JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Serebral iskemi Çeşitli hayvan modellerinde inme insanlık durumu simüle etmek için geliştirilmiştir. Bu protokol sıçanlarda iskemik inme için endotelin-1 (ET-1) bağlı orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli anlatılmaktadır. Buna ek olarak, önemli hususlar, avantajlar, ve bu modelin eksiklikler ele alınmaktadır.

Özet

İnme 2009 1, 2 ABD'de tahmini 70000000000 $ maliyetlendirme, sakatlık ve dünyada ölüm üçüncü önde gelen nedenidir bir numaralı nedenidir. Serebral iskemi çeşitli modeller inme insanlık durumu taklit etmek için geliştirilmiştir. Bu orta serebral arter (OSA) alanında 3 iskemik hasardan tüm vuruşları sonucu% 80 o kadar ileri sürülmüştür. 1990'ların başlarında, endotelin-1 (ET-1) 4 kranyotomi sonra MCA yüzeyine doğrudan doğruya bitişik uygulayarak ve iskemi indüklemek için kullanılmıştır. Daha sonra, bu model fokal serebral iskemi üretmek için MCA ET-1, bitişik bir stereotaksik enjeksiyon ile 5 modifiye edilmiştir. Bu modelin ana avantajları hızlı yordamı gerçekleştirmek için yeteneği, ET-1 dozunda değiştirerek arter daralmasına kontrol etme yeteneği teslim, beyne kan tedarik yanı sıra kademeli reperfusi ekstrakraniyal damarların işlemek gerek vardıroranları o daha yakından 5-7 insanlarda reperfüzyon taklit eder. Diğer taraftan, ET-1 model bir kranyotomi için ihtiyaç yanı sıra, inme hacim 8 daha yüksek değişkenlik aşağıdaki dezavantajları vardır. Bu değişkenlik ET-1 infüzyonu sırasında serebral iskemi doğrulamak için lazer Doppler flowmetre (LDF) kullanımı ile azaltılabilir. Strok değişkenliği etkileyen faktörler infüzyon ve ET-1 toplu hassas 6. kullanılan içerir. Başka bir önemli husus da reperfüzyon insan felç sık karşılaşılan bir durumdur ki, ET-1 indüklenmiş MCAO için tıkanma süresinin yakından, insan felç birçok hasta tıkanma 9 gün sonraki saatlik bir süre boyunca kısmi reperfüzyon kalmamıştır taklit olmayabilir 10. Bu protokol ayrıntılı sıçanlarda iskemik inme için ET-1 ile indüklenen MCAO modeli anlatacağız. Aynı zamanda işlem boyunca özel hususlar ve potansiyel sakıncaları dikkat çekecek.

Protokol

Bu protokol Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) tarafından onaylanmış ve uygun olduğunu "Bakım Rehberi ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı" (sekizinci baskı, Ulusal Bilimler Akademisi, 2011) oldu.

