Aşılar Fare yanıtlar içinde Nazofaringeal ilişkili lenforetiküler Doku (NALT) Rolü incelenmesi

Özet

Intranazal aşılara farelerin burun ve sistemik immün yanıtlar için nazofaringeal ilişkili lenforetiküler dokular (NALT) katkılarını incelemek için Yöntemler açıklanmıştır. Biz NALT bağımlı fare modeli kurmak için bir cerrahi prosedür göstermek ve Ex vivo kültürleri.

Özet

İnsanlarda, kemirgenlerden ve diğer memelilerde bulunan nazofarenks ilişkili lenforetiküler dokular (NALT), ^1-3 nazal sinüslerde bağışıklık katkıda bulunur. NALT sert damak yukarıda burun pasajda bulunan iki paralel çan şeklindeki yapılardır ve genellikle mukoza ilişkili lenfoid sistemin ^4-6 ikincil bileşenleri olarak kabul edilir. Dendritik hücreler ^4,7,8 antijen sunan serpiştirilmiş B ve T lenfositlerinin ayrık bölümlerdir NALT içinde yer alır. Bu hücreler hava yollarını ^9,10 mukoza yüzeylerinden antijen alımı için sorumlu M-hücreleri ile ardalanmalı bir epitel hücre tabakası ile çevrilidir. NALT dolaşan Naif lenfositler solunum patojenleri ⁷ ile ilk karşılaştığında yanıt gurur duyuyoruz. NALT iki yaş insanlarda yok olurken, Waldeyer Yüzükler ve benzer yapıdaki lenfatik organlarda th devam devamömrü ⁶ roughout. İnsanlarda aksine, farelerin dolayısıyla nazal sinüslerde ¹¹ içinde kaynaklanan immün yanıtların çalışma için uygun bir hayvan modeli sunan, hayatı boyunca NALT korurlar.

NALT tek hücre süspansiyonları kültürleri nedeniyle mononükleer hücrelerden, düşük verimler için pratik değildir. Bununla birlikte, NALT biyolojisi bozulmadan organın ex vivo kültürlenmesi ile incelendi ve bu yöntem, doğal doku yapısı sürdürmenin ilave bir avantajı vardır edilebilir. In vivo çalışmalar için NALT sınırlı kusurları başvuran genetik nakavt modelleri gelişim süreçleri zayıf bir anlayış nedeniyle henüz mevcut değildir. Lenfotoksin-α nakavt fareler NALT körelmiş olurken Örneğin, Peyer en yamalar, periferik lenf düğümleri, foliküler dendritik hücreler ve diğer lenfoid dokularda da bu genetik olarak manipüle farelerde ^12,13 ile değiştiği saptanmıştır. Gen knockout farelerde alternatif, cerrahi ablasyon p olarakermanently diğer dokulara etkilemeden nazal pasajdan NALT ortadan kaldırır. Çıkan fare modeli aşılar ^1,3 NALT ve immün yanıtı arasındaki ilişkileri kurmak için kullanılmıştır. Serum, tükürük, burun yıkama ve vajinal salgıların Seri toplama NALT doğrudan kaynaklanan bağışıklık yanıtlarını doku kültürü ile teyit edilebilir ise, aşı konakçı tepkileri temelinde kurulması için gereklidir. Aşağıdaki yordamlar gerekli ameliyatları, doku kültürü ve örnek toplama intranazal (IN) aşılama için yerel ve sistemik hümoral yanıtlarda incelemek için özetledik.

