위한 실크 영화 문화 시스템 체외에서 분석 및 Biomaterial 디자인

요약

실크 필름은 생물 의학 응용 프로그램의 배열에 대해 쉽게 사용자 지정 biomaterials의 소설 클래스입니다. 제시 실크 영화 문화 시스템의 다양한 고도의 적응 체외에서 분석합니다. 이 시스템은 biomaterial 디자인 플랫폼 제공을 나타냅니다 체외에서 최적화 생체내에서 모델.

초록

실크 필름 연구 실험실 환경 ^1,2 내에서 높은 충실도 및 경제적으로 조작 할 수있는 단백질 기반 biomaterials을 약속하고 있습니다. 그들은 고도로 제어 치수 및 재료 특성을 가진 세포 접착력을 biocompatible하고 촉진하기 때문에 이러한 자료는 바람직한 있으며, 지형 patterning이나 화학적으로 표면을 변경하여 수정할 수 있으며, 약물 전달 관련 어플 리케이션을위한 생물 학적 활성 분자를위한 기지로 사용할 수 ^3-8. 또한, 실크 필름 분 이내에 용해 또는 시험 관내 또는 생체내에서 년간 저하될 수 있도록 설계 수 있으며, 사용자 정의 디자인 비교적 간단하며, 자연의 투명 및 이미징 어플 리케이션 ⁹ 그러므로 매우 적합한되는 추가 혜택과 함께 생산하고 있습니다 ^{- 13.} 여기에 제시된 문화 시스템 방법론 셀 실크 필름 표면의 신속한 평가를위한 확장 가능한 접근 방법을 나타냅니다상호 작용. 특히 관심이 정렬 ^12,14 대한 세포 증식과 세포의 반응의 차이를 공부하는 표면 패턴 실크 필름의 사용입니다. 씨앗을 품고 문화는 마이크로 패턴과 평면 실크 필름 기판 모두에서 배양해 후 시간 경과 위상 대조 영상, 전자 현미경을 검색하고, 신진 대사 활동과 핵산 내용의 생화 학적 평가를 통해 평가되었다. 요약에서 체외 배양 시스템의 실크 필름 그러면 생체내 모델에 최적화된 다음으로 번역될 수 biomaterial 기판의 셀 - 표면 상호 작용의 연구에 적합한 맞춤형 실험적인 설정을 제공합니다. 여기에 제시된 문화 시스템을 사용하여 관찰은 현재 기본적인 세포 상호 작용으로부터 의료 기기 디자인에 이르기까지 다양한 어플 리케이션에 투입하는 데 사용되고, 따라서 생명 의학 분야의 광범위한 관련성이있다.

프로토콜

1. 실리콘 고무 금형 제작

1. 캐스팅에 대한 원하는 지형 표면을 제작하거나 구입할 수 있습니다. 본 출판물의 경우 표준 100mm 에칭처리된 실리콘 웨이퍼는 (그림 1) 설명됩니다.
2. polydimethylsiloxane (PDMS) potting (구성 요소)과 구입한 키트에 제공된 등 1시 9분 비율 (9g potting와 1g 촉매)의 촉매 (부품 B) 솔루션을 달다.
3. 경화 과정을 시작하기 위해 철저하게 솔루션을 섞는다.
4. 주조 요리 이내 플레이스 실리콘 웨이퍼 표면.
5. 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS 용액은 4.5 g을 달다.
6. 확산 PDMS 용액 웨이퍼 표면의 100 밀리미터 직경의 영역을 커버하는 등.
7. 고르게 PDMS 솔루션을 확산하기 위해 웨이퍼를 기울이십시오.
8. 100mm 직경 페트리 접시의 뚜껑으로 웨이퍼를 커버.
9. 장소는 경화가 평평한 표면에 일어나는 것을 확신하고, 60 박 이상 ° C 오븐에 설치를 주조.
10. 장소는 70 % 에탄올로 PDMS / 실리콘 웨이퍼를 치료제거하기 전에 목욕.
11. 첫번째 에지 (전체 둘레)를 올려 면도날을 사용하여 웨이퍼에서 PDMS를 제거 시작합니다.
12. 부드럽게 실리콘 고무 주조 찢어하지 않도록주의되는 70 % 에탄올 욕조 안에 집게를 사용하여 해제 PDMS를 당겨.
13. 14mm의 구멍 펀치를 사용하여 개별 PDMS 금형 밖으로 펀치. 이것은 지름이 24-잘 플레이트 설치에 적합하도록 설계되었습니다.

