Brezilya'da Saha Sürümleri için Genetiği Değiştirilmiş Aedes aegypti'nin Seri Üretimi

Özet

RIDL^® (Baskın Ölümcül Taşıyan Böceklerin Salınımı) sistemini kullanarak Aedes aegypti'nin popülasyon baskısını elde etmek için çok sayıda erkek sivrisinek salınmalıdır. Bu, maksimum sayıda yüksek kaliteli erkek sivrisinek elde etmek için güvenilir sistemler sağlamak için kitlesel yetiştirme tekniklerinin ve teknolojisinin kullanılmasını gerektirir.

Özet

Sivrisineklere karşı savaşı kazanmaya çalışmak için yeni teknikler ve yöntemler aranıyor. Moleküler tekniklerdeki son gelişmeler, Steril Böcek Tekniği (SIT)^1-3etrafında yeni ve yenilikçi sivrisinek kontrol yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. RIDL (Baskın Ölümcül Taşıyan Böceklerin Salınımı)⁴olarak bilinen bir kontrol yöntemi SIT'a dayanır, ancak radyasyon sterilizasyonu ihtiyacını gidermek için genetik yöntemler kullanır^5-8. Ae. aegypti'nin bir RIDL suşu Grand Cayman^9,10'dasahada başarıyla test edildi; daha fazla saha kullanımı dünyanın diğer ülkelerinde planlanmış veya devam etmektedir.

Böceklerin kitlesel olarak yetiştirilmeleri birkaç böcek türünde ve haftada milyarlarca seviyeye kurulmuştur. Bununla birlikte, sivrisineklerde, yetiştirme genellikle çok daha küçük ölçekte gerçekleştirilir ve en büyük ölçekli yetiştirme 1970'lerde ve 80'lerde gerçekleştirilir. Bir RIDL programı için, ısırdıkları ve hastalığı bulaştırdığı kadar az dişinin serbest bırakılması arzu edilir. Bir toplu yetiştirme programında, serbest bırakılacak erkekleri üretmek için birkaç aşama vardır: yumurta üretimi, yavruya kadar yumurta yetiştirmek ve daha sonra erkekleri serbest bırakmadan önce kadınlardan sıralamak. Bu erkekler daha sonra pupa veya yetişkinler olarak yayınlanan bir RIDL kontrol programı için kullanılır^11,12.

RIDL kullanarak bir sivrisinek popülasyonu bastırmak için çok sayıda yüksek kaliteli erkek yetişkinin yetiştirilmesi gerekir^13,14. Aşağıda, Ae. aegypti ^8'inbir RIDL suşu olan OX513A'nın toplu yetiştirme yöntemleri açıklanmaktadır ve bir kontrol programı için yumurta üretimi ve toplu yetiştirme RIDL erkeklerinin üretimi için gerekli teknikleri kapsar.

Giriş

Sivrisinekler insanlarda bir dizi hastalığa neden olabilecek birçok patojeni iletir ve bu sivrisinekleri kontrol etmek yüzyıllardır devam eden bir savaş olmuştur. Kimyasal ve biyolojik yöntemlere dayalı böcekleri kontrol etme stratejileri bazı önemli başarılar elde etmiştir, ancak çoğu durumda kontrol uzun vadede sürdürülebilir olmamıştır. Örneğin, Brezilya 50'lerde Ae. aegypti'nin yok edilmesini sağladı, ancak sivrisinek son 40-50 yılda yeniden istila edildi. Bu, insektisit direnci, çevresel hasar, zayıf kontrol programı uygulaması^15-20ve yeterli izleme veya yanıt olmadan hızlı yeniden istila dahil olmak üzere birçok nedene bağlanabilir.

Sivrisineklere karşı bu savaşı kazanmaya çalışmak için yeni teknikler ve yöntemler aranıyor.  Moleküler tekniklerdeki son gelişmeler, Steril Böcek Tekniği (SIT)^1-3etrafında yeni ve yenilikçi sivrisinek kontrol yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. RIDL (Dominant Lethal taşıyan Böceklerin Salınımı)⁴ olarak bilinen bir kontrol yöntemi SIT'a dayanır, ancak radyasyon sterilizasyon ihtiyacını gidermek için genetik yöntemler kullanır. RIDL suşları, Ae. aegypti ^5-8, Ae. aegypti'nin ridl suşu Dahil olmak üzere çeşitlihaşere türleri için inşa edilmiştir. daha fazla saha kullanımı dünyanın diğer ülkelerinde planlanmış veya devam etmektedir.  RIDL kullanarak sivrisinek popülasyonlarını bastırmak, çok sayıda yüksek kaliteli erkek yetişkinin yetiştirilmesini gerektirecektir^3,14.

