Le test de suspension caudale

Résumé

Le test de suspension arrière est validé comme une procédure expérimentale pour évaluer l'efficacité antidépressive des traitements médicamenteux chez la souris. Les souris sont suspendues par la queue pendant six minutes et échapper à des comportements liés sont évalués. Nous décrivons les procédures utilisées pour effectuer le test de suspension arrière.

Résumé

Le test de la queue-suspension est un test de la souris comportementales utiles dans le dépistage des potentiels des médicaments antidépresseurs, et d'évaluer d'autres manipulations que l'on s'attend à affecter les comportements de dépression liées. Les souris sont suspendues par la queue avec du ruban adhésif, dans une telle position qu'il ne peut pas s'échapper ou s'accrocher à des surfaces à proximité. Pendant cet essai, généralement de six minutes dans la durée, le comportements de fuite résultant orientés sont quantifiées. Le test de la queue-suspension est un outil précieux dans la découverte de médicaments pour le criblage à haut débit des futurs composés antidépresseurs. Ici, nous décrivons les détails nécessaires pour la mise en œuvre de ce test avec un accent supplémentaire sur les problèmes potentiels qui peuvent survenir et comment les éviter. Nous offrons également une solution à la queue du comportement d'escalade, un problème commun qui rend ce test inutile dans certaines souches de souris, comme le très utilisé C57BL / 6. Plus précisément, nous empêchons la queue des comportements d'escalade en passant la souris queues à travers un petit plastiquecylindre avant la suspension. Enfin, nous détaillons comment manuellement score de comportements qui se manifestent dans ce test.

Protocole

1. Matériaux

1. Boîte Suspension

Le test de suspension arrière (TST) implique la suspension de souris au-dessus du sol par leurs queues. Au niveau le plus élémentaire, la procédure exige seulement une barre de suspension ou un rebord étagère, et du ruban adhésif. Toutefois, l'expérimentateur devrait envisager l'utilisation d'un fond qui fournit un contraste optimal. De plus, il est prudent de prendre des mesures pour empêcher les souris d'observer d'autres animaux qui sont actuellement testées. Dans notre laboratoire, nous utilisons spécialement fabriqués boîtes de suspension arrière (quatre heures par jour, Baltimore MD), faits de plastique dont les dimensions (55 x hauteur 60 largeur x profondeur 11,5 cm). Afin d'empêcher les animaux d'observer ou d'interagir les uns les autres, chaque souris est suspendu dans ses propres trois murs compartiment rectangulaire (55 x hauteur 15 x largeur x profondeur 11,5 cm). La souris est suspendu au milieu de ce compartiment et de la largeur et la profondeur sont de taille suffisante pour que la souris ne peut pas faire de contact avec les murs. Dans ce cadre, la distance approximative entre le nez de la souris et le plancher appareil est de 20-25 cm. Il ya quatre de ces compartiments identiques dans l'appareil nous permettant de tester quatre souris à la fois. Une barre de suspension en aluminium (1 cm. Hauteur x 1 cm. X largeur 60 cm. Longueur), utilisé pour suspendre la queue de chaque souris est positionné sur le haut de la boîte. Les dimensions que nous utilisons dans notre laboratoire devrait être considéré comme une référence générale. Par exemple, la taille des compartiments individuels de la boîte de queue de suspension peut être augmenté si une souche de souris consanguine grande (ex: CD-1) est utilisé.

Au fond de chaque compartiment on place un plateau en aluminium amovible qui recueille les fèces ou l'urine des animaux. Nous utilisons une boîte de couleur gris foncé pour les animaux albinos et une boîte de couleur crème pour les souris des couleurs de la robe d'autres. Cet arrangement nous donne un meilleur contraste et donc plus fiable score comportemental de l'épreuve.

2. Bande

ruban devrait adhérer fermement à la fois à la souris la queue et la barre de suspension, et être assez solide pour supporter le poids de la souris testée (par exemple des systèmes d'étiquetage TimeMed, Inc, Burr Ridge IL, 1,9 cm de largeur). Cependant, la bande ne doit pas être excessivement collante car à la fin de la session, il sera retiré de la queue. Nous avons coupé 17 cm de ruban de fragments et de placer une marque de 2 cm d'un bout. Cette portion de 2 cm a été utilisé pour fixer le ruban à la queue, tandis que les 15 cm restants a été utilisé pour la suspension de la souris.

3. Minuterie

4. Dispositif d'enregistrement vidéo

Une caméra vidéo et un trépied (ou autre structure de soutien) sont nécessaires. Depuis ce test implique généralement plusieurs animaux testés dans le même temps, le pointage en direct sera difficile et n'est pas conseillé. La caméra vidéo doit consigner dans SalutGH résolution suffisante pour rendre une image de qualité qui seront utilisés plus tard pour la notation des comportements. Assurez-vous toujours qu'il ya suffisamment de mémoire d'enregistrement dans l'appareil avant de commencer le test. Nous utilisons une caméra vidéo qui enregistre numériquement sans l'utilisation de supports physiques (cassette vidéo par exemple), permettant un transfert direct des vidéos.

5. Générateur de bruit blanc

Le générateur de bruit devrait masque intermittentes sons de l'environnement. L'utilisation d'un générateur de bruit est particulièrement recommandé dans les environnements de laboratoire où bruits forts et soudains peuvent être entendues qui pourrait potentiellement effrayer les souris. Dans notre salle expérimentale du niveau de bruit ambiant (sans le générateur de bruit blanc est activé) est d'environ 60 dB. Le niveau sonore total avec le générateur de bruit blanc activé à l'endroit où le TCT est menée est de 70 à 72 dB. Toutefois, il convient de noter que ces chiffres sont fournis à titre d'exemple seulement, et chaque laboratoire doit sélectionner lesniveaux de bruit à droite en fonction de leur environnement unique et des circonstances.

6. Produits de nettoyage

La boîte de suspension doit être essuyée soigneusement après chaque séance avec une solution de stérilisation (par exemple, MB-10, Quip Laboratories Inc, Wilmington, DE, ou similaire).

7. Climbstoppers (facultatif: dépend de souche utilisée)

Souris de certains milieux, tels que C57BL / 6, peuvent monter leur queue lors de l'essai ^1. Effacer cylindres creux (4 cm de longueur, 1,6 cm de diamètre extérieur, 1,3 cm de diamètre intérieur, 1,5 grammes) qui sont coupés à quatre cm de longueur (par FourHourDay Inc, Baltimore MD) à partir de tubes en polycarbonate (# 8585K41, McMaster-Carr, Santa Fe Springs , CA) sont placés autour de la queue des souris pour éviter la queue telle escalade de comportement ^2,3. Ces dispositifs peuvent être faites dans n'importe quel laboratoire avec des outils communs et des matériaux.

2. Procédures comportementales

La conception d'ensemble expérimental devrait refléter les contrepoids adéquat entre variables spécifiques à votre expérience. Par exemple, dans nos expériences, nous essayons de représenter chaque groupe également dans toutes les TCT session (par exemple, si il ya quatre groupes de traitement, chacune sera représentée dans chaque session). En outre, les positions de la souris sont tournés d'une manière telle que les souris de chaque groupe de traitement sont placés dans une position différente dans chaque session.

1. Placez l'appareil en position. La caméra doit être aussi proche que possible afin d'obtenir la meilleure résolution possible des animaux.
2. Fragments de bande qui sera utilisé lors de la session doit être coupé, marqué et préparé pour la session.
3. Démarrez le générateur de bruit blanc, s'il est utilisé, avant que les souris sont introduits à la salle de test. Le niveau de bruit blanc ne doit être suffisante pour masquer les bruits extérieurs. Évitez un volume élevé et s'assurer que le même niveau de bruit blanc est utilisé pour tous les animaux.
4. Apportez la uneimals dans la salle de test. Si la pièce où les animaux vivent et de la salle de test sont adjacents les uns aux autres avec des conditions similaires ambiante, aucune période d'acclimatation peut être nécessaire. Sinon, placez les animaux dans la salle d'essai pour une période d'acclimatation (généralement au moins une heure). Soyez conscient que les autres animaux placés dans la même pièce peut détecter les signaux olfactifs et ultrasoniques.
5. Si une souche connue de grimper leur queue, comme C57BL6 / J, est utilisé Climbstoppers lieu autour de la queue avant d'appliquer le ruban.
6. Respecter la bande à la queue des souris. Utilisez l'extrémité marquée de la cassette et assurez-vous que le ruban colle à la queue et sur lui-même. Le ruban doit être appliqué à la fin de la queue avec 2-3 millimètres de la queue en restant en dehors de la bande.
7. Une fois que chaque morceau de ruban est attaché à un bâton de queue de souris la partie médiane de la bande sur les parois internes de la cage. Cela aidera à prévenir l'emmêlement des pièces de bande à l'autre. Notez que confinement de cette façon peuvent causer du stress et qu'il est important de compléter le processus d'application de la bande à chaque animal dès que possible.
8. Une fois le ruban adhésif est appliqué, de démarrer l'enregistrement et d'identifier la session avant les souris sont suspendues.
9. Suspendre les animaux en plaçant l'extrémité libre du ruban sur la barre de suspension ou d'une étagère dans un ordre qui est contrebalancé entre les groupes de traitement. Suspendre les souris d'une manière qui n'est ne pas obstruer la vue de la caméra, car la session TST entier sera marqué et d'entrave à la caméra va conduire à l'impossibilité d'évaluer les comportements durant cette période. Vérifiez que toutes les extrémités de bande sont suspendus parallèlement à la barre de suspension ou d'une étagère avec une longueur similaire de mou pour chaque souris.
10. A la fin de la session (qui est généralement de six minutes), le retour des animaux à leur homecage et retirez soigneusement la bande de chaque queue en la tirant doucement éteint. Ne pas déchirer le ruban de la queue car cela peut causer des douleurs au microe.
11. Après le retour de la souris dans leur chambre colonie jeter les matières fécales et l'urine boli de la collecte des bacs et essuyez l'appareil avec une solution de stérilisation.