Malzemeler

  1. Hayvanlar: Ameliyat sırasında 250-300 g Sekiz haftalık, erkek, Sprague Dawley sıçan (Charles River Çiftlikler, Wilmington, ABD MA).
  2. Anestezi
    1. İnhalasyon anestezi sistemi (VetEquip A.Ş., Pleasanton, CA, USA)
    2. Izofluran anestezi (Baxter İlaç sanayii, Deerfield, IL, ABD)
  3. Stereotaksik sistemi (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Küçük hayvan stereotaksik sistemi
    2. Sıçanlarda Non-rüptürü kulak çubukları
    3. Sıçanlar için gaz anestezi kafa tutucu
  4. Sıcaklık ayarı
    1. BAT-12 mikroprob termometre (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD)
    2. T / POMPA, TP600 Termal battaniye (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, NY, ABD)
  5. Cerrahi aletler
    1. Bisturi sapı ve 11. bıçak, iris forseps, Graefe forseps, tornavida bulldog klemp Retraktörler, 26 ayar eğimli iğne (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA) 10 ul şırınga
    2. Mikromotor matkap ve stereotaksik tutucu, Quintessential Stereotaksik Enjektör (Stoelting, Wood Dale, IL, ABD)
    3. 1,0 mm yuvarlak matkap bur, 1,0 mm ters koni matkap frez (Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
  6. Cerrahi Malzemeleri
    1. 2.4 mm şaft uzunluğu, 21-gauge kılavuz kanül [uzun kaide altında 4mm] ve kanül kukla (Plastik biri Roanoke vidalar 0-80 X 3/32 Montaj, VA, USA)
    2. Jet protez akrilik ve sıvı (Lang Diş Manufacturing Co, Inc, Wheeling, IL, ABD)
    3. 3,0 naylon sütür (Oasis, Mettawa, IL, ABD)
    4. Pamuklu çubuklar, Puralube göz merhemi (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Elektrikli saç kesme makineleri (Oster, Providence, RI, ABD)
  7. Kimyasallar
    1. Endotelin-1 (Amerikan Peptid, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Klorheksidin% 2 (Agrilabs, Joseph, MO, ABD)
    3. Buprenorfin HCl (Hospira Inc, Lake Forest, IL, ABD)
  8. Görselleştirme Ekipmanları
    1. Cerrahi mikroskop (Seiler Instrument ve Üretim; St Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optik aydınlatıcı (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
  9. Lazer Doppler flowmetre sistemi (ADInstruments, Inc, Colorado Springs, CO, ABD)
    1. Standard Kalem Probu
    2. Prob tutucu
    3. Kan Debimetre
    4. LabChart 7 ile PowerLab 4/30
  10. Infarkt hacminin ölçümü
    1. Sıçan beyin matriks (Zivic-Miller Lab., Inc, Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-Triphenyftetrazoliumchlorid (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, ABD), PBS içinde% 0.05 ile seyreltildi
    3. Flatbed tarayıcı (Epson Perfection V30, Epson America, Inc, Long Beach, CA, USA)
    4. Image J yazılımı (ImageJ 1.42q yazılım, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MA, ABD)

1. Ön cerrahi Adımlar

  1. Ameliyat öncesinde, sıçanlar su ve kemirgen chow ücretsiz erişim ile 00:12 aydınlık / karanlık döngüsü altında yer alır.
  2. Anestezi arka pençe çimdik çekme artık sıçan kadar bir indüksiyon odasında% 100 O 2 gaz karışımı içinde% 4 izofluran ile indüklenir.
  3. ASeptik tekniği steril eldiven, steril cerrahi aletler, ve steril cerrahi örtü 11 kullanımı da dahil olmak üzere bu işlem sırasında devam etmelidir.
  4. Baş tacı elektrikli saç makasları ile traş edilir.
  5. Sıçan sıcaklık kontrollü bir çalışma yüzeyi (termal battaniye) üzerinde yatan bir emici ped üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirilir.
  6. Kafa gaz anestetik yüz maskesi yerleştirilmesi ile başlayarak stereotaksik alet içine yerleştirilir.
  7. Sonraki, kulak çubukları yerleştirilir ve sıkılır.
  8. Prosedür anestezi sırasında% 100 O 2 gaz karışımı içinde izofluran% 2 ile korunur.
  9. Yağlayıcı oftalmik merhem hem gözlere uygulanır ve göz kapaklarının cerrahi prosedür sırasında göz kuruma önlemek için kapatılır.
  10. Rektal sıcaklık probu ± 0.5 ° C sıcaklıkta 37 sabit bir hayvansal çekirdek sıcaklığı korumak için eklenir
  11. Stereotaksik sıkıca tutulan baş ilecihaz, cerrahi alanda% 2 klorheksidin ve tuzlu üç kez dönüşümlü olarak temizlenir.