Bir SIT programı için sadece erkeklerin serbest bırakılması arzu edilir; dişi sivrisinekler ısırır ve hastalığı iletir. Ek olarak, serbest bırakılan steril erkekler, program etkinliğini azaltan serbest bırakılan kadınlar tarafından 'dikkatleri dağılabilir'. Sadece erkeklere özel salınım, ışınlanmış Akdeniz meyve sinekleri ile yapılan büyük saha deneylerinde karışık cinsiyet salınımından^3-5kat daha etkili olduğu gösterilmiştir 21 .

Bir RIDL kitle yetiştirme programında, erkekleri serbest bırakmak için üretmenin birkaç aşaması vardır.  Birincisi, salınım üretimi için gerekli yumurtaları üretmektir (Şekil 1). Bir sonraki aşama, larvaları pupalardan ve erkek pupaları dişi pupalardan ayırarak yumurtaları pupalara veya yetişkinlere geri getirmektir. Erkeklerin kadınlardan büyük ölçekli ayrılması, kütle sıralamaya uygun belirli bir yaşam aşamasında cinsiyetler arasında bir fark gerektirir²². Ae. aegypti'de (ve diğer sivrisinek türlerinde), cinsiyet ayırma teknikleri için yararlanılabilen erkek ve dişi pupalar arasında önemli bir boyut farkı vardır. Sıralanmış RIDL erkekleri daha sonra bir kontrol programında pupa veya yetişkinler olarak serbest bırakılır^11,12.

Aşağıda, Ae'nin RIDL suşu olan OX513A'nın kitlesel olarak yetiştirilmesi için yöntemler açıklanmaktadır. Aegypti, serbest bırakıl. Açıklanan yöntemler, bir kontrol programı için yumurta ve RIDL erkeklerinin üretimi için gerekli teknikleri kapsamaktadır.

Protokol

Böcek Gereksinimleri

1. Genel Bakış

1. Kütle yetiştirme, her biri kütle yetiştirme ünitesinin ayrı bir alanında gerçekleştirilen birkaç aşamaya sahiptir. Şekil 1, yetiştirmenin ana aşamasını ve toplu yetiştirme tesisinde nerede meydana geldiklerini göstermektedir.

2. Böcekçi için Biyogüvenlik Hususları

1. Proje, Brezilya São Paulo Üniversitesi'nden hayvan etiği komitesi tarafından onaylandı ve gerekli tüm izinler ve onaylar alındı.
2. RIDL sistemi koşullu öldürücülük kullanır; bir diyet takviyesi (tetrasiklin), böceklerin kitlesel olarak yetiştirilmesine izin vererek RIDL sisteminin ifadesini önler; tetrasiklin olmadan sivrisinekler ölür. Tetrasiklin, vahşi doğada Ae. aegypti üreme alanlarında bulunmaz, bu nedenle kaçaklardan üretilen herhangi bir yavru hayatta kalamaz.  Bu, diğer yöntemlerle(yani radyasyon) sterilize edilen vahşi tip (WT) böcekleri kullanma konusunda ekstra bir güvenlik seviyesi ekler.
3. Böcek ilacında çift kapılı giriş, "Sadece Yetkili Personel" işaretleri ve böcek ekranları kullanın. Koloninin WT böcekleri ile kirlenmesini önlemek ve böcek ilacının içinden kaçışları önlemeye yardımcı olmak için herhangi bir pencere kapatılmalıdır.
4. Yerel yönetmeliklerin ve yetkililerin belirli ek veya alternatif gereksinimleri olabilir. Erken bir aşamada bilgi / rehberlik için ilgili makamlarla iletişime geçin ve RIDL suşunu bir böcek ilacında kurmadan önce gerekli tüm izinleri ve onayları güvence altına alın.
5. Kütle yetiştirme insektisiti sadece RIDL yetiştirme için kullanılmalıdır. Başka hiçbir suş veya böcek bulunmamalıdır. Bu, RIDL suşu ve kirlenmesinin fitness ve hayatta kalmayı etkileyebilecek patojenlerle kirlenmesini önlemek, serbest bırakılan erkeklerin verimliliğini ve etkinliğini azaltmaktır.

