

Cel-I assa temeliy ilgi odağı belirli ve geniş amplifikasyon olduğunu. Non-spesifik amplifikasyon ürünleri gözlenmesi halinde bu şablonu miktarı optimizasyonu, astar konsantrasyon, ve bisiklet parametre olarak özgüllüğü artırmak için standart PCR sorun giderme yordamları kullanın. Ikinci yöntemi yeterli çözünürlük ve hassasiyet sağlamaz gibi standart agaroz elektroforez aksine PAGE analizi yapın. Herhangi sindirilmiş ürünü ya da aşırı bulaşması görülmektedir halinde Cel-I özeti koşulları da optimize edilebilir. Cel-1 nükleaz ve / veya sindirim süresi yeterli uzunluktaki bir miktarının titrasyonu bu yönleri iyileştirmek için titre edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Nükleaz S (Cel-1 enzim)	Transgenomic	706025
Yüksek Sadakat PCR Sistemi genişlet	Roche	03 300 242 001
Hücre Hattı Nucleofector Takımı V	Lonza	VCA-1003
GenElute HP Endotoksin-Free Plazmid Maxiprep Kiti	Sigma-Aldrich	NA0400