Için İpek Film Kültür Sistemi In vitro Analizi ve Tasarımı Biyomateryal

Özet

İpek filmler biyomedikal uygulamalar bir dizi için kolayca özelleştirilebilir biyomalzemelerin yeni bir sınıfı vardır. Sunulan ipek film kültürü sisteminin çeşitli çok iyi adapte olduğu In vitro Analizleri. Bu sistem bir biyomateryal tasarım platformu sunan temsil In vitro optimizasyonu In vivo Modelleri.

Özet

İpek filmleri bir araştırma laboratuvarı ortamında ^1,2 içinde yüksek sadakat ve ekonomik ile imal edilebilir protein bazlı biyomateryaller umut vericidir. Bunlar, yüksek kontrol edilebilen boyutsal ve materyal özelliklere sahip hücre adezyonu biyolojik uyumlu ve teşvik vardır, çünkü bu malzemelerin arzu edilir, topografik desen ile ya da kimyasal olarak yüzey değiştirerek modifiye edilebilir, ve ilaç verme, ilgili uygulama için biyolojik olarak etkin olan moleküller için bir depo olarak kullanılabilirler ^3-8. Ayrıca, ipek filmler dakika içinde eritmek veya in vitro veya in vivo yıldır aşağılamak için tasarlanmış olabilir, özel tasarımı oldukça basit olup, doğada şeffaf ve görüntüleme uygulamaları ⁹ dolayısıyla çok uygun olmanın yararı ile üretmek vardır ^{- 13.} Burada sunulan kültür sistemi metodolojisi hücre ipek film yüzeyinin hızlı değerlendirmeler için ölçeklenebilir bir yaklaşımı temsiletkileşimleri. Özellikle ilgi hizalama ^12,14 için hücre çoğalması ve hücrelerin yanıtları farklılıklar çalışma yüzeyine desenli ipek filmlerin kullanımıdır. Numaralı seribaşı kültürleri mikro-desenli ve düz ipek filmi yüzeylerde hem kültüre ve sonra time-lapse faz-kontrast görüntüleme, taramalı elektron mikroskobu ve metabolik aktivite ve nükleik asit içeriği biyokimyasal değerlendirmesi yoluyla değerlendirildi. Özet olarak, in vitro kültür sistemde ipek filmi daha sonra in vivo modeller optimize edilmiş ve daha sonra tercüme edilebilir bir biyomateryal substrat hücre-yüzey etkileşimleri, çalışmalarına uygun özelleştirilebilir bir deney düzeneği sunmaktadır. Burada sunulan kültür sistemi kullanılarak Gözlemler henüz temel hücre etkileşimleri, tıbbi cihaz tasarımı kadar uygulamaları yardımcı olmak için kullanılan ve böylece biyomedikal alanlarında geniş bir yelpazede alakalı edilir.

Protokol

1. Silikon Kauçuk Kalıp İmalatı

1. Döküm için istenen bir topografik yüzey üretin veya satın alın. Bu yayın için bir standart 100 mm kazınmış silikon (Şekil 1) tarif edilecektir.
2. Polidimetilsiloksan (PDMS) Dolgu (bileşen A) ve satın alınan kit belirtildiği gibi bir oranı 01:09 (9 g Dolgu ve 1 g katalizörü) içinde katalizör (bileşen B) solüsyonu dışarı tartılır.
3. Kurutma işlemi başlatmak için iyice çözümler karıştırın.
4. Bir döküm çanak içinde yer silikon yüzey.
5. Silikon üzerine PDMS çözelti 4.5 g dışarı tartılır.
6. Yayılma PDMS çözüm gofret yüzeyinin 100 mm çaplı alanı kapsayacak.
7. Eşit PDMS çözüm yaymak için gofret eğin.
8. 100 mm çapındaki petri kapaklı gofret örtün.
9. Yer kür düz bir yüzey üzerinde gerçekleşmekte olduğu belli şekilde, 60 gece boyunca ° C fırın içine kurulum döküm.
10. Yeri% 70 etanol içine PDMS / silikon tedavikaldırılmadan önce banyo.
11. İlk kenarı (tüm çevresi) kaldırmak için jilet kullanarak gofret gelen PDMS kaldırarak başlayın.
12. Yavaşça silikon kauçuk döküm gözyaşı özen% 70 etanol banyosu içinde forseps kullanarak kapalı PDMS çekin.
13. 14 mm delik delme kullanarak bireysel PDMS kalıplar Punch. Bu çap 24-iyi plaka kurulum içine sığacak şekilde tasarlanmıştır.