3. Böcek Tasarımı

1. Şekil 2, Brasil'deki Biofábrica Moscamed'de kullanılan böcek ilacının bir planını göstermektedir.
2. Tüm odaların sıcaklığı 26 °C ± 2) idi ve yaklaşık% 70-80 bağıl nem ve floresan ışık şeritleri kullanılarak 12:12 saat ışık: karanlık döngü.
3. Bu şema belirli alan gereksinimlerine göre değiştirilebilir, örneğin sürümün ölçeği genel boyutu belirleyecektir. Bununla birlikte, yumurta üretimi, yetiştirme ve ayıklama, Kalite Kontrol (QC) ve serbest bırakmalar dört ayrı alana ayrılmalıdır: Yumurta Üretim Kolonisi, Serbest Bırakma Üretimi, QC ve Serbest Bırakma için Yetişkin Depolama.
4. Yumurta Üretim Kolonisi odası (yaklaşık 20 m²⁾salınım üretimi için yumurta üretmek için kullanılır.
5. Kalite Kontrol alanı, tarama oranı, pupa sayıları, pupa boyutu ve kadınların sıralanma ve çıkarılmasının etkinliğinin ölçülmesi de dahil olmak üzere PROSEDÜRLERI ve RIDL hattının uygunluğunu kontrol etmek için deneylerin yapıldığı yerdir. WT kontaminasyonu için testler, ölümcüllüğü ölçen ofset tahlilleri kullanılarak floresan belirteci ve fenotip bunların varlığını kontrol ederek de yapılır.
6. Serbest Bırakma Oluşturma odası (yaklaşık 36 m^2),tepsiler ve larva ve pupaların sıraya dizilimi için yeterli alan gerektirir. Tepsiler amaca uygun alüminyum raflarda tutulur. Yetiştirme ve ayıklama için geniş bir çalışma alanı ve lavabo, tepsilerin ve kafeslerin yıkanması için ise başka bir büyük lavabo gereklidir. Canlı sivrisineklerin kanalizasyondan kaçışını azaltmak için lavabolardan atık su çıkışına bir filtre yakalama tuzağı dahil edilmiştir.
7. Tepsiler için kullanılan tüm su, gelişimin herhangi bir aşamasında böceklerin kaçmasını önleyen bir ağ içeren bir bölmeye sahip bir drenajdan atılır.
8. Yetişkinler serbest bırakılmadan önce olgunlaşırken serbest bırakma cihazlarını tutmak için raf içeren serbest bırakma için yetişkinlerin depolanmasının bir alanı gereklidir (Serbest Bırakma için Yetişkin Depolama, Şekil 2).

Toplu Yetiştirme RIDL için Üretim Yöntemleri:

Yumurta Üretim Kolonisi, yetişkinleri üretmek için Salınım Üretimi 'nde (Şekil 1) kullanılan yumurtaları üretir. İki yetiştirme yönteminde birçok benzerlik vardır, aynı zamanda bazı belirgin farklılıklar vardır. Her iki prosedür için de aynı olan yetiştirme işlemleri sadece Yumurta Üretim Kolonisi bölümünde açıklanmıştır.

Yumurta Üretim Kolonisi

4. Larva Üretimi

Yumurta Üretim Kolonisi, Salınım Üretimi için homozigous OX513A RIDL yumurta⁸ üretir. Yüksek kalite kontrolü, sağlanan yumurtaların canlılığını, zindeliğini ve gerinim bütünlüğünü sağlar.

