Kuyruk Süspansiyon Testi

Özet

Tail-süspansiyon test farelerde antidepresan ilaç tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için deneysel bir prosedür olarak onaylanmıştır. Fareler altı dakika için onların kuyrukları tarafından askıya alınır ve kaçış ilgili davranışlar değerlendirilmektedir. Biz kuyruk süspansiyon test yürütülmesinde kullanılan yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Tail-süspansiyon test tarama potansiyel antidepresan ilaçlar yararlı bir fare davranış testi ve depresyon ile ilgili davranışlarını etkilemesi beklenmektedir diğer manipülasyonlar değerlendirilmesi. Fareler kaçmak ya da yakındaki yüzeylere tutmayın ki böyle bir konumda, teyp onların kuyrukları tarafından askıya alınır. Bu test sırasında, tipik olarak altı dakika süre içinde ortaya çıkan kaçış yönelik davranışları sayısal vardır. Tail-süspansiyon test ilaç keşfi prospektif antidepresan bileşiklerinin yüksek verimli tarama için değerli bir araçtır. Burada, biz, ortaya çıkabilir ve bunları önlemek için nasıl potansiyel sorunlar hakkında ek vurgu ile bu testin uygulanması için gerekli ayrıntılar anlatılmaktadır. Biz de yaygın olarak kullanılan C57BL / 6 gibi kuyruk tırmanma davranışına bir çözüm, ortak bir sorun, bazı fare suşları bu testi işe yaramaz hale getirir. Özellikle, küçük bir plastik ile fare kuyrukları geçerek kuyruk tırmanma davranışları önlemekönce süspansiyon silindir. Son olarak, ayrıntılarıyla nasıl bu test tecelli davranışları elle puan.

Protokol

1. Malzemeler

1. Süspansiyon Kutusu

Kuyruk süspansiyon testi (TST), fareler onların kuyrukları tarafından yerden askıya içerir. En temel düzeyde, yordam, yalnızca bir süspansiyon çubuğu veya raf çıkıntı ve bant gerektirir. Ancak, deneyci optimum kontrast sağlayan bir arka plan göz önünde bulundurmalıdır. Buna ek olarak, test edilmekte olan diğer hayvanlar gözlemleyerek fareler önlemek için adımlar atması için ihtiyatlı olduğunu. Laboratuarımızda, biz plastik boyutları (yükseklik 55 X 60 genişlik X 11.5 cm derinliğinde) ile özel olarak imal kuyruk süspansiyon kutular (Dört Saat Gün, Baltimore) kullanın. Hayvanların birbirlerini gözlemleyerek ya da etkileşim önlemek amacıyla, her bir fare kendi üç duvarlı dikdörtgen bölmesi (55 yükseklik X genişlik 15 X 11.5 cm derinliğinde) içinde askıya alınır. Fare, bu bölmesinin ortasında askıya genişlik ve derinlik fare işbirliği yapamaz, böylece yeterli büyüklükteduvarları ile ntact. Bu ortamda, yaklaşık fare burun ve cihazın zemin arasındaki mesafe 20-25 cm dir. Az dört fareler bir süre test etmek için bize izin veren cihazın, dört tane aynı bölmeleri vardır. Her fare kuyruğu askıya almak için kullanılan bir alüminyum süspansiyon çubuğu (1 cm yükseklik X 1 cm genişlik x 60 cm uzunluk), kutunun üstüne konumlandırılmış. Bizim laboratuar kullandığımız boyutları genel bir referans olarak kabul edilmelidir. Örneğin, kuyruk süspansiyon kutusu ayrı bölmelere boyutu büyük bir outbred fare türünün (örneğin, CD-1) kullanıldığı takdirde artırılabilir.

Her bölmesinin alt kısmında hayvanların dışkı ya da idrar toplayan çıkarılabilir alüminyum tepsi yerleştirin. Biz albino hayvanlar için bir koyu gri kutu ve diğer kat renk fareler için bir krem ​​renkli kutu kullanabilirsiniz. Bu düzenleme, daha iyi kontrast ve bu nedenle daha güvenilir bir test davranış puanlama verir.

2. Bant

Teyp fare kuyruğu ve süspansiyon çubuğu hem de güvenli bir şekilde yapışır ve fare (örneğin TimeMed Etiketleme Sistemleri, Inc, Burr Ridge, IL, 1.9 cm genişliğinde) denenmektedir ağırlığını taşıyabilecek kadar güçlü olması gerekir. Ancak, kuyruk silinecektir oturumun sonunda bu yana bant, aşırı derecede yapışkan olmamalı. Biz 17 cm bant parçaları kesilmiş ve bir uçtan bir uca bir işareti 2 cm. Kalan fare süspansiyon için kullanılan 15 cm iken, bu 2 cm'lik kısmı, kuyruk bandı takmak için kullanılmıştır.