2. Cerrahi Adımlar

  1. Bir neşter kullanılarak, orta hat kesi kulak (üstün ense hattı) arasına gözlerin en kaudal yönleri (nasion) den kalvaryumun örten cilt üzerinde yapılır.
  2. Deri sonra 3 bulldog kelepçeler ile yanal geri çekilir.
  3. Bağ dokusu çoklu yapılar açıkça görülebilir, böylece kuru pamuklu kullanarak kafatası kaldırılır. Bunlar bregma, koronal sütür ve sağ lateral kafa sırtı bulunur. Pamuklu bezler cerrahi alanında kan çıkarmak için kullanılır.
  4. Ameliyat mikroskobu kullanarak, bregma bulunur, ve 1.0 mm boyunca matkap bur bregma de sıfır olana kadar stereotaksik manipulators ayarlanır.
  5. Matkap frez ardından 1.6 mm ön ve bregma lateral 5,2 mm taşınır.
  6. Kafatası nüfuz A frez deliği Cann için delinirula yerleştirme (Şekil 1). Fazla enkaz ve kan sürekli pamuklu kullanılarak temizlenir.

Bu noktada, bir kılavuz kanül sokulabilir (adım 7) ya da bur delik aracılığıyla bir direkt ET-1, enjeksiyon (16 doğrudan adım devam) gerçekleştirilebilir.

  1. 3 montaj vidaları için Sonraki, bur delikleri 1,0 mm ters koni matkap frez (Şekil 1) kullanarak kafatası parsiyel kalınlıkta ile delinir. Bir delik koronal sütür ve sutur lateral 1-2 mm anterior 1-2 mm her frontal kemikte delinir. Bir delik koronal sütür ve kılavuz kanül frez deliği ipsilateral sutur lateral 2-3 mm posterior 2-3 mm kadar paryetal kemikte delinir. Üç 0-80 x 3/32 montaj vidaları bu bur deliklere yerleştirilir ve kanül tutan çimento için destek sağlayacaktır. Vidalar sadece dura matere zarar vermemeye olarak 2 veya 3 tur kadar gelişmiş olmalıdır.
  2. Kılavuz kanül stereotaksik kanül tutucu yerleştirilir ve bregma yer almaktadır.
  3. Kılavuz kanül bregma de sıfır olana kadar stereotaksik manipülatörleri ayarlanır. Kanül 1.6 mm ön ve bregma lateral 5,2 mm uzaklıkta frez deliği taşınır.
  4. Son olarak, kılavuz kanül bregma ventral 4.5 mm nihai uç pozisyon ile bur delik içine indirilir.
  5. Lazer Doppler probu yerleştirilmesi (isteğe bağlı)
    1. LDF kullanarak serebral kan akımını izlemek için, bir prob tutucu diş çimento ile kılavuz kanül takılma öncesinde pozisyon içine yerleştirilebilir.
    2. Prob tutucu tabanı küçük kama şeklinde sekmesi dışında kaide ile aynı hizada kesilir.
    3. Prob tutucu sonra kılavuz kanül posterior ve medial odaklı sekmesini (Şekil 1) ile lateral kafa sırt sadece medial yerleştirilir.
    4. Prob tutucu ve guide kanül diş çimento kullanılarak birbirine yapıştırılmıştır.
  6. Diş çimento sonra yerinde kanül sabitlemek için kullanılır. Çimento her üç vida ile temas halinde olan ve kanül tüm taban çevreler.
  7. Çimento önce kanül tutucu kaldırılması için tamamen kuru olmalıdır. Bu yaklaşık 5 dakika sürer.

Bu adımlardan sonra, cerrahi kesi kapalı olabilir ve kanül kukla kılavuz kanül içine ve vidalı olabilir. Alternatif olarak, ET-1 indüklenmiş MCAO kanül implant ameliyat sonrası iyileşme süresinden sonra sıçan üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu yöntem için, 19 ileri yapılmalı ve adımlar 14-18 daha sonraki bir zamanda gerçekleştirilebilir. Aynı ameliyat sırasında kılavuz kanül implant ve ET-1 enjeksiyon işlemini yapmak için bir sonraki adım 14 yapılmalıdır.