1. Kuluçka için uyaran, düşük çözünmüş oksijen seviyesine sahip suya batırılmasıdır. Sudaki oksijen seviyesini azaltmak için suyu kaynayana kadar ısıtın ve hemen 400 ml'yi 500 ml cam kavanozlara (74 mm açıklık çevresi) yerleştirin, kapağı güvenli bir şekilde sabitleyin ve soğuması için birkaç saat oda sıcaklığında bırakın.
2. Bir kavanoz kaynamış suya 1 g yumurta koyun, yeniden alın ve bir saat bekleyin. İçeriği 2 L su ile bir tepsiye aktarın ve böcek koşulları altında gece boyunca bırakın.
3. Yumurtadan çıkan larvaları bilinen bir su hacmine yerleştirin ve aliquots almak için yeterli zaman için manyetik bir karıştırıcı ve pire kullanarak karıştırın; kuvvetlice veya uzun süre karıştırmak larvalara zarar verir ve minimumda tutulmalıdır. Larvaları taramak için kullanılan standart hacim 1 L'dir, ancak 300'den fazla larva / ml'den fazla yoğunlukların sayılması zordur ve zarar verici olabilir. Bu nedenle yaklaşık 300.000 yumurta / L'den fazla su yumurtadan çıkmayın.
4. Üç adet 1 ml aliquot alarak ve fazla suyu emmek için emici bir süngerin üzerine 1 cm karelik bir ızgara ile emici bir kağıda yerleştirerek tarama oranını belirleyin.  Yumurtadan çıkmış ve taranmamış yumurtanın sayısını üç kareden, yumurtadan çıkmış bir yumurtanın eksik kapağını arayarak sayın. %80-90 civarında bir tarama oranı beklenmektedir.
5. Her biri 1 ml'lik dört aliquot alın ve dört siyah ağırlık teknesine yerleştirin (larvalar beyazdır ve bu nedenle siyah bir arka plana karşı daha kolay görülebilir) ve gözle bulunan canlı larva sayısını sayın; sayaç kullanılması önerilir. Ml başına ortalama larva sayısı daha sonra tepsi başına istenen sayıda larva elde etmek için her tepsiye eklenecek su hacmini hesaplamak için kullanılır.
6. Larvaların suşlar ve türler arasında yetiştirilebileceği yoğunlukta büyük farklılıklar olabilir. RIDL yetişkin erkek boyutunu vahşi tip erkeklerle karşılaştırmak da arzu edilir; ideal olarak, vahşi erkeklerle başarılı bir şekilde rekabet edebilecek daha büyük boyutlu RIDL erkeklerine benzer olmak istersiniz. Bu nedenle, her RIDL suşu için larvaların ideal yoğunluğunun belirlenmesi gerekir ve yetiştirme ve üretim ölçeği için alan kısıtlamalarına karşı bir takastır. 0.1-2.5 larva / ml arasında değişen yoğunluklar, üretim çıktısı ve kalitesinin iyi bir kombinasyonu olduğunu gördük; ayrıca Medici tarafından tartışıldı²³.
7. Larvaları tepsilere ekleyin. Tesisimizde üretim için larva yoğunluğunu sağlamak için yaklaşık 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x W x H) ve gerekli miktarda su içeren tepsiler kullanıyoruz.
8. Gerekli 30 μg/ ml'lik son konsantrasyonu elde etmek için tepsilere 1:100 seyreltmede bir tetrasiklin (suda 3 mg / ml) stok çözeltisi ekleyin.
9. Larvaları, ince bir toz haline getirilmiş pul balık yemi(www.sera.de)ile besleyin. Tablo 1, larva başına günlük gıda mg'ında tipik beslenme rejimini gösterir. Larvaları yukarıda açıklanan böcek koşulları altında uygun sıralama gününe kadar besleyin.

5. Larvaları Pupa ve Erkek / Dişi Pupalardan Sıralama

1. Larvaları pupalardan ayırarak kuluçkadan 8 gün sonra pupalardan sıralayın. Sonra erkekler için pupaları seksle sıralayın. ^{Plaka ayırıcısı 24,25} olarak bilinen bir cihaz larvaları erkek pupalardan ve dişi pupalardan sıralayabilir. Şekil 3, larvaları erkekten ve dişi pupalardan ayırmak için bu plaka ayırıcının kullanımını göstermektedir.
2. Altta bir ağ olan bir ölçüm kaşığı kullanarak, 500 pupa veya daha fazla ile kalibre edin ve kafesler kurmak ve üretilen toplam erkek ve dişi pupa miktarını tahmin etmek için kullanın.
3. Sıralamanın ilk gününde (8. gün) pupaların çoğu erkektir, bu nedenle sıralanmış larvaları bir tepsiye geri yerleştirin ve pupaların çoğunun dişi olduğu ertesi güne kadar arka tarafa yerleştirin (Şekil 4).
4. Sıralama işlemini her gün 2.1-2.3 adımlarında açıklandığı gibi, tüm larvalar yavrulanana kadar veya bir çalışma haftasının sonuna kadar tekrarlayın.
5. Bir kafese 1.000 erkek pupa (ölçü kaşığını kullanarak) yerleştirin ve 9. günde aynı kafese 3.000 dişi pupa ekleyin (örgü üst ve ağlı erişim deliği ile uyarlanmış 30 cm yüksekliğinde ve 30 cm çapında PVC borular kullanıyoruz, ancak BugDorm'dan 30 cm x 30 cm plastik kafesler de mevcuttur).
6. Yetişkinlerin en az 2 gün çiftleşmelerine izin verin ve onlara sakkaroz çözeltisi sağlayın (%10) kan beslemeden önce ıslak pamuklu reklam libitumunda. Haftada iki kan yemi ile iki hafta (~ iki gonotrofik döngü) yumurta toplayın. Bu, 3.000 dişilik bir kafesten (ortalama 48 yumurta / dişi) ortalama 143.000 yumurta verir. Haftada 4 milyon yumurta üretimi için her hafta yaklaşık 28 kafes kurulması gerekir.