Protokol

1. NALT Toplanması ve Kültüre Alınması

1. Onaylanmış IACUC rehberlik kullanarak farelerde Euthanize. NALT etkileyebilecek uçucu anestezik maddeler kullanmaktan kaçının. Aseptik bir çalışma alanı veya biyogüvenlik kabini fareler aktarın. Farenin alt çene çıkarın ve alkol ve iyot mendil ile üst damak temizleyin.
2. Dikkatli fare kesici ve azı dişlerin iç kontur takip ederek üst damak kesilmiş ve tüketim için cerrahi bıçak sapı bir No 11 cerrahi bıçak kullanın.
3. Damak gözyaşı özen forseps ile yavaşça geri soyma damak.
4. Bu adımda kültürlerin kirlenme azaltmak için gerekli olan ve çok sayıda damakları işlenmesi için tasarlanmıştır. Yer damakları steril bir 48-kuyulu plakalı tam kültür ortamı 250 uL ile önceden doldurulmuş birinci sütunda bireysel kuyulara (37 ° C)% 10 fetal bovin serumu, 100 ug / ml streptomisin, 100 ile takviye edilmiş RPMI 1640 oluşan UI / mL penisilin, 50 ug / ml gentamisinve 1 mcg / mL fungizone / amfoterisin. Ortam damakları bir% 5 _CO2 /% 95 nemli hava inkübatöründe (37 ° C), ya da alternatif olarak non-CO ₂ kültürü için 10 mM Hepes pH 7.4, kullanmak kültürlenmiştir halinde tamponlu karbonat olmalıdır.
5. Damakları yıkamak için, damak sekiz yıkar toplam uğramıştır kadar dikkatle, yıkar arasındaki plaka dokunarak, arka arkaya birbirini izleyen her kuyuya damakları taşımak için forseps kullanabilir.
6. Kuyularda taze, tam kültür ortamı (37 ° C) 250 uL içeren yeni bir steril 48-iyi plakasına damakları aktarın.
7. Çalışma süresi boyunca kültür için bir 37 ° C inkübatöre damakları ihtiva eden plakalar yerleştirin.
8. Aseptik taze 37 ° C kültür ortamı 100 mcL ile değiştirerek, Eppendorf tüpleri her 24 saat içine kültür kuyulardan orta 100 uL aktararak analiz için numune toplayın.
9. Pelet kalıntı ila 10 dakika, 4 ° C'de, 380 x g'de santrifüje kültür ortamı örnekleri.
10. Analiz etmek için hazır olana kadar -20 ° C'de taze Eppendorf tüpleri ve mağaza santrifüje örnekten süpernatant aktarın.
11. Antijen spesifik IgG, IgM ve IgA, veya salgılanan sitokinler standart enzim bağlı immünosorbent testler (ELISA) ile doku kültürü Süpernatantları ölçülür.

2. NALT Cerrahi Ablasyon

1. Dişi BALB / c farelerine, yaş, 7-9 haftalık, uygun bir konu bulunmaktadır, fakat diğer suşlar da kabul edilebilir. Ameliyat sonrası idare edilecektir yiyecek ve su yerine fare gelmesini üç gün önce ameliyat jel gibi ıslak gıda sağlayın.
2. Ameliyat öncesi ağız boşluğuna Metacam ağrı kesici (1.5 mg / ml ya da 0.05 mg / damla) ve bir damla idare.
3. Bir ketamin, Acepromazine, ve karışım Xylazine (KAX) ile, örneğin, uygun IACUC yol kullanılarak farelerin uyuşturmak ve kurumasını önlemek için göz üzerine Puralube Vet Merhem uygulanır. NALT etkileyebilecek uçucu anestezik maddeler kullanmaktan kaçının. Anesthesia ayak yumuşak bir kıstırma için refleks yanıtın yokluğunda tarafından teyit edilebilir.
4. Subkutan cerrahi sonra fare potansiyel dehidratasyonu önlemek için 22-28 gauge iğne ve şırınga kullanılarak kürek kemikleri arasında 1 ml serum fizyolojik (% 0.9 sodyum klorür enjeksiyonu USP) yönetin. Ayrıca ameliyat sırasında ve sonrasında sağlıklı solunum tanıtmak için 22-28 gauge iğne ve şırınga kullanılarak kürek kemikleri arasında subkütan Respiram 0,1 ml yönetmek.
5. Daha sonraki tüm manipülasyonlara sırasında fare termal destek sağlayın.
6. Bir yatar pozisyonda anestezi fare yerleştirin ve hafifçe damağın üst açığa ağzı açık gözetlemek alt ve üst dişlerin etrafında cerrahi dikiş iki ayrı döngüler kullanın.
7. NALT yerinde üst damağın orta hatta aşağı uzunluğunda bir kesi yaklaşık 3 mm yapmak için bir 11 No'lu cerrahi bıçak kullanın.
8. Insizyon içine 0.5 mm microcurette yerleştirin ve hafifçe kenarından kazıyarakNALT bozabilir.
9. Bir termal koter ünitesi üzerinde bir düz ince döngü ile kanamayı durdurmak için kesi dağlamak.
10. Fare tam bilinç ve aktivite kurtarır ise termal destek devam edin.
11. 3 gün sonra ameliyat için günde bir kez gerekli ve ağızdan ağrı kesici ilaç gibi su kaybını önlemek için tuzlu subkutan kadar günde üç kez, kürek kemikleri arasında enjeksiyon başına 1 ml ile fare sağlayın. Derinin turgor kontrol etmek için bir cilt çadır testi tarafından dehidratasyon belirleyin. O kadar tente edilir, böylece kanatlar omuzları ile deri ve kürk kavrayabilir. Cilt hemen normal, önceki konumuna geri döner, fare susuz değildir. Cilt yüksek kalır ve yavaş hareket ederse, fare dehidratasyon bir devlet olduğunu ve tuzlu gerektirir. Kurtarma için yeterli zaman tanımak için ameliyattan sonra en az üç gün ıslak gıda sağlayın.
12. Herhangi bir deneysel işlemler öncesinde, kilo takip ederek 8-10 gün süreyle fareler gözlemlemek. Kötü ağırlığı kurtarmagenellikle tamamlanmamış damak iyileşme gösterir ve bu farelerin daha çalışmalardan kesilmelidir.

