Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Modell für ischämischen Schlaganfall mit Laser Doppler Flowmetrie Guidance in Rat

Zusammenfassung

Mehrere Tiermodelle von zerebraler Ischämie wurden entwickelt, um den menschlichen Zustand des Schlaganfalls simulieren. Dieses Protokoll beschreibt die Endothelin-1 (ET-1) induzierte mittlere Zerebralarterie (MCAO) Modell für ischämischem Schlaganfall bei Ratten. Darüber hinaus sind wichtige Erwägungen, Vorteile und Nachteile dieses Modells diskutiert.

Zusammenfassung

Der Schlaganfall ist die häufigste Ursache von Behinderung und dritte führende Todesursache in der Welt, kostet schätzungsweise 70 Milliarden Dollar der Vereinigten Staaten im Jahr 2009 ^{1, 2.} Mehrere Modelle von zerebraler Ischämie wurden entwickelt, um den menschlichen Zustand des Schlaganfalls imitieren. Es wurde vorgeschlagen, dass bis zu 80% aller Striche ergeben sich aus ischämischem Schaden in der mittleren zerebralen Arterie (MCA) Bereich ^3. In den frühen 1990ern, Endothelin-1 (ET-1) ⁴ wurde verwendet, um Ischämie durch die Anwendung direkt angrenzend an die Oberfläche des MCA nach Kraniotomie induzieren. Später wurde dieses Modell ⁵ mit einem stereotaktische Injektion von ET-1 neben dem MCA zu fokaler zerebraler Ischämie zu produzieren geändert. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind die Fähigkeit, die Verfahren rasch durchzuführen, die Fähigkeit zur Arterie Verengung durch Änderung der Dosis von ET-1 unter Kontrolle bringen, keine Notwendigkeit, die extrakraniellen Gefäße mit Blut versorgt das Gehirn als auch schrittweise reperfusi manipulierenauf Raten, dass mehr ahmt die Reperfusion beim Menschen ^5-7. Auf der anderen Seite hat die ET-1-Modell Nachteile, die die Notwendigkeit eines Kraniotomie, sowie höhere Variabilität in Hubvolumen ⁸ umfassen. Diese Variabilität kann durch die Verwendung von Laser-Doppler-Flußmessung (LDF) nach zerebraler Ischämie während ET-1 Infusion verifizieren reduziert werden. Faktoren, Schlaganfall Variabilität beeinflussen, gehören Präzision der Infusion und der Charge des ET-1 verwendet ^6. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass, obwohl ein gemeinsames Auftreten Reperfusion in menschlichen Schlaganfall ist, kann die Dauer der Okklusion für ET-1-induzierten MCAO nicht genau imitieren, dass menschlicher Schlaganfall wo viele Patienten partielle Reperfusion über einen Zeitraum von Stunden bis Tagen haben nach einem Verschluss ^{9, 10.} Dieses Protokoll wird im Detail die ET-1-induzierten MCAO Modell für einen ischämischen Schlaganfall bei Ratten zu beschreiben. Es wird auch die Aufmerksamkeit auf besondere Überlegungen und mögliche Nachteile während des gesamten Verfahrens.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Florida zugelassen und ist in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (achte Auflage National Academy of Sciences, 2011).

Materialien

1. Tiere: Acht-Wochen-alt, männlich, Sprague Dawley Ratten (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) mit einem Gewicht von 250-300 g zum Zeitpunkt der Operation.
2. Anästhesie
   1. Inhalationsanästhesie System (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
   2. Isofluran Narkose (Baxter Pharmazie, Deerfield, IL, USA)
3. Stereotaktische System (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Kleintier stereotaktischen Systems
   2. Non-Ruptur Ohr Bars für Ratten
   3. Gas Anästhesie Kopfhalter für Ratten
4. Temperatur-Regelung
   1. BAT-12 Mikrosonde Thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. T / PUMP, TP600 Thermal Decke (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
5. Chirurgische Instrumente
   1. Skalpellgriff und # 11 Klinge, Iris Pinzette, Graefe Pinzette, bulldog clamp Retraktoren, Schraubendreher, 10 ul Spritze mit 26 Gauge abgeschrägte Nadel (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. Mikromotor Bohrer und stereotaktischen Halter, Quintessential Stereotaktische Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 1,0 mm Rosenbohrer bur, 1,0-mm-Upside Konusbohrer bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
6. Surgical Supplies
   1. Befestigungsschrauben 0-80 X 3/32 mit 2,4 mm Schaftlänge, 21-Gauge Führungskanüle [4mm lang unterhalb des Sockels] und Kanüle dummy (Kunststoffe ein, Roanoke, VA, USA)
   2. Jet Prothesenkunststoff und Flüssigkeit (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
   3. 3,0 Nylonnaht (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   4. Wattestäbchen, Puralube Augensalbe (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
   5. Haarschneidemaschine (Oster, Providence, RI, USA)
7. Chemicals
   1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Chlorhexidin 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
   3. Buprenorphin HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
8. Visualisierung Ausrüstung
   1. Operationsmikroskop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
   2. Fiber Optic Illuminator (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
9. Laser-Doppler-Flussmessung System (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
   1. StAndard Bleistift Probe
   2. Sondenhalter
   3. Blutflußmesser
   4. Powerlab 4/30 mit LabChart 7
10. Messung Infarktvolumen
    1. Rattenhirn Matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) und 0,05% in PBS verdünnt
    3. Flachbett-Scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J Software (ImageJ 1.42q Software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