3. Timer

4. Video kayıt cihazı

Bir video kamera ve tripod (ya da diğer destek yapısı) ihtiyaç vardır. Bu test, genellikle aynı anda test ediliyor birden fazla hayvanlar içerdiğinden, canlı skor zor olacak ve tavsiye edilmez. Video kamera, yüksek kayıtdavranış puanlama için daha sonra kullanılacak olan kaliteli bir resmi işlemek için yeterli çözünürlüğe gh. Her zaman teste başlamadan önce kamera yeterli kayıt hafızası var olduğundan emin olun. Biz videoları basit transferi için izin vererek, fiziksel ortam (yani video kaset) kullanmadan dijital olarak kaydeden bir video kamera kullanın.

5. Beyaz gürültü jeneratör

Gürültü jeneratör aralıklı çevresel sesleri maske gerekir. Potansiyel fareler irkilme olacağını ani yüksek sesler duyulabilir laboratuvar ortamında ve bir gürültü jeneratör kullanımı özellikle tavsiye edilir. Bizim deney odasında ortam gürültü seviyesi (beyaz gürültü jeneratör olmadan aktif), 60 dB civarındadır. TST yapılan yerde aktive beyaz gürültü jeneratör ile toplam ses seviyesi 70-72 dB. Ancak, bu rakamlar sadece örnek olarak verilmiştir olduğunu kaydetti olmalı ve her laboratuar seçmelisiniz, benzersiz bir ortam ve koşullara göre sağ gürültü düzeyleri.

6. Temizleme Ürünleri

Her seanstan sonra süspansiyon kutusu bir sterilizasyon solüsyonu (örneğin MB-10, nükte Laboratories Inc, Wilmington, DE, veya benzeri) ile iyice silinmelidir.

7. Climbstoppers (isteğe bağlı: suşu bağımlı kullanılan)

C57BL / 6 gibi bazı kökenden, ^Fare, 1 test sırasında onların kuyrukları girebilirler . Polikarbonat tüp dört cm uzunluğunda (Baltimore FourHourDay Inc) (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs kesilir Clear delikli silindir (4 cm uzunluğunda, dış çapı 1.6 cm, iç çapı 1,3 cm, 1,5 gram) , CA) davranış ^2,3 tırmanma gibi kuyruk önlemek farelerin kuyruklarını etrafına yerleştirilir. Bu cihazlar ortak araçları ve malzemeleri ile, herhangi bir laboratuvar yapılabilir.

2. Davranış Usulleri

Genel deneysel tasarım denemenize özgü değişkenler arasındaki uygun dengeleyici yansıtmalıdır. Örneğin, bizim deneylerde eşit her TST oturumu (yani, dört tedavi grubu varsa, her oturumda temsil edilecektir) her bir grubu temsil etmek için çalışıyoruz. Ayrıca, farelerin pozisyonları her tedavi grubundaki fareler Her oturumda farklı bir konumda yerleştirilmiş böyle bir şekilde döndürülebilir.