3. Histoloji için NALT hazırlanması ve NALT Cerrahi Başarı Değerlendirme

1. Aşağıda tarif edildiği gibi NALT cerrahiye histolojik tarafından tespit olmalıdır. Tüm deneysel çalışmalar tamamlandıktan sonra, onaylanan IACUC rehberlik kullanarak euthanizing tarafından kranial koleksiyonları için fareler hazırlamak. NALT etkileyebilecek uçucu anestezik maddeler kullanmaktan kaçının.
2. Ötanazi farenin ense kavrayın. Her iki tarafta makas ile kondiler süreçlerle kırpma tarafından kafatası geri kalanından alt çene çıkarın.
3. Ense başlayarak, yavaş yavaş soyma ve kafatası ventral tarafına doğru keserek kafatası deri ve kürk çıkarın.
4. Dikkatle burun çevresindeki deri kaldırmak ve tamamen kaldırmak için burun ucunun kapalı cilt snip.
5. Omurlar zekâ gelen kafatası ayırınmakas ha kelepir.
6. Foramen magnum içine makas yerleştirin ve sabitleme sırasında yumuşak dokuların içine formalin nüfuz sağlamak için orta hat boyunca kafatası yarıya kadar kesti.
7. Nötr 10% in kafatası sabitlemek oda sıcaklığında 24 saat boyunca (NBF) tamponlu formalin.
8. Kirecini çıkarmak için, formik asit karışımı ile şişe içinde, kemik dokunmaktan Rexyn önlemek için gazlı bez sarılmış, örnek ve ayrı bir kaset yerleştirin. Oda sıcaklığında 12 saat boyunca inkübe, ardından yaklaşık 20 dakika boyunca su altında sürekli durulanır.
9. Bir jilet ile septum ve geçmişte göz yörünge için örnek kesin.
10. Örnek ve kaset% 10 NBF kısa süreli saklanabilir.
11. Gecede işleme için bir doku örneği işlemci üzerine yerleştirin. Bu parafine gömme hazırlıkları için numune su kaldırmak için yapılır.
12. Aşağı burun ile parafin blok gömmek işlenen doku, çıkarın ve soğumaya bırakın.
13. R TrimNALT yaklaşık konumunu yaklaşırken otomatik bir mikrotom ile bloğunun ough 15 mikron kesitleri, sonra 44.3 ° C su banyosunda cam slaytlar monte edilmek üzere 5 mikron bölümlerde kesme devam ediyor.
14. Hematoksilen ve eozin (H & E) histoloji boyama NALT ablasyon değerlendirmek için kullanılmalıdır.

4. Fare ile Biyolojik örnekler Koleksiyonu

4.1 Serum

1. Dikkatli bir ısı lambası ile vücut ısısı yükselen kan akışı artar. Bir cerrahi bıçak ile yanal kuyruk veni nicklemek kan toplayın. Kan Microtainer serum ayırıcı tüp içine serbestçe damla izin verin.
2. Kan akışını durdurmak için, gazlı bez veya havlu gibi emici bir malzeme ile nick hafifçe basınç uygulayın.
3. 30 dakika boyunca Microtainers içinde kan pıhtılaşmasına izin, ardından en az 90 saniye boyunca 6-15 x 1000 g arasında santrifüjlenir.
4. Için temiz bir Eppendorf tüpüne Microtainer serum ayrılmış aktarınDepolama -80 ° C'de