3. Behavior Analysis

1. Généralement, le TST est d'un bout à six minutes dans la longueur. Contrairement à une autre procédure efficacité antidépressive largement utilisé, le test de la nage forcée, toute la session est marqué. Cela est dû à l'constat général que les souris ont tendance à l'immobilisme manifeste plus tôt dans la TST.
2. Dans notre laboratoire, nous avons télécharger les fichiers vidéo directement depuis l'appareil à un PC où l'analyse est menée.
3. Lors de l'analyse comportementale temps que chaque souris passe aussi mobiles est mesurée. Bien qu'il soit possible de mesurer le temps d'immobilité directement, nous avons trouvé plus facile de détecter et de mesurer les mouvements actifs plutôt que de l'absence de tels mouvements.
4. L'aspect le plus important de l'analyse comportementale TST est l'identification cohérente des mouvementss qui sont enregistrées comme la mobilité de bonne foi. Souris, surtout au début de la session, les comportements manifestes qui sont manifestement liés échapper. Il s'agit notamment de tenter d'atteindre les parois de l'appareil et la barre de suspension, de fortes secousses du corps, et le mouvement des jambes s'apparente à la course. Ces mouvements constituent clairement la mobilité. Ces comportements, puis disparaissent et deviennent plus subtiles. Dans notre petit laboratoire des mouvements qui se limitent à des pattes avant, mais sans la participation des pattes postérieures ne sont pas comptés comme la mobilité. En outre, les oscillations du pendule et comme les sautes qui sont dus à l'élan acquis pendant les combats de mobilité tôt aussi ne sont pas comptés comme la mobilité.
5. Dans notre laboratoire, nous utilisons un logiciel sur l'écran du chronomètre pour mesurer le temps (Xnote Chronomètre, dnSoft Research Group). Deux chronomètres séparés sont utilisés sur l'écran. Le premier chronomètre compte à rebours de 360 ​​secondes et d'alertes de l'observateur lors de la période d'analyse comportementale se termine. La seconde STOpwatch contrôlée par l'observateur-mesure le temps passé mobiles. Certains logiciels chronomètre a la capacité d'affecter des touches pour démarrer et arrêter les fonctions, de sorte que l'écran du clavier peut contrôler le chronomètre. Au lieu d'un clavier ordinaire, nous utilisons un dispositif d'entrée communément appelé une «manette» pour contrôler les chronomètres.
6. S'il ya plus d'une souris testées et présent sur l'écran c'est une bonne idée de couvrir les autres animaux de sorte que leurs mouvements ne seront pas distraire l'observateur. Ceci peut être accompli en utilisant une autre fenêtre du programme ou en physique couvrant les autres souris sur l'écran avec le papier.
7. Il peut y avoir un biais survenant si le montant total du temps écoulé pour la mobilité d'une souris particulière est visible avant la fin de la session d'analyse. Si un chronomètre sur l'écran est utilisé, nous vous suggérons de couvrir tous les décimales mais la milliseconde du chronomètre. En couvrant le chronomètre de l'observateur sait que si le chronomètre estou désactiver à tout moment mais ne sait pas le temps total écoulé et ne peuvent donc pas être affectée par un biais. En utilisant cette approche de l'observateur, tandis aveugle à l'affectation aux groupes d'animaux, n'aura pas une idée générale du niveau de mobilité dans chaque animal.
8. Un test de fiabilité inter devrait être menée pour chaque nouvel observateur avant de commencer à collecter des données à partir d'animaux d'essai. Dans notre laboratoire, chaque nouvel observateur premières montres un observateur expérimenté, alors qu'il ou elle est de marquer. Après les nouveaux observateurs gagner la confiance suffisante pour différencier la mobilité de l'immobilité, ils ont ensuite pointage en temps réel avec l'observateur expérimenté regardant et en soulignant les erreurs. Une fois cette phase est terminée avec succès, les nouveaux observateurs va analyser un ensemble spécifique de vidéos TCT que nous maintenons dans notre laboratoire à des fins de formation. Seulement après un niveau élevé de concordance interobservateur est obtenu avec l'observateur expérimenté ne l'enquêteur d'analyser des vidéos à partir TCT réelleexpériences. Nous archivons les données de ces analyses de formation pour constituer un étalon interne pour le laboratoire. Nous avons observé des différences entre les souches de la manière dont elles expriment la mobilité (et immobilité) les comportements, et le temps moyen entre les sexes immobilisme. Quand un nouveau modèle de souris souche, le sexe, ou génétiquement modifiés est testé dans le laboratoire, il est nécessaire de procéder à nouveau ce type d'analyse de fiabilité.

4. Les résultats représentatifs

Nous avons utilisé le TCT pour évaluer antidépresseur réponses au traitement au lithium dans les différentes souches de souris (figure 1) ^3. Les détails expérimentaux de cette expérience sont publiés dans Can et al., 2011 ^3.

Figure 1. Temps d'immobilité dans le test de suspension caudale après l'administration chronique au lithium dans cinq souches de souris consanguines. Les souris ont été le groupe maisond, quatre souris par cage. Souris dans le groupe de traitement au lithium reçu du lithium chow contenant 4 g / kg de LiCl pendant trois semaines. Les animaux témoins ont reçu des aliments identiques sans le chlorure de lithium. **: P <0,01, ***: p <0,001 dénoter une importante test t non apparié. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. n :10-12 animaux par groupe pour chaque souche. (Figure reproduite à partir de ^3).

Dans cet exemple, un effet significatif du traitement de lithium chroniques livrées dans les aliments n'est observée que chez les souches C57BL/6J et DBA/2J. Dans les trois autres souches, aucune diminution statistiquement significative du temps de l'immobilité a été observée. Ces données indiquent que la réponse aux antidépresseurs, comme à un traitement chronique au lithium est la souche dépendante comme cela a également été observé avec d'autres médicaments antidépresseurs ^4-8.

Discussion

Développement de la TCT par Steru et al. ⁹ a été influencée par la force précédemment développé le test de natation ^10-12. Similaire au test de la nage forcée, dans le TCT souris sont placées dans une situation inévitable, mais modérément stressante. Manque de comportement de fuite est considéré comme lié immobilité. Comme le test de natation forcée, le TST est un test validé pour la meilleure évaluation de l'efficacité antidépressive de la drogue, mais aussi util...

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