1. Pozisyonda kamera yerleştirin. Kamera hayvanların mümkün olan en yüksek çözünürlük elde etmek için mümkün olduğunca yakın olmalıdır.
2. Oturum sırasında kullanılacak Teyp parçaları, kesme işaretli, ve oturumu için hazırlanmış olmalıdır.
3. Kullanılan fareler, test odası tanıtıldı önce, beyaz gürültü jeneratörü çalıştırmak. Beyaz gürültü seviyesi sadece dış gürültüleri maskelemek için yeterli olacaktır. Yüksek ses kaçının ve beyaz gürültü ile aynı düzeyde, tüm hayvanlar için kullanıldığından emin olun.
4. Bir getirintest odasına imals. Hayvanların bulunduğu oda ve test odasına benzer ortam koşulları ile birbirine bitişik olan, hiçbir aklimasyonundan süre gerekli olabilir. Aksi takdirde, aklimasyonundan bir süre (genellikle en az bir saat) için test odası, hayvanları yerleştirin. Aynı odada bulunan diğer hayvanlar, koku alma ve ultrasonik ipuçları anlamda farkında olun.
5. C57BL6 / J gibi kuyrukları, tırmanmak için bilinen bir gerilme, bant uygulamadan önce kuyrukları etrafında yer Climbstoppers kullanılıyor ise.
6. Farelerin kuyruklarını bant uyun. Bant işaretli ucunu kullanın ve bant, kuyruk ve kendi üzerinde geri yapışıyor emin olun. Teyp bandı dışında kalan 2-3 milimetre kuyruk kuyruk sonuna kadar uygulanmalıdır.
7. Bir kere her parça bant kafesinin iç duvarlarına bandın orta kısmı sopa bir fare kuyruğu bağlı. Bu bant parçaları karışıklığı önlemek birbirlerine yardımcı olacaktır. Not cBu şekilde onfinement strese neden olur ve kısa sürede her bir hayvan için bant uygulama sürecini tamamlamak için önemlidir.
8. Tüm bant uygulandıktan sonra, kayıt başlangıç ​​ve fareler askıya önce oturum tanımlamak.
9. Tedavi grupları arasında dengeli bir düzen süspansiyon çubuğu ya da rafa bant serbest ucunu koyarak hayvanlar askıya alınması. Fareler tüm TST oturumu attı ve bu süre içinde davranışlarını değerlendirmek için kamera yetersizlik yol açacaktır tıkayan olacak çünkü kamera görüntüsü engellemez bir şekilde askıya alınması. Tüm bant biter, her bir fare için bolluk benzer bir uzunluğu ile paralel süspansiyon çubuğu ya da rafa asılı olduğunu kontrol edin.
10. (Bunlar normalde altı dakika) oturum sonunda, kendi homecage hayvanlar dönün ve dikkatli bir şekilde hafifçe çekerek her kuyruk bandı çıkarın. Bunu yaparken mikrofon ağrıya neden olabilir bu yana kuyruk bandı rip etmeyine.
11. Farelerin onların koloni odasına döndükten sonra, dışkı boli ve idrar toplama kasetlerden atmak ve cihazın sterilizasyon solüsyonu ile silin.