  1. Infüzyon şırınga ET-1 ile yüklenir (PBS içinde 80 uM ile seyreltilmiş), ve daha sonra, stereotaksik enjektörü monte edilir.
  2. İğne ucu kılavuz kanül tarafındaki ucunda sıfır olana kadar stereotaksik manipülatörleri ayarlanır.
  3. İğne ucu kılavuz kenar kanül ventral 17.2 mm arasında bir konuma kılavuz kanül vasıtasıyla azaltılır. Bir kılavuz kanül kullanılmış ise, iğne ucu bregma de sıfırlanır ve bregma ventral bir pozisyon 8,7 mm bur delik boyunca aşağı iner.
  4. 80 uM ET1 3 ul dakika başına 1 ul bir oranda demlenir.
  5. Infüzyon yavaş kaldırılır sonra eksiksiz ve sonra şırınga 3 dakika boyunca yerinde kalır.
  6. Kesi 3.0 naylon dikiş ve kanül kukla kanül içine vidalanır ile kapatılır.
  7. Uygun analjezik dozu (0.05-0.1 mg / kg yani buprenorfin) iyileşme döneminde ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için ameliyat sonrası kullanılmalıdır.
  8. Sıçan cerrahi seti kaldırılır ve yumuşak gıda ve su ücretsiz, kolay erişim, hipotermi önlemek için kuru ve sıcak bir kurtarma alanına yerleştirilir.

Sonuçlar

1. Post-Op nörolojik değerlendirme

Hayvanlarda bilinç kavuşur sonra testler çeşitli denge, kavrama kuvveti, pençe yerleştirerek, postural asimetri ve tırmanma merdiven içeren nörolojik defisitler değerlendirmek için kullanılabilir. Ayçiçeği tohumu görevi motor ve infarkt hacmi 7, 12 arasında anlamlı bir ilişki vardır duyusal fonksiyon brüt değerlendirmesidir. Açılması ve 5 ayçiçeği tohumu tüketen bu görevi sırasında, fareler zamanlanmış. Beş tohum...

Tartışmalar

ET-1 ile indüklenen MCAO düzenli birden sıçan suşları kullanılmıştır deneysel iskemik inme kurulmuş bir modeldir. Bu model 5, 14 kullanırken böyle sıçan suşu, hayvan yaşı, vücut ısısı, anestezi yöntemi ve operatör uzmanlığı gibi birçok değişken, infarkt hacimleri artan değişkenliği yol açabilir. Ancak, bazı araştırmacılar bu modelin avantajları nispeten non-invaziv yaklaşım, ET-1 ile serebral kan akımı doz yanıt, ve bilinçli sıçanlar 14, 15 ET-1 infü...

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği Büyükşehir Güneydoğu Ortaklık (09GRNT2060421), Amerikan Tıp Derneği, ve Florida Klinik ve Translational Bilim Enstitüsü Üniversitesi bağışları ile desteklenmiştir. Adam Mekke bir NIH / NINDS, NRSA predoctoral fellow (F30 NS-060335) 'dir. Robert Regenhardt Hipertansiyon Florida Multidisipliner Eğitim Programı Üniversitesi (T32 HL-083810) den predoctoral burs desteğini aldı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
  1. Hayvanlar: Ameliyat sırasında 250-300 g Sekiz haftalık, erkek, Sprague Dawley sıçan (Charles River Çiftlikler, Wilmington, ABD MA).
  2. Anestezi
    1. İnhalasyon anestezi sistemi (VetEquip A.Ş., Pleasanton, CA, USA)
    2. Izofluran anestezi (Baxter İlaç sanayii, Deerfield, IL, ABD)
  3. Stereotaksik sistemi (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
    1. Küçük hayvan stereotaksik sistemi
    2. Sıçanlarda Non-rüptürü kulak çubukları
    3. Sıçanlar için gaz anestezi kafa tutucu
  4. Sıcaklık ayarı
    1. BAT-12 mikroprob termometre (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD)
    2. T / POMPA, TP600 Termal battaniye (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, NY, ABD)
  5. Cerrahi aletler
    1. Bisturi sapı ve 11. bıçak, iris forseps, Graefe forseps, tornavida bulldog klemp Retraktörler, 26 ayar eğimli iğne (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA) 10 ul şırınga
    2. Mikromotor matkap ve stereotaksik tutucu, Quintessential Stereotaksik Enjektör (Stoelting, Wood Dale, IL, ABD)
    3. 1,0 mm yuvarlak matkap bur, 1,0 mm ters koni matkap frez (Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
  6. Cerrahi Malzemeleri
    1. 2.4 mm şaft uzunluğu, 21-gauge kılavuz kanül [uzun kaide altında 4mm] ve kanül kukla (Plastik biri, Roanoke, VA, USA) ile vidaları 0-80 X 3/32 Montaj
    2. Jet protez akrilik ve sıvı (Lang Diş Manufacturing Co, Inc, Wheeling, IL, ABD)
    3. 3,0 naylon sütür (Oasis, Mettawa, IL, ABD)
    4. Pamuklu çubuklar, Puralube göz merhemi (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, ABD)
    5. Elektrikli saç kesme makineleri (Oster, Providence, RI, ABD)
  7. Kimyasallar
    1. Endotelin-1 (Amerikan Peptid, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Klorheksidin% 2 (Agrilabs, Joseph, MO, ABD)
    3. Buprenorfin HCl (Hospira Inc, Lake Forest, IL, ABD)
  8. Görselleştirme Ekipmanları
    1. Cerrahi mikroskop (Seiler Instrument ve Üretim; St Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optik aydınlatıcı (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
  9. Lazer Doppler flowmetre sistemi (ADInstruments, Inc, Colorado Springs, CO, ABD)
    1. Standart Kalem Probu
    2. Prob tutucu
    3. Kan Debimetre
    4. LabChart 7 ile PowerLab 4/30
  10. Infarkt hacminin ölçümü
    1. Sıçan beyinmatriks (Zivic-Miller Lab., Inc, Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-Triphenyftetrazoliumchlorid (Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO, ABD), PBS içinde% 0.05 ile seyreltildi
    3. Flatbed tarayıcı (Epson Perfection V30, Epson America, Inc, Long Beach, CA, USA)
    4. Image J yazılımı (ImageJ 1.42q yazılım, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MA, ABD)