2. İpek Çözüm Üretimi

1. Bir cam beher ⁷ içinde bir raddeye distile su (dH ₂ O) 2 L getirin.
2. Üçe Bombyx mori ipekböceği kozası 5 g kesin.
3. Aşırı böcek partikül kaplama iç koza yüzey tarafından belirtildiği gibi yoğun kirli koza atın.
4. Sodyum karbonat, 4.24 g ölçün.
5. Su üzerine kaynar önlemek için dH ₂ O hacmi kaynatarak yavaş yavaş sodyum karbonat ekleyin ve devam etmeden önce tam çözünmesini sağlar.
6. Kaynar dH koza parçaları ekle _{2 40 dk., ve kaynama işlemi sırasında kozalar karıştırmak için bir Teflon kaplı karıştırma çubuğu kullanın Ç.}
7. Kaynar sonra, dikkatlice fazla suyu çıkarmak için elle ipek özü dışarı lavabo ve halka içine dH ₂ O süzün.
8. Ipek 20 dakika boyunca üç kez yıkayıp ayıklayın. bir laboratuar beherdeki dH ₂ O 1 L her ve beher içinde hacim dolaşmaya Bir karıştırma çubuğu kullanın.
9. Kimyasal bir kaput içinde el ve yer ipek lif özü tarafından ipek özü çıkışı, halka yıkadıktan sonra bir 12 saat süreyle kurutulması için izin vermek. dönemi.
10. Ertesi gün, genelde ~ 3.5 g kurutulmuş ipek lifleri, ağırlığında: ___________-g
11. Ipek,% 20 w / v solüsyonu 9.3 M LiBr çözeltisi hazırlayın. Gerekli ağırlık ve hacimleri hesaplamak için aşağıdaki denklemleri yararlanın:
    1. (Adım 10 İpek ekstresi ağırlığı) x (4) = toplam 9.3 M LiBr çözüm ___________-ml
    2. [(807,705) x (parçası 11.a gelen LiBr hacmi)] / 1000 = LiBr ___________ g dH ₂ O eklemek
12. Aşağıdaki dH ₂ O hacmi bir bardak behere ölçülen LiBr ağırlık ekleyin:
    1. (0.8) x (11.a adım hesaplanan hacim) = ___________ dH ₂ mL O
13. Dereceli silindir uygun büyüklükte içine bu sıvıyı dökün ve yarı Madde 11.A. hesaplanan son hacmi çözüm getirmek
14. Behere ipek özü yerleştirin ve ipek lifleri bir laboratuar spatula ile LiBr çözümü içinde batırılır emin ipek lifleri üzerinde LiBr çözüm dökün.
15. 60 içine yerleştirin çözünmüş ipek ° 4 saat süreyle C fırın:
    Başlama saati: ___________
    Zaman End: ___________
16. Uygun büyüklükte şırınga kullanarak ipek çözüm 12 ml kadar çizin. Şırınga sonunda bir 18G iğne yerleştirin ve sonra bir diyaliz kaset (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific) içine enjekte çözüm. Kaset doldurduktan sonra, boşaltılmış şırınga ile kaset dışında kalan hava çizin.
17. Yeri fidH ₂ O 1 L içinde lled diyaliz kaset
18. 1 saat, 4 saat, 8 saat ve daha sonra 6 değişikliklerin toplam 3x her 12 saat sonra dH ₂ O hacmi değiştirin:
    1. Başlangıç: ___________
    2. 1hr: ___________
    3. 4saat: ___________
    4. 8 saat: ___________
    5. 12 saat: ___________
    6. 12 saat: ___________
    7. 12 saat: ___________
    8. End: ___________
19. Diyaliz sonrası yavaş yavaş şırınga ile kasetlerden ipek çözüm toplamak. 10.000 gr anma santrifüj tüplerine Yeri çözüm.
20. 20 dakika her biri için 4 ° C'de 10,000 g'de santrifüje çözeltisi iki kez. Yeni bir tüp içine her santrifüj yer süpernatant sonra.
21. 4 ° C'de buzdolabında saklayın thr ipek çözüm.
22. Küçük tartmak çanak ve yerine 0.5 mL ipek solüsyonu 2 örneklerin içindeki yemekler tartmak 60 ° 12 saat veya ipek çözüm kuruyuncaya kadar C kuru fırın.
23. Bot geri kalan katı ipek filmi tartılırh örnekleri hacmi protein konsantrasyonu için ipek çözüm yüzde ağırlığı ölçmek için:
    1. ___________ Mg kombine 2 ipek film numunelerinin Ağırlığı
    2. (23.a arası ağırlık) x (100) = ___________% ipek

3. İpek Film ve Kültür Sistem Kurulumu Hazırlama

1. Toz kaldırmak için net bant ile temizleyerek PDMS döküm yüzeyleri hazırlayın.
2. Temiz PDMS% 70 EtOH suda bekletip yüzeyleri ve dH ₂ O ile üç kez yıkayın
3. Tipik bir 24 de plaka kapağı tutucu plakası, üzerine Yeri 14 mm PDMS kalıplar.
4. 50 mikron kalınlığında film üretmek için, genellikle 1 ml şırınga ucu ² olan bir sıvı yayma aracı kullanarak PDMS kalıplar üzerine% 8 ipek çözüm 70 μls yayıldı.
5. 90 dakika süreyle ya da filmler kadar 150 Pa bir hava akımı basınç çalışan temiz bir bankta ortaya kurumaya ipek filmler İzin kuru vardır.
6. Bir kere film kuru bir yerde PDMS m dahil olmak üzere film seti, tüm vardıryaş, suda çözünmeyen bir film üretmek üzere> 4 saat için bir su-tavlama haznesine. Bu, tipik olarak 25 kPa vakum ¹⁵ az çekilmiş lavabo alt su ile boş bir kurutucuda bölmedir.
7. Ipek filmleri temiz bir tezgah üzerine su tavlama odası ve yerden çıkarın.
8. Sterilize etmek için en az 10 dakika kuyu içinde% 70, bir 35 mm petri içinde EtOH banyo ve yer kontrol yüzeylerde (yani cam veya plastik yüzeyler) ve paslanmaz çelik halkalar hazırlayın.
9. Forseps kullanarak PDMS kalıplar ipek filmleri çıkarın,% 70 EtOH içine daldırın, ve emin desenli tarafı yapma% 70 EtOH 1 mL ile doldurulmuş 24-iyi plakasına yerde örnek hücre yapışması için izin verecek şekilde karşı karşıya.
10. Üstüne gelen iyi yerde paslanmaz çelik halka ağırlıkları (11.65 mm iç çapı 15.45 mm dış çaplı ve 1.18 mm kalınlığında) içine her ipek filmi örnek yerleştirdikten sonra.
11. Halkalı örnekleri steril sağlamak için 10 dakika inkübe izin verin.
12. RemoEtOH ettik ve 1 mL PBS ile 3x her numune yıkayın. Her yıkamadan tam difüzyon sağlamak için 5 dakika bekletin.
13. Ipek film numunelerinin altında baloncuklar çoğunluğu kaldırmak için emin yaparken, aspire cam pipet kullanarak PBS çıkarın.
14. Ekimi için hücre hattı hazırlayın. Bir örnek olarak, 7-dakika için% 0.25 tripsin ve etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile insan korneal epitelyal-limbal (HCLE) hücre hattı trypsinize. Tripsin% 10 FBS ile Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) geçişi ortam 01:01 hacmi ile deaktive eklendi. Tripsinize HCLE hücreler santrifüj, hücre pelletini için keratinosit-serum serbest medya 8 mL (K-SFM) ekleyip hafifçe HCLEs dağıtmak için ajitasyon ve hücre sayımı oluşturmak.
15. De tipik olarak 10.000 hücre / cm ² yoğunluk başına HCLE süspansiyon Örnek 500 uL.
16. 37 kuvöz içinde yer kültürler ° C ve% 5 CO ₂ ve istenen deney protokolünde çalıştırın.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Ipek film yapım ve kültür sistemi hazırlık özet gösteren Şekil 1. Akış şeması 10 adımlık süreç.

