İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

Tzu-Hsing Kuo; Arun Handa; Julie A. Williams

doi:10.3791/4355

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Immün yanıt ve davranış arasındaki bağlantıyı anlamak için, lokomotor davranışları ölçmek için bir yöntem tarif Drosophila Bakteriyel enfeksiyon yanı sıra izleme sağkalım, bakteri yükü, ve doğuştan gelen bağışıklık, NFKB önemli bir regülatör gerçek zamanlı aktivite ile bir bağışıklık yanıtı bağlamaya sinekler yeteneği sırasında.

Özet

Immün yanıtı ve konak davranış arasında karmaşık bir etkileşim tür geniş bir biçimde tarif edilmiştir. Aşırı uyku, özellikle, memelilerde ¹ enfeksiyonuna yanıt olarak oluştuğu bilinmektedir ve ayrıca son zamanlarda Drosophila melanogaster ^2'de tarif edilmiştir. Bu, genel olarak uyku bir enfeksiyon sırasında ana için yararlı olan ve bir güçlü bağışıklık sistemi ^3,4 korunması için önemli olduğu kabul edilir. Ancak, bu hipotezi destekleyen deneysel kanıtlar ⁴ sınırlıdır ve bir bağışıklık yanıtı sırasında aşırı uyku fonksiyonu belirsizdir. Biz bu karmaşık sorunu çözmek için multidisipliner bir yaklaşım kullanmış ve basit bir genetik model sistem, meyve sineği Drosophila melanogaster de çalışmalar yapmıştır. Biz, sinekler lokomotor davranışlar ve uyku ölçülmesi için bir standart tahlil kullanmak, ve bu tahlil sinekler infecte davranış ölçmek için nasıl kullanıldığını göstermekbir bakteri patojen d. Bu test aynı zamanda bir enfeksiyon sırasında bireysel sinekler sağkalım süresini izlemek için yararlıdır. Bağışıklık işlevi ek önlemler enfeksiyon ve NFKB, Drosophila doğal immün yanıtı için merkezi bir anahtar transkripsiyon faktörünün aktivasyonu temizlemek için sinekler yeteneğini içerir. Enfeksiyon sırasında sağkalım sonuçları ve bakteriyel klirense Hem birlikte direniş ve enfeksiyona hoşgörü göstergeleridir. Toleransı sistem ⁵ içinde patojen yüksek seviyelerde olmasına rağmen bir enfeksiyon hasarı sınırlamak ve böylece hayatta kalmak için ana yeteneği olarak tanımlanır iken Direniş, bir enfeksiyon temizlemek için sinekler yeteneğini ifade eder. Enfeksiyon sırasında NFKB faaliyet Gerçek zamanlı izleme enfeksiyon sırasında hayatta bir moleküler mekanizma fikir sağlar. Bu apaçık deneylerinde Drosophila kullanımı uyku genetik ve moleküler analizler kolaylaştırırve immün yanıt ve nasıl bu iki kompleks sistemlerin karşılıklı etkilenir.

Protokol

Bu protokol, bir bakteriyel enfeksiyona maruz kalan sinek toplandı dört farklı okuma elde etmek için iki düzeneklerinin (Şekil 1) kullanır. 2) sağkalım sonuçları;; 3) sinek bakteri yükü ve 4) in vivo NFKB muhabiri aktivitesinin gerçek zamanlı ölçümü Bu çıkışlar) uyku / uyanıklık davranışları 1 içerir. Drosophila mevcuttur genetik araçları ile birlikte, bu ölçümler bağışıklık fonksiyonu ve davranışı arasındaki moleküler bağlantıyı içine mekanistik bakış açısı sağlar.

1. Sinekler Tedbir Lokomotor Aktivite ve Uyku

Lokomotor aktivitesini ölçmek ve Drosophila etkinliği izleme sistemi (DAM2, Trikinetics), inkübatör, karanlık oda ve deney hayvanları ve aktivite tüplerin hazırlanması içeren, sinekler uyku için kullanılan kurulum, daha önce ⁶ tarif edilmiştir. Aynı yaklaşım, bazı küçük değişikliklerle, burada kullanılır.
1. Kuluçka aydınlatma inkübatör kendisi tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bu bilgisayar ve kuluçka süresi ayarı arasında senkronize etmek için önemlidir.
2. Aktivite tüpler de-iyonize su bir sıcak plaka üzerinde kaynatarak yeniden kullanım için temizlenir. Deterjan küçük bir miktar ilk kaynama ilave edilir, tüp yanı sıra iki kere durulanmış ve daha kaynatılır. Iplik tüp takmak için kullanılması durumunda, ikinci faaliyet tüpler (gıda, balmumu, sinek ve iplik içeren) iplik çıkarma işleminden önce olmaksızın temizlenebilir.
Önce bir deneme başlatmak için geç pupa içeren yer kültürleri deneysel aydınlatma ve diğer çevre koşullarına uyum sağlamak için üç dört gün için kuluçka sinekler düzenledi. Işık: koyu veya sabit koşullar sık uykusu davranış ölçmek için kullanılmaktadır. Bu örnekte, sinekler immün yanıt ve davranış ^2,7,8 ilgili sirkadiyen saat etkisini ortadan kaldırmak için sabit ışık acclimated edilmektedir. Şekil 1A açıklandığı gibi , Trikinetics DAM2 faaliyet içine yük 1-4 gün eski sinek gibi enfeksiyon öncesi üç gün en az ^6, ve kayıt açıklanan izler.

2. Bakteriler bir patojen ile Sinekler Infect

Burada açıklanan protokol S. için spesifiktir büyümek ve bakımı kolay olan marcescens. Diğer bakteri türleri için uzun vadeli depolama ve kültür koşulları için Protokoller. S. değişir marcescens -80 ° C 'de% 15-50 gliserol depolanır 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde otoklavlanmış% 50 gliserol 1 hacim - uzun vadeli depolama için hazırlamak için, bir gecede bakteri kültürü 2 cilt (1.0 OD ₆₀₀ = 0.5) karıştırın. Bu,% 17 gliserol nihai konsantrasyon neden olur. -80 ° C'de saklayın tüpleri Bakteri kaynağı kullanımı kısa vadeli hazırlamak için steril bir 200 ul pipet ucu ile dondurulmuş stok kazıyın ve LB agar plaka üzerinde üç yönlü bir çizgi gerçekleştirin. 37 & d gecede plaka inkübeörneğin; C izole koloniler elde etmek. 4 ° C'de depolayın plaka
Planlanan enfeksiyondan önce bir gün, 5 ml LB ortamı içeren bir kültür tüpüne steril bir 200 ul pipet ve batığın ucuyla LB agar plaka tek bir koloni seçin. Bakteri gecede büyümek, ya kadar 37 küvöz çalkalayıcı içinde 16 saat ° C ve 250 rpm de üstel büyüme safhasına kadar. OD ₆₀₀ bir spektrofotometre ile konsantrasyonunu ölçün. Bu aşamada yoğunluğu 0,5 ile 1 arasında değişir. Konsantrasyonu çok yüksek ise, alt kültür bakteri ve optimal bir konsantrasyon elde etmek için başka bir kaç saat için büyür. Bir alev kaynağının yakınında prosedürü uygulayın. Bazı bakteri suşları antibiyotik direnç için tasarlanmıştır ve büyümüş ve uygun bir antibiyotik için seçilen orta eklendi. S. marcescens (ATCC # 8100) antibiyotik dirençli değildir ve bu nedenle antibiyotik olmaksızın, steril ortamda yetiştirilen. Steril teknik doğrulamak için, bir aldatma cultu yapınkontrol olarak bakteri olmadan yeniden.
Sinekler bulaştırmak için çözüm bakteriler (= 0,1 OD ₆₀₀ seyreltilmiş) ve PBS içinde% 1 gıda boyası (Parlak Mavi FCF) içerir. PBS içinde enfeksiyon çözeltisi ve% 1 mavi renklendirici olarak kullanılan gıda LB ortamı eşdeğer miktarda eklenmesi ile enjeksiyon için bir kontrol çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde çözümler saklayın.
Sinekler enjekte için cam iğneler hazırlayın. Bir mikropipet çektirmesi (Narishige) kullanılarak ince bir ucu cam kapilerleri (od = 1 mm, id = 0.58 mm, TEFE) çekin. Diseksiyon mikroskobu altında açılış bir şırınga ile emme uygulanarak enjeksiyon sıvı ile doldurmak için yeterince büyük, ancak enjeksiyon işlemi sırasında sinek hasarı en aza indirmek için yeterli küçük olduğunu böylece iğne ucu kopmak ince forseps kullanın. Ucu kırdıktan sonra, ucu boyutu 40-50 mikron civarında olmalıdır. Iğne cam tüp bir uzunluğa sahip bir 3 cc plastik şırınga ile eklenmiştir. Enjeksiyon ortamının akış elle pozitif bir basınç uygulanması ya da s kontrol edilirşırınga ile uction. Şırınga cihaz ve enfeksiyon kontrol enjeksiyonlar için kullanılmış olduğu gibi, enjeksiyon sıvı ile kauçuk borudan yapılmış kirletici kaçının.
Bir CO ₂ pad üzerinde koyarak sinekler uyuştur. CO ₂ ped nemlendirmek için ve ped üzerinde uçan bir manipülasyon olarak gelişebilen statik elektrik, su azaltmak için bir kapalı kap içinden geçirilir. Dorsal toraks scutellum Yukarıdaki bölgeye cam iğne alay tarafından sinekler enjekte. Sinek içine enjeksiyon orta geçen gıda boyası ile de doğrulanmaktadır - sinekler sistemi yoluyla gıda boyası yayıldıkça maviye döner. Kısım 3 'de tanımlanan sinekler almak bakteri doz altında, ölçülebilir. Bazı deneysel tasarımlar PBS ve gıda boyası ile ancak bakteri olmadan sinek enjekte edilerek aseptik yaralanma alan bir kontrol grubu yer almaktadır.