4.2 Tükürük

1. 20-30 uL steril fosfat pipetleme yanak ve diş eti çizgisi arasında (PBS) tamponlu ise dikey anestezi fare tutun. Yanak ve diş eti çizgisi arasında pipet yönlendirerek seyreltilmiş tükürük toplayın.
2. -20 ° C'de 2x proteaz inhibitörü ve mağaza 10 uL içeren taze bir tüpe seyreltilmiş tükürük aktarın

4.3 Burun salgıları

1. Onaylı IACUC rehberlik kullanarak, burun salgıları toplamaya önce fare Euthanize. NALT etkileyebilecek uçucu anestezik maddeler kullanmaktan kaçının.
2. Fare Holding dikey, özenle tek burun deliğine steril PBS 30 uL pipetleme ve diğer burun durulama toplamak.
3. -20 ° C'de 2x proteaz inhibitörü ve mağaza 10 uL içeren taze bir tüp ile durulanmalıdır transfer

4.4 vajinal salgıları

1. Th açıklığa mikropipet ucu eklemeBir ötenazi fare e vulva, steril PBS 50 uL ile vajina durulayın ve mikropipet bütün sıvı toplamak.
2. -20 ° C'de 2x proteaz inhibitörü ve mağaza 10 uL içeren taze bir tüp ile durulanmalıdır transfer

5.. Toplanan örneklerde antijene spesifik antikorlar ya sitokinler ya da başka bir ELISA metodu kantitatif ile ölçülebilir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 ex vivo analiz için NALT içeren doku ile ilgili işlem adım, genel bir şematik sağlar. Şekil 2 (A, B) 'de, damağın boyut olarak noktalı çizgi ile gösterildiği gibi, Ablasyon cerrahisi sırasında kesi konumu (A) yanı sıra, gösterilmiştir. NALT yerini paralel dokular gösteren, Şekil 2'de, bir çıkarıldı hematoksilin lekeli damağın (C), üzerine premolar alanda oklarla gösterilmiştir.

Şekil 3Üst NALT erişim için damağın (A, B), Ablasyon (C), ve kesi (D) nihai koterizasyon maruz gösteren, NALT bozulması cerrahi aşamaları göstermektedir. Doğrudan ameliyat sonrası microcurette tarafından NALT bozulması bir görüntü Şekil 3F görünür ederken ameliyat öncesi NALT çevreleyen nazal sinüs alanının Tipik H & D kesiti, Şekil 3E 'de gösterilmiştir. Ameliyat sonrası iyileşme için yeterli zaman kalması insizyonlar kapatılmalı ve NALT (Şekil 3G) nazal kavite yoksun.

Bu teknikler kullanılarak elde Tipik bir deney sonuçlarını stafilokok oian alt birim aşı (STEBVax) ile yapılan bir çalışmada doku kültür yüzer ve biyolojik örnekler karşılaştırılarak, Şekil 4 'de gösterilmiştir. Farelerin burun içi (IN) veya intraperitonal (IP) yolları tarafından STEBVax uygulanmıştır. Aşı Toll benzeri reseptör 4 yolu ^3,1 aktive bir adjuvan ile formüle edilmiştir 4 ve kontrolleri sadece serum fizyolojik ya da aşının adjuvansız verildi. Deney gruplarında elde edilen ve kültürü NALT ELISA ile ölçülebilir olduğu ortama antijen spesifik immünglobulin salgılanır. Bu örnekte, (Şekil 4A), sonuç IgA büyük miktarlarda yardımcı maddesi ile birlikte, bir alt birim aşı ile aşılanmış fareler elde NALT tarafından yayımlanmıştır göstermektedir.

Kontrol veya NALT free fare alınan biyolojik örnekler (serum, tükürük, burun salgıları, vajinal salgılar gibi) doku kültürü sonuçları ile karşılaştırma için burun antijenlere karşı in vivo immün yanıt profil kullanılabilir. Aşılama IN Şekil 4B olarak, IgA ve IgG yanıtları önemli ölçüde fonksiyonel NALT olmadan azalmıştır. Antijene özel IgA seviyeleri aşılanmış farelerin mukozal salgılar IgG (tükürük, burun yıkamalarından) 'den, genellikle daha yüksek olmuştur.

upload/3960/3960fig1.jpg "/>
Şekil 1. NALT toplama ve ex vivo kültür şematik.

Şekil 2. NALT ve cerrahi kesi konumunu gösteren fare damak görselleştirilmesi. Boyut ve noktalı çizgi (A) ile gösterilir cerrahi kesi ile üst damak konumu, üst damak eksize (B) veya damak premolar bölgede (damağın ön tarafında lekeli koyu mor paralel NALT görüntülemek için hematoksilen (C) boyandı ). NALT oklarla gösterilen.

Şekil 3. Cerrahi NALT bozulması. NALT bozulması cerrahi Anahtar aşamaları: ameliyattan önce farenin üst damak yatar görünümü (A); NALT (B) erişmek için üst damakta yapılan ensizyon; yılında NALT yapısını bozacak ensizyon yoluyla eklenmiş microcurette probtegrity (C), cerrahi (D) sonuca kesi koterizasyon. Cerrahi (E) önce burun boşlukları, H & E boyalı, mikroskobik görüntüler; hemen cerrahi (F) sonra; ve bir başarıyla iyileşti, NALT-ücretsiz fare (G).

Şekil 4. Kültürlü NALT, tükürük ve aşılanmış farelerin toplanan burun salgılarından Aşı özgü antikorların. NALT-ücretsiz ya da normal kontrol fareleri IN veya STEBVax IP aşılandı ve biyolojik örnekleri alındı. Üç nüsha numune antikor düzeyleri ELISA yöntemi ile ölçüldü. (A) NALT kontrol fareleri (cerrahi manipüle değil) kaldırılır ve antikor yanıtları incelemek için kültüre edildi. Aşılanmış farelerde IN için kültür aşısı özgül IgA yanıtı (Student t-testi, p ≤ 0.01, hiç adjuvan ya da hiç aşı ile karşılaştırıldığında) kontrol grubundan istatistiksel olarak farklı değildi. (B) NALT kesinti belirli bir ölçüde azaltılmış antikor tepkisiaşı IN. Spesifik antikor düzeyleri arasında anlamlı bir fark yoktu NALT ve NALT tükürük IgG sonuçları (Student t-testi, p ≤ 0.05) hariç tüm karşılaştırmalar için + grup (hiçbir cerrahi ya da kontrol cerrahisi).

Tartışmalar

Biz biyolojik örnekler ve NALT ilişkili immün yanıtlar ^1-4 incelenmesi için testler elde, bir hayvan modeli geliştirmek için ortak yöntemler sundu. Bu yöntemlerin uygulanması sırasında dikkate almanız gereken ek faktörler vardır. Cerrahi ve doku kültürü için standart steril teknikler takip edilmelidir. Izolasyon ve kültür gibi sterilize aletler, çalışma alanı ve dezenfekte damak bakımı sırasında kullanılan antibakteriyel ve antifungal bir kombinasyonu bulaşma riskini azaltacaktır. Serum antikorları genellikle yüksek konsantrasyonlarda bulunur gibi tükürük, burun yıkama ve benzeri mukozal sekresyon örnekleri, kan potansiyel kontaminasyon açısından kontrol edilmelidir. Antikorların daha düşük konsantrasyonlarda serumu ile karşılaştırıldığında, bu örnekler mevcut olduğundan daha fazla, mukozal salgılar sadece hafifçe analizi için seyreltilmiştir edilmelidir.

Fareler öncesi doğrudan ameliyattan sonra sıcak tutulmalıdırpotansiyel anestezi bağlı hipotermi için önlem alınmalıdır. Onların yüzüne Alternatif dinlenme fareler ameliyat sonrası iyileşme sırasında düzensiz solunum aza indirmek için. Cerrahi işlem bu görevleri tamamlamak için birlikte çalışan üç kişinin daha verimlidir: fareler anestezi kurtarmak olarak cerrahi tedavi bir, ağız açık tutarak yardımcı olmak için, diğeri de ameliyat sonrası bakım sağlamak.