Şekil 2. Standart fotolitografik ve kuru aşındırma teknikleri kullanan bir 90 mm ​​çapında silikon üzerine üretilen desenli hat yüzeylere (A) 21-boya dizi. (B) İpek filmler PDMS kalıp yüzeylerinde attıktan sonra orijinal paralel çizgi desenli özelliklerini korurlar. (C) şematik gösterilmesi özelliği boyutlu tasarım hücresel uyumu teşvik etmek için seçilmiştir. Muhafaza paralel dizilmiş desenli yüzey gösteren ipek film (D) Kesit.

Şekil 3. (A) desenli yapışmış HCLE hücre hattı elektron mikroskop fotoğrafları Taramave (B) kültüründe günde 2 düz ipek filmler. HCLE kültürleri kültür günde 8 ile (C) desenli ve (D) düz yüzeyler üzerinde birleştiği yayılmaya devam etmektedir.

Şekil 4. (A, D, G) Desenli ve (AC) 1. gün, (DF) 4. günde karşılaştırmalı (B, E, H) düz ipek film kültürü HCLE hücreleri (C, F, I) cam kontrolü yüzeylerde, kültür ve (Gİ) 8. günde. (J) CyQuant nükleik asit içeriği ve (K) (3 - desenli ve düz yüzeyler ipek filmin her iki HCLE canlılığını gösteren (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromid (MTT) metabolik aktivite tayini verileri zamanla cam kontrol yüzeyleri (ölçek bar = 100 mikron) göre.

Video 1. Bir 18 saat boyunca desenli ipek filmi yüzey üzerinde göç HCLE hücrelerinin Zaman gecikmeli faz-kontrast görüntüleme. süre. Hücreler 10k/cm ² yoğunlukta ekildi ve 2 saat boyunca kültüre edildi. görüntüleme önce. filmi görmek için buraya tıklayın .

Video 2. Bir 18 saat boyunca düz bir TCP kontrol yüzeyi üzerinde göç HCLE hücrelerinin Zaman gecikmeli faz-kontrast görüntüleme. süre. Hücreler 10k/cm ² yoğunlukta ekildi ve 2 saat kültüre edildi. görüntüleme önce. filmi görmek için buraya tıklayın .

Tartışmalar

Hücre kültürü için bir substrat olarak rejenere ipek filmlerin kullanılması, bu proteinin malzeme özelliklerinin kapsamlı karakterizasyonu nedeniyle son yirmi yılda popülerlik kazanmış ve biyomalzeme programı ^3,8 anlayışı artmıştır. Burada anlatılan kültür sistemi desenli ipek filmin biyomateryal yüzeylerde ⁷ hücre yüzey etkileşimlerini değerlendirmek için in vitro test sisteminde yeni bir temsil eder. Sistem kolayca yüksek verimli veri toplama için kabul edilebilir zaman içinde hücresel etkileşimlerin derinlemesine analiz sağlar. Kovalent modifikasyon veya adsorpsiyon yoluyla çeşitli yüzey kimyası, yüzey kontrolü mikro / nano-yüzey topografisi ^7: ipek filmler de dahil olmak üzere doğrudan hücre fonksiyonu ^8,9,12 etkileyen değiştirilebilir ayarlanabilir biyomalzeme birtakım özelliklerini, sahip, çünkü bu büyük ölçüde etkin sağlam mech; biyolojik olarak aktif moleküllerin ¹³anical özellikleri ^15,16; malzeme hidrofiliklik / hidrofobikliğinin ¹⁶ kontrolü; sürümü ^4,8,17 için biyolojik bileşiklerin toplu yükleme ve ikincil yapı kontrolü ile kontrollü çözülme / enzimatik bozunma oranları (beta sayfalık içeriği) ^11,18,19 .