6. Kan Besleme

1. Alüminyum plaka besleme sistemi kafeslere haftada iki kez kan sağlar. Parafilmli bir alüminyum plakanın (10 cm x 10 cm x 3 mm) yanında bir kan cebi oluşturulur (Şekil 5). Beslenmeyi teşvik etmek için, plaka besleyicinin üzerine ısıtılmış bir fasulye torbası yerleştirilerek kan ısıtılır. Fasulye torbası, bir mikrodalga fırında yaklaşık 10 saniye ısıtılan bir bez torbada yaklaşık 250 g buğday tanelerinden oluşuyordu. Beslenme için kullandığımız kan yerel bir sitoirden; Bu hayvanlar (özellikle keçiler ve koyunlar) insan tüketimi için olduğu için patojenlerin varlığını önlemek için test edilirler.
2. Kan beslemeden üç gün sonra, dişilerin yumurtalarını bırakmaları için bir yumurtlama alanı sağlanır. Yumurtlama bölgesi, içini kaplayan su ve filtre kağıdı ile yaklaşık 1/4'e doldurulmuş yuvarlak bir plastik kaptır. İki gün sonra yumurtlama yeri kaldırılır. Maksimum yumurta üretimi için, filtre kağıdının kabın içindeki mevcut yüzeyin tamamını kapladığından ve ıslak kaldığından emin olun.
3. Yumurta kağıdını çıkarın ve böcek koşullarında kurumak için emici kağıda yerleştirin; yumurtalar yüksek nemde (%70'in üzerinde) bir şartlanma süresi gerektirir en az 48 saat sonra döşenir. Yumurtalar, nem yüksek tutulduğu sürece, kuluçka oranında minimum düşüşle³aya kadar böcek ilacı içinde bırakılabilir.
4. Yumurta üretim kolonisinin, serbest bırakma programı için haftalık olarak gerekli olan yumurta sayısını sağlamak için yeterli boyutta olması gerekir. Yukarıda açıklanan tesis, haftada 28 kafes ile yaklaşık 4 milyon yumurta üretebilir. Salınım Üretimi ve Yumurta Üretim Kolonisi için en az 4 haftalık yumurtayı garanti edecek kadar yumurtanın saklanması önerilir.

Sürüm Oluşturma

7. Larva Üretimi

Salınım üretimi için tarama, yetiştirme ve sıralama işlemleri, Yumurta Üretim kolonisi için daha önce açıklanan yöntemle aynıdır. Bununla birlikte, üretim ölçeği çok daha büyüktür ve bu daha fazla tepsi ve daha fazla çaba gerektirir.

8. Larvaları, Erkek Pupaları ve Dişi Pupaları Sıralama

1. Larvaların, erkek pupaların ve dişi pupaların sıraya dizilişleri Yumurta Üretimi için açıklanan yöntemle aynıdır.
2. Erkek pupaları sıraladıktan sonra, serbest bırakılmadan önce kadın kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek önemlidir; % 1'den fazla kadın olmamalıdır. 500 pupadan üç aliquot alın (üç rastgele pupa ölçüm kaşığı) ve mevcut dişi pupa sayısını sayın. Dişiler genellikle erkeklerden daha büyük oldukları ve genital lob şeklindeki farklılıklardan tanımlanabilirler (Şekil 6)²⁷. % 1'den fazla kadın varsa, tekrar başvurulmalı ve kontrol edilmelidir.
3. Serbest bırakmak için sadece 8 ve 9. kalan larvaları ve pupaları otoklav. Brezilya'da, bu atık tıbbi atıklarla aynı şekilde ele alınmalıdır, ancak düzenlemeler diğer ülkelerde farklılık gösterebilir. Kalite kontrol, yetiştirme ve kontaminasyon risklerindeki farklılıklar, daha büyük sayılardan ve daha düşük kalite kontrolü nedeniyle Yumurta Üretim Kolonisi için Salınım Neslinden dişi pupa ve larvalar kullanmayın.