Her fare için ameliyatın başarı doğrulamak için tüm deneysel prosedürleri veya çalışmaların sonunda kraniyal kesitler H & E boyama kullanmak gereklidir. Olası cerrahi sonuçlar şunlardır: eksiksiz ve ikili NALT ablasyon, eksik ablasyon, veya bozulmamış NALT. Tüm cerrahi kalıntı veya bozulmamış NALT ile tam NALT kaybı, hayvanlar neden olur, çünkü iç kontroller olarak kullanılabilir. Başka bir olası sonuç damak burun ve ağız boşlukları bağlayan bir açıklık bırakarak, tamamen iyileşmek için başarısız olur. Eksikdamak iyileşme, düşük ağırlığı ve gelişme geriliği neden olacaktır ve bu kişilerin çalışma çıkarılmalıdır.

Fare modeli ile ilk aşı yanıtı incelenmesi amaçlanan çalışma sonucu (antikor yanıtı, hayatta kalma, vb) NALT için bir rol kurmak için görev yapacak. Cerrahi NALT kaldırarak yerel ve sistemik bağışıklık burun katkıların belirlenmesi kolaylaştırır. Burada anlatılan cerrahi yaklaşım NALT yoksun bir fare modeli elde etmek için en doğrudan bir yöntemdir. Knock-out fare modelleri seçin eksikliği NALT bildirilmiş, ancak bu hayvanlar da sitokinler veya diğer ikincil lenfoid dokuların gelişimi için gereklidir kemokinler eksik olduğunu ve ek kusurları ^12,13 barındıran olabilir edilmiştir. Ayrıca, burada açıklanan yöntemlerden burun pasajda içinde kaynaklanan bağışıklık yanıtlarını çeşitli yönlerini incelemek için geliştirilmiştir. Bizim deney sonuçları tüm üst palat kullanarak çalışmalarına dayanmaktadırdoku kültürü için fare e, bu bölümlerde kullanılan olasıdır ancak. Son olarak, kültür NALT doku kültürü modeli olarak tamamen deneyler için yararlıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Paslanmaz Çelik Steril Cerrahi Bıçaklar, No: 11 sayılı	Miltex	4-311
Bıçak Kolu, No: 3	Miltex	4-7
48-İyi Hücre Kültür Tabaklar	Costar	3548
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Fetal Bovine Serum, İnaktive Isı	Gibco / Invitrogen	16000-044	Final Conc: kültür ortamına hacimce% 10
Streptomisin Sülfat	Sigma	S9137	Nihai Conc: 100 ug / ml
Penisilin	Sigma	P7794	Final Conc: 100 UI / mL
Gentamisin	Sigma-Aldrich	G1397-10ML	Final Conc: 50 mcg / mL
Fungizone	Gibco / Invitrogen	15290-018	Final Conc: 1 mcg / mL
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Nihai Conc: 10 mM
Eppendorf Mikrosantrifüj Tüpler	Eppendorf	022364111
Nutra-jel Kiraz Aromalı Fare Islak Gıda	Bio-Serve	S4798-TEPSİ
Metacam	Boehringer Ingelheim	601531000	1.5 mg / mL Oral Süspansiyon bir damla
Ketamin	Pfizer	00856440301	Final Conc: 6.06 mg / ml
Acepromazine	Vedco	VEDC207	Final Conc: 0.061 mg / ml
Ksilazin	Lloyd	4811	Final Conc: 0.667 mg / ml
Puralube Vet Merhem	Pharmaderm Hayvan Sağlığı	1621
% 0,9 Sodyum Klorür USP	Baxter	2B1302
0,5 mm Microcurette	Roboz	RS-6350
Termal Koter Ünitesi	Geiger	150-S/150A-S
TCU Değiştirme İpucu, Düz Güzel Döngü	Geiger	214
Cerrahi Makas
Nötr% 10 Formalin Tamponlu	Sigma	HT501128
Formik asit	Balıkçı	A119P-4	1047 ml musluk suyu içine 426 ml formik asit karıştırın, daha sonra 45 ml Rexyn 101 (H) eklemek
Rexyn 101 (H)	Balıkçı	R231-500
Doku-Tek VIP E150/E300	Sakura
Döner Mikrotom	Leica	RM2255
Mayer'in Hematoksilen	Sigma	MHS16-500ML
Gill No.1 Hematoksilen	Sigma	GHS116
Eosin B	Sigma	2853
Microtainer Serum Ayırıcı	BD Medical	365956
Fosfat Tamponlu Salin			100 mM NaH 2 PO 4, 140 mM NaCl, pH 7.4
Proteaz İnhibitör Kokteyl, EDTA-free	Thermo Scientific	78415