Ipek filmlerin asetat su buharı ^7,15 varlığında vakum altında bir süre için film tavlama ile elde edilir. Bu yaklaşım, işlem ışığı ¹⁵ minimum kırınımı izin verirken suda çözünmezlik malzemenin teşvik, β-tabaka ikincil yapı oluşmasına izin verir. Filmlerin Bu şeffaflık mikroskop sistemleri ^12,20 herhangi bir sayı kullanarak görüntüleme yöntemleri (örneğin geniş alan ve floresan) bir numarası altında istihdam edilebilir doğrudan canlı hücre görüntüleme sağlayan temel unsurdur. Canlı-hücre görüntüleme ek olarak, ipek filmler kolayca th çıkarılabilire kültür sistemi ilave tespit ve analiz için izin vermek. Böylece, bu sistem üzerinde gerçekleştirilebilir doğrudan deney değerlendirmelerinin çok çeşitli teknik alanda birçok ^{3,8,9,12,13,21} için hücre / doku kaynakları, çok çeşitli için de geçerlidir. Time-lapse görüntüleme sonuçlarını gerçek zamanlı kültür veri toplanabilir ve bir örnek yüzey topografisi hücre ilişkileri nasıl etkilediğini göstermek için kullanılmıştır olarak gösteriyoruz. Temsilcisi sonuçları ipek filmi biyomateryaller HCLE kültür büyümeyi desteklemek için kullanılabilir göstermek ve standart hücresel proliferasyonu ve metabolik testler (Şekil 4) bir dizi iyileştirilebilir vardır. Buna ek olarak, kültür sabitlenir ve elektron görüntüleme veya diğer protokolleri (Şekil 3) taranması için işlenir.

İpek Film yüzeylerde yüksek sadakat, tutarlılık ile laboratuarda üretilen ve nispeten düşük maliyetli (Şekil 1). Vardır Bu farklı sa sağlarkültür sistemi kurulumu ve deneysel sonuçlar her iki çıkarak. Bu su-tavlama işlemi çözeltisi içinde ^2,15,22 proteaz konsantrasyonu bekleyen degradasyon oranı tanımlanmış bulunmaktadır kültür içinde stabil bir ipek film malzeme üretir olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, bu maddeler, uzun süreli Hücre kültürü için çok uzun süre için kullanılabilir, ya da fizyolojik yerde ⁸ bağlı olarak ay veya yıldır implante kalır. Ayrıca, son zamanlardaki araştırmalar protein yapısı ve su-tavlanmış ipek filmlerin iki yığın malzeme özellikleri çeşitli mekanik ve biofiziksel test yöntemleri ^15,16 vasıtasıyla gösterildiği gibi tekrarlanabilir kültürü sonuçlar için izin parti için tutarlı olduğunu göstermektedir. ^7,23,24 SEM, atomik kuvvet micrscopy (AFM) ve hücre kültürü çalışmaları {: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray 2011kq Lawrence} gösterilen Buna ek olarak, malzemenin yüzey filmi gruplar arasında büyük vefa göstermiştir. Malzeme stabilSığ ve tutarlılık hücrenin çeşitli mechanotransduction yolları aracılığıyla kültür substrat algılayan ve sonuçta istenmeyen / istenen hücresel yanıt ^25,26 üretecek nasıl önemli bir faktördür.

Bu tür doku kültürü tedavi plastik veya cam gibi kültür yüzeyler için tarihsel standartlara, hücre eki için yeterli ortamlar sağlarlar. Bununla birlikte, bu malzemelerin in vivo olarak daha faydalı için iyileştirilebilir değildir. Bu bir ipek filmin biyomateryal in vitro özelleştirilmiş olabilir, ve bir kez deneysel beklentiler özelleştirilmiş filmin doğrudan vivo modelde bir tercüme edilebilir ulaşıldığını da tasavvur edilebilir. Vivo ve in vitro deneylerin arasında böyle eşleştirilmiş tasarım rutin in vitro kullanılan diğer zeminler üzerine böyle bir gömülebilir ipek biyomateryaller için büyük bir avantaj sunuyor.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası
İpek kozaları	Tajima Shoji A.Ş., LTD.	NA
PDMS monomer ve çapraz-bağlayıcı	Momentive	RTV615A 01P
Sodyum Karbonat	Sigma	S2127
Lityum Bromür	Sigma	213225
Slide-A-Lyzer	Thermo Scientific	66110
1 ml Şırınga	Becton-Dickenson	309602
Paslanmaz çelik yıkama	Üstün Yıkama	81610
24-kuyulu plakalı	VWR	353047