Serbest Bırakma için Yetişkin Depolama: Erkekleri serbest bırakılmadan önce ortaya çıkmak ve olgunlaşmak için serbest bırakma cihazlarına yerleştirin. Serbest bırakma cihazlarının ayrıntıları bu yöntemde ele alınmaz. Ancak kullandığımız serbest bırakma cihazlarının kapasitesi 1.000 erkek civarındadır. Sürüm yöntemi ayrıntıları (sürüm cihazı ve sürüm sistemi) bu yöntemde ele alınmaz.

Sonuçlar

Üretim için beklenen yavru sonuçları Şekil 4'te gösterilmiştir. Erkekler ilk önce yavrular, 8. günde zirve yapar ve dişiler kuluçkadan çıktıktan sonra 9. Erkekleri kadınlardan ayırmak için en iyi zamanı bilmek için bu yavru eğrisini ölçmek önemlidir.

6 aydan fazla erkek ve dişi pupaların tasnifinden elde edilen sonuçlar, kadın kontaminasyonunun ortalama% 0,02 olduğunu göstermektedir (Şekil 5; SEM = %0,004). Bu bulaşma oranı, bir aylık salınımlar (yaklaşık iki milyon erkek) üzerinde salınan sadece 400 kadını temsil eder. Haftalık mevcut yumurta üretimi 4 milyondur. Bunların 3,5 milyon'ı yumurta kolonisi ve üretimi için yumurtadan çıkar ve geri kalanı yedek için saklanır. Yumurtaların yaklaşık% 11'i yumurta üretim kolonisi için kullanılır ve geri kalanı serbest bırakılmak için kullanılır. Yumurta kuluçka oranı ortalama %87,3 (SEM = %0,5) ve L1 larvalarından erkek pupa verimi ortalama% 29,5 'tir (SEM = 1.2). Yaklaşık 571.000 erkek pupa üreten SalınımLı Nesil kolonisi için her hafta iki milyon larva yetiştirilmektedir (SEM = 14.000). Ortaya çıkma ve salınım sırasında pupa ve yetişkin mortalitesi ortalama% 5'tir ve haftada yaklaşık 543.000 (SEM = 13.000) yetişkin erkek sivrisinek salınmıştır. 4 milyon yumurta /haftalık mevcut üretimin, atık ve depolamadan kaynaklanan kaybı azaltmak için daha fazla optimizasyonla ~ 3 milyon / haftaya düşürülebileceği tahmin edilmektedir. Açıklanan üretim için toplamda 6 personele ihtiyaç vardır; dördü salınım üretimi üzerinde çalışıyor ve kalan ikisi yumurta kolonisinde.

Kalite Kontrol

Kalite kontrolü, yetişkinlerin kalitesini, yetiştirme verimliliğini, işçiliği ve maliyetleri korumak için gereklidir.

Transgene fenotip kontrolü

RIDL gen ekspresyonunun doğrulanması için iki kontrol gerçekleştirilir, birincisi floresan işaretleyicinin ifadesini kontrol etmek ve ikincisi tetrasiklin yokluğunda RIDL öldürücülük özelliğinin ifadesini kontrol etmek. Tüm larvalar floresan işaretleyiciyi ifade etmelidir. Floresan işaretleyicinin beklendiği gibi ifade olup olmadığını kontrol etmek için, 2.000 ilk başlangıç larvası, DsRed2 filtreli (Texas Red) leica MZFLIII stereomikroskop altında kontrol edilir. Tetrasiklin olmadan RIDL geni ifade edilir ve yetişkinlere% 3-4 sağkalım bekliyoruz⁸. Bunu kontrol etmek için, tetrasiklin içermeyen her serbest bırakma toplu işlemi için fazladan bir tepsi ayarlanır. Normal yetiştirme için tek fark, yiyeceklerin 6 günden itibaren 2/3 oranında azaltılmasıdır, çünkü ölü larvalara bağlı fazla yiyeceklerin birikmesi aşırı bakteri üremesine neden olabilir.

Yetiştirme kontrolü

Sürüm oluşturmadan dört tepsi, ayrı ayrı sıralanacak ve sayılmak üzere rastgele seçilir. Erkek ve dişi pupa sayısı her gün her tepsiden kaydedilir (Şekil 4). Beklenen erkek ve kadın sayısından herhangi bir sapma, üretimi ve / veya zindeliği etkileyebilecek ve sorunların kaynağını belirlemeye yardımcı olmak için yumurta kolonisi ile karşılaştırılabilecek potansiyel bir sorunu gösterir.