2. 실크 솔루션 제작

1. 유리 비커 ^{7 ~} 종기에 증류수 (DH ₂ O) 2 패를 가져와.
2. 3 가지로 Bombyx 모리 누에 누에를 5 G를 자르고.
3. 과도한 곤충 입자 코팅 내부 누에고치 표면에 표시된대로 광범위하게 오염된 고치 밖으로 배출.
4. 나트륨 탄산염의 4.24 g을 측정합니다.
5. 물이 끓어을 방지하기 위해 DH ₂ O 볼륨을 끓고에 느리게 나트륨 탄산을 추가하고, 계속하기 전에 완전한 해체를 허용합니다.
6. 끓는 DH로 누에고치 조각 추가 _{을 2 40 분., 그리고 끓는 과정에서 고치로 휘몰아 테플론 코팅 볶음 막대를 사용을위한 O,.}
7. 끓는 후 신중하게 과잉 수분을 제거하기 위해 손으로 실크 추출물 밖으로 싱크 및 링으로 DH ₂ O 드레인.
8. 실크는 20 분 동안 세 번 추출 씻으십시오. 실험실 비이커에 DH ₂ O 1 L 각, 그리고 비커 내에서 볼륨을 유포하는 볶음 막대를 사용합니다.
9. 화학 후드 내부에 손을과 장소 실크 섬유 추출물로 실크 추출물 밖, 반지를 세척 후 12 시간 동안 건조를 허용합니다. 기간.
10. 다음날, 일반적으로 ~ 3.5 g입니다 말린 실크 섬유, 무게 : ___________-G
11. 실크의 20 % W / V 솔루션을 위해 9.3 M의 LiBr 용액을 준비한다. 필요한 무게와 볼륨을 계산하는 다음과 같은 방정식을 활용 :
    1. (10 단계에서 실크 추출물 무게) × (4) = 총 9.3 M LiBr 솔루션의 ___________-ML
    2. [(807.705) x는 (일부 11.a에서 LiBr 볼륨)] / 1000 = LiBr의 ___________ g DH ₂ O에 추가
12. 다음 DH ₂ O 볼륨의 유리 비커에 측정 LiBr 무게를 추가 :
    1. (0.8) × (11.a 단계에서 계산된 부피) = ___________ DH의 ML ₂ O
13. 실린더 졸업 적절한 규모로이 솔루션을 붓고, 그리고 일부 11.a. 계산으로 최종 볼륨 솔루션을 기르다
14. 비커에 실크 추출물을 넣은 실크 섬유 실험실 주걱을 사용하여 LiBr 용액 안에 포장되어 있는지 만드는 실크 섬유를 통해 LiBr 용액을 붓는다.
15. 60로 해산 실크를 놓고 ° 4 시간을위한 C 오븐 :
    시작 시간 : ___________
    시간 종료 : ___________
16. 적절한 크기의 주사기를 사용하여 실크 솔루션 12 ML을 그립니다. 주사기 끝에 18G 바늘을 놓고 다음 투석 casette (3,500 MW의 coutoff, 슬라이드-A-Lyzer, 써모 과학)에 솔루션을 주입. 카세트를 작성 후, 비어 주사기와 카세트의 여지없이 남아있는 공기를 그립니다.
17. 장소 좋DH ₂ O. 1 패 이내 카이로 투석 카세트
18. 1 시간, 4 시간, 8 시간 후 6 변화의 총 3 배 매 12 시간 후에 DH ₂ O 볼륨을 변경 :
    1. 시작 : ___________
    2. 1 시간 : ___________
    3. 4hr : ___________
    4. 8 시간 : ___________
    5. 12 시간 : ___________
    6. 12 시간 : ___________
    7. 12 시간 : ___________
    8. 끝 : ___________
19. 투석 후, 천천히 주사기와 카세트에서 실크 솔루션을 수집합니다. 1만그램 정격 원심 튜브에 플레이스 솔루션입니다.
20. 20 분 각각에 대해 4 ° C에서 1만그램에서 두 솔루션을 원심 분리기. 새로운 튜브에 각각의 원심 분리 플레이스 뜨는 후에.
21. 4 ° C의 냉장고에 저장 thr 실크 솔루션입니다.
22. 작은 무게 요리, 장소에 0.5 ML 실크 솔루션의 피펫이 샘플 안에 요리를 달다 60 ° 12 시간이나 실크 솔루션 마른까지 C 건조 오븐.
23. 봇으로부터 남은 고체 실크 필름을 달다H는 샘플 볼륨 단백질 농도에 실크 솔루션 %의 무게를 측정하기 :
    1. ___________ MG : 결합된 두 실크 필름 샘플의 무게
    2. (23.a의 무게) × (100) = ___________ % 실크

3. 실크 영화 문화 시스템 설치의 준비

1. 먼지를 제거하려면 투명 테이프로 세척하여 PDMS 주조 표면을 준비합니다.
2. 클린 PDMS 70 % EtOH에 몸을 담글하여 기판과 DH ₂ O.로 세 번 씻어
3. 일반적으로 24도 플레이트 뚜껑입니다 홀더 플레이트, 고정 장소 14mm PDMS 금형합니다.
4. 50 μm의 두께의 필름을 생산하기 위해 일반적으로 1 ML 주사기 팁 ² 액상 확산 도구를 사용하여 PDMS 금형에 8 % 실크 솔루션의 70 μls 뿌리 더군요.
5. 90 분 동안이나 필름까지 150 파의 공기 흐름의 압력을 실행 클린 벤치에 덮개가 마르도록 실크 필름을 허용은 말라있을 수가 있죠.
6. 일단 영화는 건조한 장소는 PDMS m를 포함하여 필름의 집합 전체가어린이, 물 불용성 필름을 생산하기> 4 시간을위한 물 어닐링 챔버로. 이것은 일반적으로 25 kPa 진공 ¹⁵ 가져온 분지의 바닥에 물을 빈 건조기 챔버입니다.
7. 실크 필름 깨끗한 벤치를 향해 물 어닐링 챔버와 장소에서 제거합니다.
8. 멸균을 위해 최소 10 분 동안 우물 안에 70 %의 35mm 배양 접시 내에서 EtOH 욕조, 장소 제어 기판 (예 : 유리 또는 플라스틱 표면)과 스테인레스 스틸 고리를 준비합니다.
9. 집게를 사용하여 PDMS 금형에서 실크 필름을 제거, 70 % EtOH로 그들을 찍어, 그리고 확실 패턴 측면을 만들고 70 % EtOH 1 ML과 prefilled 24 잘 플레이트로 대신 샘플은 세포 접착을 허용하도록 직면하고있다.
10. 위에 해당 잘 곳에 스테인레스 스틸 링 가중치 (11.65 mm 내경, 15.45 mm 외경 및 1.18 밀리미터 두께)로 각 실크 필름 샘플을 배치 후에.
11. 고리가있는 샘플 불임을 보장하는 10 분 동안 품어하도록 허용합니다.
12. RemoEtOH이 있어요 그리고 PBS 1 ML과 3 배 각각의 샘플을 씻는다. 각 세차가 완료 보급을 할 수 있도록 5 분 동안 앉아 보자.
13. 실크 필름 샘플을 아래에 거품의 대부분을 제거해야하는 반면, aspirating 유리 피펫을 사용하여 PBS를 제거합니다.
14. 시딩 위해 세포주를 준비합니다. 예를 들어, 7 분 0.25 %의 트립신과 ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 솔루션으로 인간 각막-limbal 상피 (HCLE) 세포 라인을 trypsinize. 트립신 10 % FBS와 Dulbecco의 수정된 독수리 중간 (DMEM) 통과 미디어의 1시 1분 볼륨을 사용하여 비활성화가 추가되었습니다. trypsinized HCLE 세포를 원심 분리기, 세포 펠렛에 keratinocyte-혈청 무료 미디어의 8-ML (K-SFM)을 추가 부드럽게 HCLEs을 분산하기 위해 활발히 논의하고, 셀 카운트를 생성합니다.
15. 물론 일반적으로 만 셀 / ^㎝에게이 밀도를 사용하여 당 HCLE 정지 시료 500 μL.
16. 37 인큐베이터 내에서 플레이스 문화 ° C에서 5 % CO _2, 원하는 실험 프로토콜을 실행합니다.

4. 대표 결과

비단 영화 제작과 문화 시스템 준비 요약을 보여주는 그림 1. 흐름 차트는 10 단계 프로세스.

그림 2. 표준 photolithographic 및 건식 에칭 기법을 채용 90 밀리미터 직경의 실리콘 웨이퍼에 따라 생산 패턴 라인 표면 topographies의 () 21 - 염료 배열입니다. (B) 실크 필름 PDMS 성형 표면에 주조 후 원래 평행선 패턴 기능을 유지합니다. (C) 도식 보여주는 기능 크기 디자인은 세포 정렬을 추진하기로. 유지 병렬 줄지어 패턴 표면을 보여주는 실크 필름 (D) 크로스 섹션.

그림 3. () 패턴을 지키는 HCLE 세포주의 전자 micrographs 스캐닝그리고 (b) 문화 일 2시 플랫 실크 필름. HCLE 문화는 문화 일 8 시까지 (C) 패턴 및 (D) 평평한 표면에 합류에 분아 따위에 의해 중식 것을 계속한다.

그림 4. (A, D, G) 패턴 그리고 (교류) 제 1 일 (DF) 4 일에서 비교적에 (B, E, H) 평면 실크 영화 문화 HCLE 세포 (C, F, I) 유리 제어 기판, 문화 및 (GI) 하루 8. (J) CyQuant 핵산 컨텐츠 (K) (3 - 패턴과 평면 실크 필름 기판에서 모두 HCLE 생존을 보여주는 (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium 브로마이드 (MTT) 대사 활동 분석 데이터 시간의 경과에 유리 제어 표면 (스케일 바는 = 100 μm의)와 비교했을 때.

동영상 1. 18 시간 동안 패턴 실크 필름 표면 위에 이주 HCLE 세포의 저속 위상 대조 영상. 기간. 세포 ^10k/cm이 밀도에 놓는와 2 시간 동안 배양해되었습니다. 이미징 전에. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

비디오 2. 18 시간 동안 평면 TCP 제어 표면을 통해 이주 HCLE 세포의 저속 위상 대조 영상. 기간. 세포 ^10k/cm이 밀도에 놓는와 2 시간 동안 배양해되었다. 이미징 전에. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

세포 배양을위한 기판과 같은 재생 실크 필름의 사용은이 단백질의 재료 특성의 광범위한 특성으로 인해 지난 20 년 동안 인기를 얻고 있으며 biomaterial 유틸리티 ^3,8의 이해를 증가하고있다. 여기에 설명된 문화 제도는 꽃무늬 실크 필름 biomaterial 기판 ⁷ 세포 표면 상호 작용을 평가하기위한 체외 테스트 시스템의 소설을 나타냅니다. 시스템은 쉽게 높은 처리량 데이터 수집을 위해 채택 수 시간에 따른 세포의 상호 작용 심층 분석을 허용합니다. 공유 결합 수정이나 흡착을 통해 다양한 표면 화학, 표면 제어 마이크로 / 나노 표면 지형 ⁷ : 실크 필름을 포함하여 직접적으로 세포 기능 ^{8,9,12 영향을} 수정할 수있는 조정할 수 biomaterial 속성의 번호를 가지고 있기 때문에 이것은 크게 활성화되어 강력한 mech, 생물학적으로 활성 분자 ¹³anical 등록 ^15,16; 재료 친수성 / 소수성 ¹⁶ 제어, 릴리스 ^4,8,17에 대한 생물 학적 화합물의 대량 로딩 및 이차 구조의 제어를 통해 제어 해산 / 효소 저하 속도 (베타 시트 콘텐츠) ^11,18,19 .

실크 필름의 투명성은 수증기 ^7,15의 앞에서 진공 하에서 일정 기간 동안 영화를 어닐링을 통해 이루어진다. 이러한 처리 방식은 빛의 ¹⁵ 최소한의 회절을 허용하면서 물에 소재의 불용성을 육성, β-시트 이차 구조의 형성을 허용합니다. 영화의 이러한 투명성은 현미경 시스템 ^12,20의 번호를 사용하여 이미징 modalities (즉, 넓은 필드와 형광)의 수를 아래 고용 수있는 직접 라이브 세포 이미징을 활성화의 열쇠입니다. 라이브 세포 이미징 외에도 실크 필름은 쉽게 번째에서 제거할 수 있습니다전자 문화 시스템은 추가적인 고정 및 분석을 허용합니다. 따라서이 시스템에서 수행할 수있는 직접적인 실험적 평가 넓은 다양한 많은 기술 분야 ^{3,8,9,12,13,21} 대한 세포 / 조직 소스의 다양한 적용됩니다. 시간 경과 영상 결과는 실시간 문화 데이터가 수집될 수 있고, 예제 표면 지형은 세포 상호 작용에 어떻게 영향을 미치는지를 설명하기 위해 이용 하였다대로 방법을 보여줍니다. 대표적인 결과는 비단 영화 biomaterials가 HCLE 문화의 성장을 지원하기 위해 활용할 수있는 방법을 보여줍니다 및 표준 세포 증식과 신진 대사 assays (그림 4)의 개수에 수정할 수있는 있습니다. 또한, 문화가 고정되며 전자 영상 또는 기타 프로토콜 (그림 3) 스캔을위한 처리.

실크 필름 기판은 높은 충성심, 일관성있는 실험실에서 생산하고, 상대적으로 저렴한 비용으로 (그림 1). 있습니다 이것은 reproduci 수문화 시스템 설정 및 실험 결과 모두에서 bility. 그것은 물 어닐링 처리 솔루션 ^2,15,22의 프로 테아제의 농도 보류 저하 속도를 정의했습니다 문화 내에서 안정적인 실크 필름 소재를 생산하는 입증되었습니다. 결과적으로 이러한 자료는 장기 세포 배양을위한 장시간 동안 사용할 수있다, 또는 생리 위치에 따라 ⁸ 개월 또는 수년 동안 심어 유지합니다. 또한, 최근 작품은 단백질 구조와 물 annealed 실크 필름의 재질 특성이 모두 일괄 처리에서 각종 기계 및 biophysical 테스트 방법 ^15,16 통해 그림과 같이 재현할 문화 결과에 대해 허용하는 배치에 일관성이있는 것으로 나타났습니다. ^7,23,24 SEM, 원자 힘 micrscopy (AFM) 및 세포 배양 연구 {: 2008wr, Omenetto : 2008tc, 브레이 2011kq 로렌스}로 표시로서뿐만 아니라, 재료의 표면이 필름 일괄 처리간에 큰 정절을 보이지 않고있다. 자재 stability 및 일관성은 세포가 다양한 mechanotransduction 경로를 통해 문화 기판을 감지하고, 궁극적으로 바람직하지 / 원하는 세포 반응 ^{25,26를 산출하는} 방법에 중요한 요소이다.

이러한 조직 문화를 치료 플라스틱이나 유리와 같은 문화 기판에 대한 역사적인 기준은, 세포 부착을 위해 적절한 기판을 제공합니다. 그러나 이러한 자료는 생체내의 추가 유틸리티에 대해 수정할 수있는 수 없습니다. 그것은 비단 영화 biomaterial은 체외로 사용자 정의할 수있는, 그리고 한번 실험적인 기대가 맞춤형 필름을 직접 생체내 모델로 번역될 수 달성되었다고 상상하실 수 있습니다. 시험 관내 및 생체내 실험에서 간의 이러한 이점 디자인은 정기적으로 체외에서 사용되는 다른 기판 위에 같은 implantable 실크 biomaterials에게 큰 이점을 제공합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
자재 명칭	회사	카탈로그 번호
실크 누에를	다지마 쇼지 주식 회사.	NA
PDMS 단량체 및 가교제	Momentive	RTV615A 01P
나트륨 탄산염	시그마	S2127
리튬 브로마이드	시그마	213,225
슬라이드-A-Lyzer	써모 과학	66,110
한 ML의 주사기	Becton-Dickenson	309,602
스테인레스 스틸 와셔	우수한 와셔	81,610
24 잘 플레이트	VWR	353,047