3. Bakteriyel Yük belirleyin

Evaluatin için bir yaklaşımg bakteriyel enfeksiyona karşı bağışıklık yanıtı bakteri yük sonrası enfeksiyon belirlemektir. D. melanogaster bütün uçucu bir birey içinde toplam bakteri sayısını belirlemek için homojenize edilebilir, çünkü bu parametreleri belirlemek için bir çok iyi bir modeldir. Bu protokol arkasındaki mantık gibi Luria broth (LB) bir Petri kabı agar (LB plaka) olarak sağlam bir ortamda yetiştirilen zaman, tek bir bakterinin görünür ayırt koloni oluşturmasıdır. Bu nedenle, Homojenat seri dilüsyonları üreten ve LB plakaları üzerine seyreltilmiş homojenat yayma, LB sıvı ortam içinde enfekte sinekler homojenleştirici ile, bir uçucu enfekte bakteri hücrelerinin sayısını tespit edilebilir. PBS ve gıda boyası ile ancak bakteri olmadan enjekte sinekler bir kontrol grubu enfeksiyonu diğer bakteriyel türleri ile kontamine olmadığını doğrulamak için kullanılmalıdır. Bu durumda LB agar plakası üzerinde hiçbir koloni olmamalıdır.

Bunun için kullanılacak olan malzemelerin otoklavGerçek homojenizasyon adımı gerçekleştirmeden önce prosedürü. Bu homojenizasyon için kullanılan makas, LB medya ve havan ile kesilmiş 200 ul pipet uçları içerir. Sinekler homojenleştirici önce en az 1 gün 10 cm steril Petri kutularına otoklavlanmış LB / agar besiyeri dökülerek tabak hazırlayın.
Anestezisi ve buz üzerinde 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza tüpler sinekler toplamak.
Kontaminasyonu önlemek için bir alev yakınında homojenizasyon gerçekleştirin. Böyle S. gibi bir bakterinin kullanırken özellikle enfeksiyon olmadan sinekleri içeren bir denetim homojenizasyon önerilir Antibiyotiğe dayanıklı değildir marcescens. 10 sinekler her başı deney koşulunda 2 grup en az homojenize. Homojenat başına kullanılan sineklerin sayısı deneyi ile belirlenir. Diğerleri Homojenat başına 3-10 sinekler kullanmış Bazı gruplar, bireysel sinekler ⁸ arasında bakteri yükü değişimi değerlendirmek için yararlı olduğu Homojenat başına bir sinek kullanmış^9-12 genotip veya deneysel durum karşısında karşılaştırmaktır.
1. Sinekleri içeren her mikrosantrifüj tüp 400 ul LB ortamı ekleyin ve küçük bir motor ve havaneli (Kontes) kullanılarak homojenize.
2. Sterilize kesilmiş pipet uçları kullanarak, seri 180 ul LB ortamı içeren 1.5 ul mikrosantrifüj tüpe 20 ul homojenize LB / bakteriyel orta ekleyerek homojenat 01:10 sulandırmak. Pipet uçları Kesme anında enkaz tıkanmaları önler ve uygun bir ses aktarılıyor sağlar.
3. Seyreltme faktörü ampirik olarak belirlenir ve sinek genotip, kullanılan bakteri suşu ve deneysel koşula bağlıdır. Vahşi tip S. ile enfekte sinekler için marcescens, enfeksiyon sonrası hemen homojenize sinekler için 01:10 ² veya 1:10 ³ dilüsyonları kullanmak ve sinekler için 01:10 ⁴ veya 1:10 ⁵ dilüsyonları 24 saat sonrası enfeksiyon homojenize.
4. Mikrofon 100 ul LB / bakteriyel orta Ekleve son seyreltme içeren rocentrifuge tüpleri eşit dağılımını sağlamak için cam bilyalar (VWR) kullanarak bir LB plaka üzerinde orta yayıldı.
5. % 100 EtOH solüsyonu içine cam topları atın. Bir gece boyunca 37 ° C inkübatör LB plakaları yerleştirin.
6. Isteğe bağlı bir adım olarak, LB plakaları (; Alpha Innotech FluorChem 8900) bir görüntü elde etmek için görsel ışık ile bir görüntüleme sistemi kullanın. Plaka kendisi ya da Photoshop yazılımı (Photoshop CS3) üzerinde sayım aracı kullanılarak levhanın görüntü ya da kolonilerini sayın.
7. Sayısı koloni oluşturan formül kullanılarak sinek başı üniteleri hesaplayın: [n / (N * D * v)] * V, n LB plaka üzerinde yetiştirilen koloni = sayı; N = sineklerin sayısı birinde toplanmış mikrosantrifüj tüp; D = seyreltme faktörü ve v Her plaka üzerine yayılmış çözüm = hacmi V Homojenat = başlangıç hacmi.

4. Enfeksiyon Sonrası Uyku ve Sağkalım Süresi Değerlendirin

Içinbakteri yükü ölçmek için hasat değil sinekler, başka bir 7-10 gün davranışını izlemeye devam. Sağkalım süresi sinek, çevresel koşulların genotip etkilenmiştir ve bakteriyel türler enfeksiyon için kullanılır.
~ 10 gün sonra, deney sona indirebilir ve daha önce ⁶ açıklandığı gibi davranışsal verileri işlemek. Matlab dayanır Insomniac2 özel yazılım, uyku parametrelerin analiz etmek için kullanılır. Bu davranış analizden ölü sinekler ortadan kaldırmak için önemlidir. Normal olarak, bu enfeksiyon ve uçucu genotip türüne bağlı olarak, enfeksiyondan sonra ilk gün içinde için analiz kısıtlar. Tahlil Ölüm tüm etkinlik sayıları sıfıra ulaşmış süresi belirtilir. Sağkalım analizi kolaylaştırmak için, Drosonex, Microsoft Visual yazılmış özel yazılım C + + 6.0, Trikinetics DAM sistemi ham veri dosyaları işlemek için kullanılır. Excel dosyaları, her bir sineğin sağkalım süresi (saat olarak), hem yazılım raporları aktivite dat derlertek bir elektronik tabloya tüm monitörleri bir ve yüzde uçar raporlar kullanıcı tarafından belirlenen zaman içinde hayatta. Excel dosyaları ayrıntılı analiz için diğer istatistik yazılım paketleri içine entegre etmek için tasarlanmıştır.

5. Bir Lusiferaz Reporter Assay kullanma Enfeksiyon sırasında NFKB Aktivite ölçün

Transgenik KB'yi-luc Bu tahlilde kullanılan önceden sinekleri gibi Kuo ve ark tarif elde edildi., 2010 ^2. Kısaca, kappa B-luc lusiferaz raportör bir açık okuma çerçevesinin üst akışında bir promotör içine yerleştirildi bir NFKB bağlayıcı sekans 8 tekrarlar içerir.

Olarak bölüm 1.2 'de açıklanan deney aydınlatma koşullarına sinekler ayarlayın. Bu örnekte, 1-4 günlük KB'yi-luc kara sinekler,% 5 sukroz,% 2 agar gıda ve orta enfeksiyon sırasında diğer sinekler gibi aynı yaş ulaşmak için 2 gün boyunca sürekli ışık (LL) yerleştirilir ihtiva eden küçük şişeler içine yerleştirildi.
Sinekler için 96-çukurlu bir mikrolevhadaki hazırlayın. Her iyi gıda orta 2 kat (Şekil 2) içerir; üst tabaka luciferase, lusiferaz ve substrat içerir. % 5 sukroz, her oyuğa% 2 agar çözeltisi 300 ul ekle ve katılaşmasına izin verir. Daha sonra, her bir sıra içeren% 5 sukroz,% 1 agar, ve 2 mM lusiferin (Gold Biotechnology, Inc) ile bir 50 ul üst tabaka ekleyin. Drosophila ölçüm raportör etkinliği için kullanılan lusiferin konsantrasyonlarda literatürde değişiklik göstermektedir, ve 100 uM ¹³ gibi düşük olmuştur. Gerekli konsantrasyon ampirik olarak saptanabilir. Gıda katmanları dağıtım arasında, sterilite korurken kurutma kolaylaştırmak için ince örgü kumaş ile plaka kapağı. Plaka yoğunlaşma damlacıkları sıkışmış uçar önlemek için, bir saat kadar, iyice kurumasına izin verilmelidir. Luciferase ışığa duyarlı olduğundan, gereğinden fazla ışığa plakalar maruz bırakmayın.
Açık yapışkan film (En Uygula-Seal-A, Perkin Elmer) kuyu başına 2 adet delik bir miktarda ince bir iğne kullanılarak bir 96-gözlü mikro levha ve perfore. Bu delikler sadece her iyi hava değişimi izin vermez, aynı zamanda bireysel bazda sinekler uyutmak için bir yol sağlayacaktır. Keskin bir bıçak ve straight edge kullanarak, her sütun arasında bir kesim tanıtmak. Bu bir seferde yüklemek / 8 kişilik gruplar halinde sinekler boşaltmak için kolay bir yol sağlar.
Mikro plaka içine sinekler yüklemek için, bir CO ₂ pad üzerinde kuvöz ve uyutmak sinekler şişeleri çıkarın. Yük sütun-by-sütunu, her iyi bir-tek uçar. Genellikle müdahalesi olmadan kurtulmaları mümkün olduğu gibi bir yapıştırıcı mühür takılıp yanlışlıkla uçması gerektiğini, yalnız sinek bırakın. 8-24 saat yeni ortama alışması için ve luciferase substrat tüketmek için LL olarak inkübatör Mikro plaka dön.
Kültür bakteriler, S. marcescens, ve yukarıda tarif edildiği gibi enfeksiyon için bir solüsyon hazırlanır.
Anesteziyoloji to bir düşük basınçlı _CO2 hattına bağlı bir mikropipet ucu kullanarak uçuyor. Doğrudan her kuyu için yapılan havalandırma delikleri yukarıda mikropipet ucu yerleştirin. CO ₂ basınç sinek uyuşturan için yeterince yüksek, ama sinek yaralanmasını önlemek için yeterince düşük olduğundan emin olmak için dikkatli atın. Sekiz gruplar halinde, ayrı ayrı _bir CO2 ped için her bir uçucu aktarmak ve yukarıda açıklandığı gibi enfekte. Enfeksiyon sonra, iyi orijinal her sinek dönmek ve mikroplak kapatın.
Tedbir lüminesans (TopCount-NXT Lüminesans ve Sintilasyon Sayıcı; Perkin-Elmer). TopCount lüminesans sayacı herhangi bir süre (genellikle en fazla beş gün) için istenilen aralıklarla sürekli olarak programlanmış ve otomatik okuma sağlayan plakalar için bir istifleme kaset içerir. Bu özellik, tüm enstrümanlar mevcut değildir, ve diğer enstrümanlar ile yapıldı deneyler için veri toplama dolayısıyla daha az sık olabilir. Işıldama sayacı bir ro housedkontrollü bir sıcaklık ve aydınlatma programı ile om. Istifleme kasete plakaları yüklerken, sinekler ışık almasını sağlamak için açık boş plakaları arasındaki sinekleri içeren plakalar yığını. Okumalar 24 saat en az saatte toplamak için üreticinin spesifikasyonlarına göre Programı luminometre. Bu örnekte, detektörler 10 saniye için her bir kuyu okumak için ve saniye başına sayımları (isteğe bağlı birimleri) sonuç olarak ifade etmek için programlanmıştır. Bu değer, kuyu başına 3 okumalar karşısında ortalaması alınır. Bir elektronik veri dosyalarını verme ve bir standart analiz, lüminesans sonuçlarının grafik.