Pupa Ölçümleri

Pupa boyutunun yetişkin boyutu²⁸ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Yetişkin boyutu için bir kalite kontrolü olarak sefalotoraks genişliği, Serbest Bırakma Neslinden itibaren her sıralama günü için en az 30 erkek pupa ile ölçülür; Yumurta Üretimi için Koloni dişi pupalar da ölçülür. Ortalama sefalotoraks genişliği serbest bırakılan erkekler için 1,05 mm (SEM 0,005), erkekler ve dişiler için sırasıyla Yumurta Üretimi, Kolonisi; Ae. albopictus kütle yetiştirme²⁴için benzer sonuçlar elde edilmiştir.

Şekil 1. Bir RIDL / SIT programında kullanılmak üzere kitlesel yetiştirme sivrisineklerinin aşamaları. Yumurta Üretim Kolonisi, salınım üretimine sağlanan yumurtaların kalitesini sağlamak için yüksek düzeyde kalite kontrolüne sahiptir.  Yumurtalar, erkeklerin dişilerden sıralandığı serbest bırakma kolonisinde pupalara yetiştirilir.  Erkek yetişkinler daha sonra RIDL kontrol programı için kullanılır.

Şekil 2. Bir serbest bırakma programı için RIDL erkeklerinin üretimi için yetiştirme tesisinin şeması. Yüksek kaliteli yumurtalar yumurta üretim kolonisi odasında sürekli olarak üretilir ve daha sonra Serbest Bırakma Üretim odasında pupalara yetiştirilir. Larvalar ve pupalar daha sonra ayrılır ve pupalar erkekler için cinsiyet olarak sıralanır. Erkekler daha sonra serbest bırakma cihazlarına yerleştirilir ve yetişkin depolama ve serbest bırakma odasında serbest bırakılmak üzere yetişkinlere olgunlaşmalarına izin verilir. 

Şekil 3. Larvaları, erkek pupaları ve dişi pupaları bir plaka ayırıcı kullanarak ayırmak²⁶.  Plaka ayırıcı, bu üç farklı yaşam aşamasını sıralamak için larvalar, erkek pupalar ve dişi pupalar arasındaki boyut farkını kullanır; larvalar, dişi pupalardan daha küçük olan erkek pupalardan daha küçük olma eğilimindedir.  Cihaz iki cam plakadan oluşur; biri eğimli metal çerçeveye sabitlenir ve diğeri ilk plakanın üzerine oturur ve dört ayar vidası(A)kullanılarak ilkine göre hareket ettirilebilir.  Dört ayar vidası, dış plakanın arka plakaya bir açıyla ayarlanabilmesini sağlar, böylece plakalar arasında aşağı doğru sivrilen kama şeklinde bir boşluk oluşur.  Larvalar ve pupalar cam plakalar (B) arasına dökülür ve bir su hortumu (C)kullanılarak hafifçe yıkanır.  Plakanın açısını ayarlayarak larvalar, erkek pupalar ve dişi pupalar ayrılabilir (D).  Sürekli yıkama ve plaka açısının artırılması ile larvalar önce (bir elek içine), ardından erkek pupa ve son olarak dişi pupalara yıkanabilir. 

Şekil 4. Kitle tarafından yetiştirilen RIDL Ae. aegyptiiçin yavru eğrileri .  Bu grafik, haftada ~135.000 pupa ile 23 haftalık gözlem sırasında kitlesel yetiştirilen RIDL erkek ve dişi pupalar için ortalama yüzde yavruyu göstermektedir.  Hata çubukları = standart ortalama hatası, n = 23. İlk koleksiyonda (8 gün) ortalama% 59 erkek ve% 30 dişi pupayı 5 gün boyunca tepsilerden kurtarılan toplam pupalardan kurtardık. 

Şekil 5. Sıralanmış erkek pupaların ortalama kadın kontaminasyonu. Bu grafik, altı aylık bir süre boyunca yumurtadan çıktıktan sonra 8. 

Şekil 6. Alüminyum plaka kan besleyici sistemi. Plaka (B) Parafilm (A) ile kaplanır ve bir cebe pipetlenmiş ve daha sonra mühürlenmiştir (D). Plaka bir kafese yerleştirilir ve üzerine ısıtılmış bir fasulye torbası (C) yerleştirilerek ısıtılır (E). 

Şekil 7. Erkek ve dişi Ae. aegypti pupa ayırt edici. Ae. aegypti pupa, genital lob şeklindeki farklılıklarla güvenilir bir şekilde seks yapılabilir (küreklerin hemen altındaki pupal karın segmentlerinin sonunda). Ek olarak, erkekler de kadınlardan daha küçük olma eğilimindedir.   