Referanslar

  1. Stroke--1989. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke. 20, 1407-1431 (1989).
  2. Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
  3. Mohr, J. P., Gautier, J. C., Hier, D., Stein, R. W., Barnett, H. J. M., Stein, B. M., Mohr, J. P., Yatsu, F. M. . Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management. , 377-450 (1986).
  4. Robinson, M. J., Macrae, I. M., Todd, M., Reid, J. L., McCulloch, J. Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat. Neurosci. Lett. 118, 269-272 (1990).
  5. Sharkey, J., Ritchie, I. M., Kelly, P. A. Perivascular microapplication of endothelin-1: a new model of focal cerebral ischaemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 865-871 (1993).
  6. O'Neill, M. J., Clemens, J. A. Rodent models of focal cerebral ischemia. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9 (Unit 9), (2001).
  7. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Exp. Transl. Stroke Med. 1, 8 (2009).
  9. Tomsick, T. A. Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke. J. Vasc. Interv. Radiol. 15, 67-76 (2004).
  10. Olsen, T. S., Lassen, N. A. A dynamic concept of middle cerebral artery occlusion and cerebral infarction in the acute state based on interpreting severe hyperemia as a sign of embolic migration. Stroke. 15, 458-468 (1984).
  11. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
  12. Gonzalez, C. L., Kolb, B. A comparison of different models of stroke on behaviour and brain morphology. Eur. J. Neurosci. 18, 1950-1962 (2003).
  13. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser doppler flowmetry guidance in mice. J. Vis. Exp. (51), e2879 (2011).
  14. Sharkey, J., Butcher, S. P. Characterisation of an experimental model of stroke produced by intracerebral microinjection of endothelin-1 adjacent to the rat middle cerebral artery. J. Neurosci. Methods. 60, 125-131 (1995).
  15. Macrae, I. M., Robinson, M. J., Graham, D. I., Reid, J. L., McCulloch, J. Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences. J. Cereb. Blood Flow Metab. 13, 276-284 (1993).
  16. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96 (1-7), 1084-1096 (2011).
  17. Fisher, M., et al. Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations. Stroke. 40, 2244-2250 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 72N robilimN robiyolojiBiyomedikal M hendisli iCerrahiAnatomiFizyolojiSinir Sistemi Hastal klarskemik inmeEndotelin 1Serebrovask lerbeyinarterinmeokl zyonlazerdoppleyflowmetres anhayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır