Количественные измерения иммунного ответа и сна в<em&gt; Drosophila</em

Резюме

Чтобы понять связь между иммунной реакции и поведение, мы опишем метод измерения опорно-двигательного поведения в Drosophila Во время бактериальной инфекции, а также способность мух монтировать иммунного ответа путем мониторинга выживание, бактериальной нагрузки и в режиме реального времени активности ключевого регулятора врожденного иммунитета, NFkB.

Аннотация

Сложное взаимодействие между иммунным ответом и принимающей поведения был описан в широком диапазоне видов. Превышение сна, в частности, как известно, происходит в ответ на инфекцию в организме млекопитающих ¹ и также недавно были описаны в дрозофилы ^2. Принято считать, что сон приносит пользу принимающей во время инфекции и, что очень важно для поддержания надежной иммунной системы ^3,4. Однако экспериментальные доказательства того, что поддерживает эту гипотезу ограничено ^4, а функция избыточного сна во время иммунного ответа остается неясным. Мы использовали комплексный подход к решению этой сложной проблемы, и провели исследования в простую генетическую модель системы, fruitfly дрозофилы. Мы используем стандартный тест для измерения опорно-двигательного поведения и сна у мух, и продемонстрировать, как этот анализ используется для оценки поведения мух infecteD с патогенным штаммом бактерии. Этот анализ также полезен для мониторинга продолжительность жизни в отдельных мухи во время инфекции. Дополнительные меры иммунной функции включают в себя возможность мух для очистки инфекции и активации NFκB, ключевой фактор транскрипции, который играет центральную роль в врожденного иммунного ответа у дрозофилы. Оба результата выживания и бактериальные инфекции во время оформления вместе являются показателями устойчивости и толерантности к инфекции. Сопротивление относится к способности мух для очистки инфекции, в то время как толерантность определяется как способность принимающего ограничить ущерб от инфекции и тем самым выжить, несмотря на высокий уровень возбудителя в рамках системы ^5. В режиме реального времени мониторинг активности NFκB во время инфекции обеспечивает понимание молекулярного механизма выживания во время инфекции. Использование Drosophila в этих анализах просто облегчает генетические и молекулярные анализы снаи иммунного ответа и, как эти две сложные системы взаимно влияют.

протокол

Этот протокол использует две установки (рис. 1) приобрести четыре разных показаний собранных от мух подвергается бактериальной инфекции. Эти мероприятия включают: 1) Режим сна / Пробуждение поведения; 2) выживаемостью, 3) бактериальной нагрузки в лету, и 4) в режиме реального времени измерения NFκB репортер деятельности в естественных условиях. В сочетании с генетическими инструментов, которые имеются у дрозофилы, эти измерения дают механистического понимания молекулярных связей между иммунной функции и поведение.

1. Измерение двигательной активности и сна у мух

1. Установка для измерения двигательной активности и сна у мух, который включает в себя контроль Drosophila деятельности системы (DAM2, Trikinetics), инкубаторы, темная комната, и подготовка экспериментальных животных и деятельностью трубы, была описана ранее ^6. Такой же подход используется здесь, с некоторыми незначительными изменениями.
   1. Освещение инкубатора контролируется инкубатор себя. Поэтому, важно, чтобы синхронизировать настройки времени между компьютером и бизнес-инкубаторов.
   2. Деятельность трубы очищены для повторного использования путем кипячения на горячей плите в деионизированной воде. Небольшое количество моющего средства добавляют в первом кипения, трубы, хорошо промывают и варят в два раза больше. Если пряжа используется для подключения трубки, используемые деятельности труб (с едой, воск, мухи и пряжа) могут быть очищены без предварительного удаления пряжи.
2. До начала эксперимента, место культур, содержащих поздней постановке куколки мухи в инкубаторе в течение трех-четырех дней, чтобы адаптироваться к экспериментальным освещения и других условий окружающей среды. Света: темный или постоянные условия были широко используется для измерения сна поведения. В этом примере мух приспособиться к постоянным светом для устранения влияния циркадных часов на иммунную реакцию и поведение ^2,7,8. Как показано на рисунке 1а , нагрузка 1-4 дневных мух в деятельности Trikinetics DAM2 мониторы, как описано ^6, и запись как минимум за три дня до заражения.

2. Infect мух с патогенный штамм бактерий

1. Протокол, описанный здесь, является специфической для S. marcescens, которые легко выращивать и поддерживать. Протоколы для длительного хранения и культура условия для других видов бактерий будет меняться. С. marcescens хранятся в 15-50% глицерина при температуре -80 ° C. Для подготовки к длительному хранению, смешать 2 объема ночь бактериальной культуры (OD ₆₀₀ = 0,5 - 1,0) на 1 объем автоклавного 50% глицерина в пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге. Это приведет к конечной концентрации глицерина 17%. Хранить трубы при температуре -80 ° C. Для подготовки краткосрочных в использовании источник бактерий, очистить замороженного сырья с 200 мкл стерильной кончика пипетки и выполняют трехсторонний подряд на пластины агара LB. Инкубировать в течение ночи при 37 и Dнапример, C, чтобы получить изолированные колонии. Храните пластины при температуре 4 ° C.
   За день до запланированной инфекции, выбрать одну колонию с пластинки агара LB с 200 мкл стерильной кончика пипетки и погрузите наконечник в пробирку, содержащую 5 мл LB среды. Рост бактерий на ночь, или до 16 часов в инкубаторе шейкере при 37 ° C и 250 оборотов в минуту, пока не достигнет экспоненциальной фазе роста. Измерение концентрации с помощью спектрофотометра при OD _600. Концентрация на этом этапе составляет от 0,5 до 1. Если концентрация слишком высока, субкультура бактерий и расти еще несколько часов, чтобы получить оптимальную концентрацию. Выполните процедуру, вблизи источника пламени. Некоторые штаммы бактерий разработаны для устойчивости к антибиотикам и выращиваются и выбраны соответствующие антибиотики добавляют в среду. С. marcescens (АТСС 8100), не устойчивых к антибиотикам, и поэтому, выращенные в стерильной среде без антибиотиков. Чтобы убедиться в стерильности, сделать макет cultuповторно без бактерий в качестве контроля.
   Решение заражают мухи содержит бактерии (разбавляют до OD ₆₀₀ = 0,1) и 1% пищевых красителей (бриллиантовый синий FCF) в PBS. Приготовьте раствор для инъекций контроль, добавляя эквивалентное количество LB среды, используемой в решении инфекции и 1% голубого пищевого красителя в PBS. Хранить решений на льду.
2. Подготовка стеклянной иглы для инъекций мух. Потяните стеклянных капилляров (OD = 1 мм, ID = 0,58 мм, WPI) в виде штрафа чаевые помощью микропипетки съемник (Narishige). В рассекает микроскопом, использовать тонкий пинцет, чтобы разорвать кончике иглы так, чтобы отверстие достаточно большой, чтобы заполнить с впрыском жидкости с применением всасывающих с помощью шприца, но достаточно маленький, чтобы свести к минимуму ущерб лету во время процесса впрыска. После разрыва кончик, наконечник размер должен быть около 40-50 мкм. Стекло игла прикреплена к 3 мл пластиковый шприц с длиной труб. Поток инъекции среды управляться вручную применения положительного давления или сuction со шприцем. Избегайте загрязнения резиновой трубки с впрыском жидкости, как шприц аппарате используется как для инфекций и контроль инъекций.
3. Anesthetize мух, поставив их на CO ₂ площадки. CO ₂ проходит через герметичный контейнер с водой для увлажнения площадки и уменьшить статическое электричество, которое может затруднить манипуляции мухи на площадку. Inject мух, тыкая стекла иглы в область над щитком спинного грудной клетки. Принятие инъекции среды в лету проверяется пищевой краситель - мухи синей как пищевой краситель распространяется через систему. Доза бактерий, которые получают мухи могут быть определены, как описано в разделе 3 ниже. Некоторые экспериментальные проекты включают контрольную группу, которая получает асептической травмы, вводя мух с окраской PBS и еда, но без бактерий.

3. Определение бактериальной нагрузки

Один из подходов к evaluatinг иммунного ответа на бактериальные инфекции является определение бактериальной инфекции сообщение нагрузки. D. MELANOGASTER большой модели, чтобы определить этот параметр, потому что вся муха может быть гомогенизируют для оценки общей бактериальной номера внутри человека. Смысл этого протокола является то, что при выращивании на твердой среде, таких как бульон Лурия (LB) агара на чашки Петри (LB пластины), одна бактерия образует видимый различимые колонии. Таким образом, путем гомогенизации инфицированных мух в жидкой среде LB, создавая серийные разведения гомогената, а также распространение разбавленный гомогената на LB пластины, количество бактериальных клеток заражения муха может быть определена. Контрольную группу мух вводили PBS окраску и еда, но без бактерий следует использовать для проверки того, что инфекция не была загрязнена другими видами бактерий. Там не должно быть колоний на пластину LB агар в этом состоянии.

1. Автоклав все материалы, которые будут использоваться для этогоПроцедура Перед выполнением реальный шаг гомогенизации. Это включает в себя 200 мкл наконечники вырезать ножницами, LB средства массовой информации, и пестики, используемых для гомогенизации. Подготовка пластин путем заливки автоклавного LB / агаровой среды в 10 см стерильные чашки Петри по крайней мере за 1 день до гомогенизации мух.
2. Anesthetize и собирать мух в 1,5 мл микроцентрифужных труб и труб магазина на льду.
3. Выполните гомогенизации вблизи пламени для предотвращения загрязнения. Контроль гомогенизации содержащие мухи без инфекции рекомендуется, особенно при использовании бактериальных штаммов, таких как S. marcescens, которые не являются устойчивых к антибиотикам. Однородный минимум на 2 группы по 10 мух каждый в экспериментальных условиях. Количество мух использоваться в гомогенат определяется экспериментатором. Некоторые группы использовали одну муху в гомогенат, что полезно для оценки изменений в бактериальной нагрузки между отдельными мухи ^8, в то время как другие использовали от 3-10 мух на гомогенатдля сравнения по генотипу или экспериментальных условиях ^9-12.
   1. Добавить 400 мкл среды LB, чтобы каждый микроцентрифужных пробирку с мухами и гомогенизации с помощью небольшого мотора и пестик (Kontes).
   2. Использование стерилизованных сократить наконечники, серийные разбавления гомогената 1:10 добавлением 20 мкл гомогенизированных LB / бактериальной среде до 1,5 мкл трубки микроцентрифужных содержащие 180 мкл среде LB. Резка наконечники предотвращает блокировку от мух мусора и гарантирует, что соответствующий объем передаются.
   3. Коэффициент разведения определяется опытным путем и зависит от генотипа лету, бактериальный штамм используется, и экспериментальные условия. Для дикого типа мухи инфицированных S. marcescens, используйте разведения 1:10 ² или 1:10 ³ для мух гомогенизируют сразу после заражения, а также разведение 1:10 ⁴ или 1:10 ⁵ для мух гомогенизируют 24 часов после инфицирования.
   4. Добавить 100 мкл LB / бактериальной среды от микрофонаrocentrifuge пробирки, содержащие конечное разведение и распространение среды на LB пластины с использованием стеклянных шариков (VWR), чтобы обеспечить равномерное распределение.
   5. Откажитесь от стеклянных шариков в 100%-ном растворе этанола. Поместите LB пластины в 37 ° C инкубаторе в течение ночи.
   6. В качестве дополнительного шага, используйте системы формирования изображения с визуальными света для получения изображения LB пластины (FluorChem 8900; Альфа Innotech). Подсчет числа колоний либо на самой пластинки или из образа диск с помощью подсчета инструмент Photoshop программного обеспечения (Adobe Photoshop CS3).
   7. Рассчитайте количество колониеобразующих единиц на лету, используя формулу: [N / (N * D * V)] * V, где N = количество колоний, выросших на LB пластины, N = количество мух объединенных в одну микроцентрифужных трубы, D = коэффициент разбавления, и V = объем раствора наносили на каждую пластину, V = начальный объем гомогената.

4. Оцените сна и выживания Длительность после заражения

1. Длямух, которые не собирают для измерения бактериальной нагрузки, продолжить мониторинг поведения для другого 7-10 дней. Выживание продолжительность зависит от генотипа лету, условия окружающей среды, и бактериальных видов, используемых для инфекции.
2. После ~ 10 дней, прекратить эксперимент, загружать и обрабатывать данные о поведении, как описано выше ^6. Insomniac2 заказного программного обеспечения, которая базируется в Matlab, используется для анализа сна параметров. Важно, чтобы устранить мертвые мухи от поведенческого анализа. Как правило, это ограничивает анализов в течение первых суток после заражения, в зависимости от типа инфекции и летать генотипа. Смерть в анализе указывается время вся деятельность считается достигла нуля. Для облегчения анализа выживания, Drosonex, пользовательских программ, написанных в Microsoft Visual C + + 6.0, используется для обработки файлов необработанных данных из системы DAM Trikinetics. Программное обеспечение отчеты в виде файлов Excel, выживание продолжительность каждого лету (в часах), компилирует деятельности DATиз всех мониторов в единую таблицу, и сообщает процентов летит выжить в течение долгого времени, установленного пользователем. Excel файлов, предназначенных для интеграции в другие статистические программные пакеты для дальнейшего анализа.

5. Измерение активности NFκB во время инфекции с помощью люциферазы Reporter

Трансгенные кВ-Люк мух, используемых в этом анализе были получены ранее, как описано в Го и соавт., 2010 ^2. Короче говоря, кВ-Люк репортер содержит 8 повторов NFκB обязательной последовательности, которые были вставлены в промоутер перед люциферазы открытые рамки считывания.

1. Отрегулируйте мух экспериментальных условиях освещения, как описано в разделе 1.2. В этом примере, 1-4 дневных кВ-Люк мух расположены во флаконах, содержащих 5% сахарозы, 2% агар пищи и помещены в постоянный свет (LL) в течение 2 дней, чтобы достичь того же возраста, другие мухи во время инфекции.
2. Подготовка 96-ю лунками для мух. Каждая лунка содержит 2 слоя пищевой среды (рис. 2), верхний слой содержит люциферин, субстрат люциферазы. Добавить 300 мкл 5% сахарозы, 2% агара раствора в каждую лунку и дать затвердеть. Затем добавьте 50 мкл верхнего слоя в каждую лунку, содержащую 5% сахарозы, 1% агара и 2 мМ люциферин (Gold биотехнологии, Inc.) Luciferin концентрациях, используемых для измерения активности репортера в Drosophila менялись в литературе, и были столь же низко как 100 мкм ^13. Концентрация, необходимая может быть определен эмпирически. Между выдачи пищи слои, покрытия пластины с тонкой тканью сетки для облегчения сушки при сохранении стерильности. Пластина должна быть предоставлена ​​возможность полностью высохнуть, до одного часа, для того, чтобы предотвратить мух от застревания в конденсацию капель. Потому что люциферин является светочувствительным, не подвергать плиты на свет больше, чем нужно.
3. Применить прозрачная пленка клея (Top-Seal-A; Perkin Elmer) в 96-а микролуночные перфорированные пластины и с помощью тонкой иглы в количестве 2 отверстия на лунку. Эти отверстия не только позволит воздухообмен в каждую лунку, но и дают возможность обезболить мухи на индивидуальной основе. Используя острый нож и прямые края, ввести разрез между колонками. Это обеспечит простой способ загрузки / выгрузки мух в группах по 8 одновременно.
   Чтобы загрузить мухи в пластину микролуночные, удалить пузырьки из инкубатора и Anesthetize мухи на CO ₂ площадки. Нагрузка летит одна за одной в каждую лунку столбец за столбцом. Если покупать случайно застрял на клей уплотнения, оставьте лету в одиночку, как часто они смогли освободиться без вмешательства. Вернуться пластины микролуночные в инкубатор в LL течение 8-24 часов, чтобы приспособиться к новой среде и потреблять люциферин подложки.
4. Культуры бактерий, С. marcescens и подготовить решение для инфекции, как описано выше.
5. Анестезировать тон летает с помощью пипетки наконечник прикреплен к низким давлением CO ₂ линии. Поместите кончик микропипетки непосредственно над вентиляционными отверстиями сделаны для каждой скважины. Будьте осторожны, чтобы убедиться, что давление CO ₂ является достаточно высоким для обезболивания лету, но достаточно низко, чтобы избежать травмы в лету. В группах из восьми индивидуально передавать друг к лету CO ₂ площадки, и заражают как описано выше. После заражения, возвратитесь каждая муха в исходное хорошо и запечатайте планшет.
6. Измерение люминесценции (TopCount-NXT люминесценции и сцинтилляционных счетчиков; Perkin-Elmer). TopCount счетчика люминесценции содержит укладки кассеты для пластин, что позволяет запрограммированные и автоматизированных показания непрерывно в нужное шагом для любого отрезка времени (обычно до пяти дней). Эта функция доступна не на всех инструментах, и сбор данных для экспериментов с другими инструментами, следовательно, менее частыми. Люминесценции счетчик находится в роОМ с контролируемой температурой и освещением графику. При загрузке плит в укладке кассеты, стек пластин, содержащих мухи между ясно пустые пластины, чтобы мухи получают свет. Программа люминометра в соответствии со спецификацией производителя, чтобы собрать показания каждый час в течение как минимум 24 часов. В этом примере, детекторы запрограммирован на чтение каждой лунки в течение 10 секунд и выразить результат в виде счета (в произвольных единицах) в секунду. Это значение усредненных по 3 показания на лунку. Экспорт файлов данных в электронную таблицу и выполнить стандартный анализ, графические результаты люминесценции.

Результаты

1. Инфекция способствует сну. В этом примере, Canton-S (CS) диких мух типа и мутантных мух не хватает NFκB ген, Смак (Rel ^{E20) 14,} были погружены на две DAM2 деятельности мониторы (п = 32 для каждого генотипа) и инфицированных как описано выше. Мухи были сохранены в постоянном свете, чтобы устранить вл...

Обсуждение

Этот протокол описывает подход, чтобы исследовать, как поведение, особенно во время сна, связан с иммунной параметры ответа. Эти параметры включают бактериальную нагрузку, выживаемостью, и NFκB деятельности как измеряется с помощью люциферазы репортера в естественных условиях. Вме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название материала	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
			Оборудование
Инкубаторы	Персиваль Scientific, Inc	I30BLLC8 I36VLC8	Любой инкубатор может работать запрограммированный свет / температура графики является целесообразным.
Drosophila Activitiy мониторы	Trikinetics Inc, Waltham, MA	DAM2	Как описано в другом месте 6, эта система требует компьютерный интерфейс, программное обеспечение и другие аксессуары.
Pyrex стекло трубы	Trikinetics Inc, Waltham, MA	PGT-5X65
Сцинтилляционных микропланшетов и люминесценции счетчик	Perkin Elmer	TopCount NXT 12 детекторов	Любой читатель планшет, способный обнаруживать люминесценции могут быть использованы для данного типа репортер анализа. TopCount содержит несколько детекторов и автоматизированных укладчик, он способен быть запрограммирован на чтение непрерывно из нескольких пластин.
FluorChem 8900	Альфа Innotech		Визуализация бактериальных культур является обязательным; любой цифровой системы визуализации с возможностью визуального света достаточно.
Микропипетки съемник	Tritech Research, Inc	Narishige PC-10
			Запас
Боросиликатного стеклянные капилляры	Всемирный прецизионного приборостроения Инк	1B100F-4
3 мл шприц	Fisher Scientific	BD 305482
Шприц иглы	Fisher Scientific	BD 305196	18 G - отрезал кончик иглы для предотвращения повреждения трубы.
Силиконовые трубки, ID (0,030 ") OD (0,065") Толщина стенки (0,018 ")	VWR	60985-706	Используется для крепления стеклянных капиллярных игл для шприца
3 Way кран	Американская компания Pharmaseal	K75
Kontes Пелле Пестик Беспроводные Motor	Fisher Scientific	K749540-0000
Kontes Пелле пестиком	Fisher Scientific	K749521-1590
Стеклянные шарики 3мм	VWR	26396-630
Микропланшетов Microlite 1 +	Thermo Scientific	7571	Selecт 96-луночные планшеты, которые подходят для свечения - они должны быть непрозрачными.
TopSeal-A :96-а Микропланшеты	PerkinElmer	6005185	Микропланшетов Пресс-на клейкой пленке уплотнения
D-Luciferin, соли калия	Золото BioTechnology, Inc	LUCNA
			Программное обеспечение
Insomniac2	Доступно по запросу к авторам	обычаю, написал Лесли Эшмор, Ph.D. (Westminster College)	Matlab программное обеспечение, которое используется обычно для анализа сна 2,6,11
Drosonex	Доступно по запросу к авторам	обычаю, написанная Томасом Coradetti (Sidewalk Software)	PC MSVC6 программа, используемая для анализа выживаемости из исходных файлов данные, собранные сTrikinetics системы
Photoshop CS3	Саман		Полезно для получения числа КОЕ / пластина из цифровых изображений (опция)