Tablo 1.  Ae. aegypti RIDL larvaları için genel beslenme rejimi (günde larva başına yiyecek mg). Gerekli gerçek yiyecek miktarını hesaplamak için tepsi başına toplam larva sayısı ile çarpın.

Tartışmalar

RIDL, sivrisinekleri kontrol etmek için etkili ve çevre açısından güvenli bir yöntemdir^3,29-31. Teknik entegre bir haşere yönetim programı için geçerlidir ve larvicides, üreme alanı azaltma ve zina dahil olmak üzere en güncel kontrol yöntemleri bu teknoloji ile uyumludur. Bu yöntem, Ae'nin kontrolünde kullanılmak üzere haftada 570.000 RIDL erkek pupanın nasıl üretılacağını açıklar. Aegypti ve bilgimize göre bu, bu ölçekte transgenik sivrisinek üretiminin ilk açıklamasıdır. Bazı karşılaştırılabilir üretim sistemleri 1960'larda ve 70'lerde vahşi tip Ae. aegypti için geliştirilmiştir^,ancak o zamandan beri bu ölçekte karşılaştırılabilir bir üretim olmamıştır. Brezilya'da Şubat 2011'den Şubat 2012'ye kadar yaklaşık 11 milyon erkek serbest bırakıldı. Belirli bir alanın kontrol edilmesi için gerekli olan erkek sayısı, vahşi popülasyonun büyüklüğü, serbest bırakılan erkeklerin dağılımı, serbest bırakıldıktan sonra erkeklerin hayatta kalma ve çiftleşme rekabet gücü ve çevre koşulları dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlıdır.  Önceki çalışmalar, RIDL'nin bir sivrisinek popülasyonu en az% 80 9 azaltabileceğini^{göstermiştir.}

Üretim ölçeği ve maliyet ile erkeklerin kalitesi için kütle yetiştirmeyi optimize etmek arasında bir dengeye ihtiyaç vardır. Örneğin, larva yoğunluğunu artırmak, gerekli alanı, işçiliği ve yavrulama süresini azaltarak üretim kapasitesini artırabilir³². Bununla birlikte, çok yüksek larva yoğunlukları, çiftleşme kapasitesi^32,33azaltılmış daha küçük ve daha kısa ömürlü erkeklere neden olabilir. Bir SIT programı ile ilgili olarak erkeklerin kalitesi, sonuçta serbest bırakılan erkeklerin tarladaki kadınlarla çiftleşme yeteneği ile değerlendirilecektir. Vahşi muadillerine göre çiftleşme rekabet gücünü değerlendirmek için kapsamlı saha değerlendirmesi gereklidir^9,10. Bu genellikle tam olarak hangi faktörlerin 'yüksek kaliteli' bir erkek sivrisinek yaptığını değerlendirmeyi pratik hale getirir. Bununla birlikte, büyük ölçekli kitlesel yetiştirmede tutarlı üretim ve kaliteyi (rutin olarak değerlendirilebilecek ölçüde) korumak çok önemlidir. Bu, potansiyel olarak önemli bir etkiye sahip olan küçük dalgalanmalarla tüm sürecin yüksek düzeyde uyanıklık ve standardizasyonunu gerektirir. L1 larvalarının aliquoting kritik bir adımdır ve bu noktayı göstermektedir. Doğru sayıda larvayı tepsilere aliquoting kaliteli üretim için gereklidir. Besleme rejimi, belirli sayıda larva için hassas bir şekilde uyarlanmıştır. Çok az / çok fazla larva, larvaların hayatta kalmasını, pupaların boyutunu ve yavrulama zamanını etkileyen aşırı / az beslenmeye neden olacaktır. Kitlesel yetiştirme sanatının bir sırrı varsa, üretim döngüsündeki birçok küçük adımın bu makalede açıklandığı gibi tutarlı, hassas ve yüksek düzeyde kalite kontrol ile yürütülmesini sağlamaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vipan Premium	Sera GmbH	190	http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html
Tetracycline	Sigma Aldrich	T7660	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=T7660|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC
Plate separator	J.W. Hock	5412	http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf
Parafilm M	Pechiney Plastic packing	PM-996	www.parafilm.com
Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm)	Pleion	0757	http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1
Fluorescent scope	Leica Microsystems	MZ FLIII	http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf
Adult cages	BugDorm	DP1000	http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
Filter paper	CELAB		http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html