3. Davranış Analizi

1. Genellikle, TST, altı dakika uzunluğunda baştan sona. Yaygın olarak kullanılan başka bir antidepresan etkinliği prosedürü aksine, zorla yüzmeye testi, tüm oturum atılırsa. Bu fareler daha önce tezahür hareketsizlik TST eğiliminde olduğunu bulma genel kaynaklanmaktadır.
2. Laboratuarımızda kameradan analiz yürütülen bir PC'ye doğrudan video dosyalarını yüklemek.
3. Davranış analizi sırasında cep ölçülen her bir fare harcadığı zaman. Hareketsizlik zaman doğrudan ölçmek mümkün iken, biz daha kolay yerine bu tür hareketlerin olmaması çok aktif hareketleri algılamak ve ölçmek için bulduk.
4. TST davranış analizinin en önemli yönü hareketin tutarlı bir kimlikiyi niyetli bir hareketlilik olarak kaydedilmektedir var. Fareler özellikle oturumun başında, açıkça kaçmak ilgili tezahür davranışları. Bunlar, aparatın duvarlar ve süspansiyon çubuğu, vücudun güçlü sallayarak, ve çalıştıran benzeyen bacaklarda hareket ulaşmaya çalışıyorum. Bu hareketler açıkça hareketlilik oluşturmaktadır. Ve daha sonra bu davranışları azalır ince haline gelmiştir. Ön ayakları ile sınırlı ama arka ayakları katılımı olmadan hareketlilik olarak sayılmaz laboratuvar küçük hareketler. Ayrıca, momentum nedeniyle salıncaklar gibi salınımlar ve sarkaç önceki hareketlilik nöbetleri sırasında elde edilen hareketlilik de sayılmaz.
5. Laboratuarımızda zaman ölçümleri için ekrandaki kronometre yazılım (XNote Kronometre, dnSoft Araştırma Grubu) kullanın. İki ayrı stopwatches ekranda kullanılır. Davranışsal analiz dönemi ne zaman sona erer ilk kronometre 360 ​​saniye ve uyarılar gözlemci sayar. Ikinci stozaman cep geçirdi gözlemci önlemler pwatch kontrollü. Bazı kronometre yazılım ekranda klavye kronometre kontrolü, böylece işlevleri başlatmak ve durdurmak için tuşlar atamak için yeteneğine sahiptir. Düzenli bir klavye yerine, yaygın stopwatches kontrol etmek için bir 'gamepad' olarak bilinen bir giriş aygıtı kullanın.
6. Ekranda test edilmiş ve mevcut birden fazla fare var ise, onların hareketleri gözlemcinin dikkatini dağıtmak, böylece diğer hayvanlar karşılamak için iyi bir fikirdir. Bu, başka bir program penceresini kullanarak veya fiziksel kağıt ile ekranda, diğer farelerin kapsayan tarafından gerçekleştirilebilir.
7. Hareketliliği süresi toplam tutarı belli bir fare için geçen analiz oturumun tamamlanmasından önce görünür olması durumunda meydana gelen bazı ön yargılar olabilir. Bir ekran kronometre kullanılması durumunda, tüm ama kronometre milisaniye ondalık kapsayacak şekilde öneririz. Kronometre kapsayan gözlemci sadece kronometre olup olmadığını biliyorancak açık veya kapalı herhangi bir noktada toplam süre herhangi bir önyargı ile geçen ve bu nedenle etkilenmiş olamaz bilmiyor. Bu yaklaşım gözlemci kullanarak, hayvanların grubu atamaları kör, her hayvan hareketlilik düzeyi hakkında genel bir fikir olmaz.
8. Bir gözlemciler arası güvenilirlik testi, test hayvanlardan elde edilen verileri toplamak için başlamadan önce her yeni gözlemci için yapılmalıdır. O puanlama ise Laboratuarımızda her yeni gözlemci ilk deneyimli bir gözlemci izler. Yeni gözlemcilerin hareketsizlik hareketliliği ayırt etmek için yeterli güvenini kazanmak sonra, daha sonra deneyimli bir gözlemci izliyor ve herhangi bir hata işaret ederek gerçek zamanlı olarak puan. Bu aşamada başarılı bir şekilde tamamlandıktan sonra, yeni gözlemci, eğitim amaçlı Laboratuvarımızda korumak TST videolar belirli bir analiz edecektir. Gözlemciler arası korelasyon yüksek düzeyde deneyimli gözlemci ile elde edilir sonra gerçek bir araştırmacı TST videos analizdeneyler. Biz arşiv, laboratuvar için bir iç standart teşkil edecek bu eğitim analizleri veri. Biz (ve hareket) davranışları hareketliliği ifade ve cinsiyetler arasındaki süre hareketsizlik anlamına hangi şekilde suşları arasındaki farklılıklar gözlemledik. Zorlanma, cinsiyet, ya da genetik olarak değiştirilmiş yeni bir fare modeli laboratuvarda test edildiğinde tekrar bu tür güvenirlik analizi gerçekleştirilmesi için gerekli.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Biz çeşitli fare suşları lityum tedavisi (Şekil 1) ³ antidepresan gibi yanıtları değerlendirmek için TST kullandık. Bu deneyde deneysel ayrıntıları Can ve ark, 2011 ³ yayınlanır.

Şekil 1 kendilenmiş beş fare suşlarının kronik lityum verildikten sonra kuyruk süspansiyon test Hareketsizlik zaman. Fare grup ev vardıd kafes başına dört fare. Fare lityum tedavi grubunda lityum chow üç hafta 4 gr / kg LiCl içeren aldı. Hayvanları kontrol lityum klorür olmadan aynı gıda aldı. **: P <0.01, ***: p <0.001 anlamlı, eşleştirilmemiş t-testi belirtmek. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir. n :10-12 grup başına hayvanların her bir suş için. (Şekil ³ çoğaltılamaz).

Bu örnekte, sadece C57BL/6J ve DBA/2J suşları gıda teslim kronik lityum önemli bir tedavi etkisi görülmektedir. Diğer üç suşları, hareketsizlik sürede istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gözlendi. Bu veriler, aynı zamanda diğer ^antidepresan ilaçlar 4-8 gözlenmiştir kronik lityum tedavisinin antidepresan gibi tepki bağlı zorlanma olduğunu göstermektedir.

Tartışmalar

Steru ark TST Kalkınma ⁹ daha önce geliştirilen zorla yüzmeye testi ^10-12 etkilenmiştir. TST farelerde zorla yüzmeye testi, kaçınılmaz ama orta derecede stresli bir durumda yerleştirilir. Eksikliği, hareketsizlik kaçış ilgili davranış olarak kabul edilir. Zorunlu yüzme testi gibi, TST, antidepresan ilaçların etkinliğinin değerlendirilmesi için en iyi valide test, ancak, aynı zamanda çevresel, nörobiyolojik ^ve genetik manipülasyonlar 13-18 etkilerini de?...

Malzemeler