Ein. Präoperative Steps

1. Vor der Operation werden die Ratten unter einem 12:12 Hell / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Nagetierfutter untergebracht.
2. Narkose mit Isofluran in 4% 100% O _2-Gasgemisch in einer Ansaugkammer, bis der Ratte nicht mehr Abhebungen Hinterpfote Pinch induziert.
3. Aseptischem Technik sollte bei diesem Verfahren einschließlich der Verwendung von sterilen Handschuhe, sterilen chirurgischen Instrumenten, und einem sterilen chirurgischen Abdecktuchs ^{11 aufgehoben.}
4. Die Krone des Kopfes mit elektrischen Haarschneidemaschinen rasiert.
5. Die Ratte wird in Bauchlage auf einem saugfähigen Kissen, das auf einer Temperatur-gesteuerten Bedienfläche (Wärmedecke) platziert.
6. Der Kopf ist in der stereotaktischen Vorrichtung beginnend mit Plazierung des Gases Anästhetikum Gesichtsmaske platziert.
7. Anschließend werden die Stäbe Ohr eingesetzt und verschlossen.
8. Während des Verfahrens Anästhesie mit 2% Isofluran in 100% O _2-Gasgemisch aufrechterhalten wird.
9. Schmiermittel Augensalbe ist mit beiden Augen aufgetragen und die Augenlider geschlossen sind, um Austrocknung Auges während des chirurgischen Verfahrens zu verhindern.
10. Rektale Temperatursonde eingeführt wird, um eine konstante tierischen Kerntemperatur von 37 ± 0,5 ° C zu halten
11. Mit dem Kopf fest in der stereotaktischen stattVorrichtung ist das Operationsgebiet mit alternierenden gereinigt 2% Chlorhexidin und Kochsalzlösung dreimal.

2. Chirurgische Steps

1. Verwendung eines Skalpells wird eine Inzision auf der Haut über dem Schädeldach aus den caudalen Aspekte der Augen (Nasion), um zwischen den Ohren (superior nuchal Linie) hergestellt.
2. Die Haut wird dann seitlich mit 3 Bulldogklemmen eingefahren.
3. Bindegewebe aus dem Schädel mit trockenen Wattestäbchen, so dass mehrere Strukturen deutlich zu erkennen, entfernt werden kann. Dazu gehören Bregma, die Kranznaht und das Recht lateralen Schädelbasis Kamm. Wattestäbchen werden verwendet, um Blut aus dem Operationsbereich entfernt werden.
4. Verwendung des Operationsmikroskops wird Bregma befindet, und die stereotaktische Manipulatoren werden eingestellt, bis der Bohrer rund 1,0 mm Bohrer bei Bregma genullt wird.
5. Der Bohrer Bohrer wird dann auf 1,6 mm anterior und 5,2 mm lateral bregma verschoben.
6. A bur Loch, das den Schädel eindringt für cann gebohrtula Platzierung (Abbildung 1). Excess Schmutz und Blut sind ständig gelöscht wird, Wattestäbchen.

An diesem Punkt kann ein Führer Kanüle eingeführt (Schritt 7) oder eine direkte ET-1 Injektion durch die bur Loch durchgeführt (gehen Sie direkt zu Schritt 16) werden.

7. Anschließend bur Löcher für Befestigungsschrauben 3 sind durch partielle Dicke des Schädels unter Verwendung eines 1,0 mm Bohrer bur umgekehrten Kegels (Abbildung 1) gebohrt. Ein Loch ist in jedem Stirnbeins etwa 1-2 mm ventral der Kranznaht und 1-2 mm seitlich von der Sagittalnaht gebohrt. Ein Loch ist in der Scheitelbein etwa 2-3 mm hinter der Kranznaht und 2-3 mm seitlich von der Sagittalnaht ipsilateral zur Führungskanüle bur Loch gebohrt. Drei 0-80 x 3/32 Befestigungsschrauben sind in diesen bur Löchern platziert und wird die Unterstützung für die Zement-Holding in der Kanüle bieten. Die Schrauben sind nur fortgeschrittene 2 oder 3 Umdrehungen, um nicht die Dura Materie beschädigen.
8. Die Führungskanüle in der stereotaktischen Kanülenhalter platziert und bregma befindet.
9. Die stereotaktische Manipulatoren werden eingestellt, bis die Führungskanüle bei bregma Null ist. Die Kanüle wird der Bohrer Loch befindet 1,6 mm anterior und 5,2 mm lateral bregma verschoben.
10. Schließlich wird die Führungskanüle in die Fräse Loch mit der endgültigen Position der Spitze von 4,5 mm ventral von Bregma abgesenkt.
11. Laser-Doppler-Sonde Platzierung (optional)
    1. Um zerebralen Blutflusses mittels LDF überwachen, kann eine Sonde Halter in Position gebracht werden, bevor die Anbringung der Führungskanüle mit Zahnzement.
    2. Der Sondenhalter Basis getrimmt bündig mit dem Sockel außer für kleine keilförmige Registerkarte.
    3. Die Sonde wird dann Halter platziert posterior der Führungskanüle und nur medial der lateralen Schädelbasis Grat mit der Lasche ausgerichtet medial (Abbildung 1).
    4. Der Sondenhalter und guide Kanüle zusammen mit Zahnzement befestigt.
12. Dentalzement wird dann verwendet, um die Kanüle an Ort und Stelle zu sichern. Der Zement in Kontakt mit allen drei Schrauben und umgibt die gesamte Basis der Kanüle.
13. Der Zement sollte vollständig trocken vor der Entfernung des Kanülenträgers. Dieser Vorgang dauert ca. 5 min.

Nach diesen Schritten kann der Operationswunde geschlossen und die Kanüle Dummy in die Führungskanüle geschraubt werden. Alternativ kann ET-1 induzierten MCAO an der Ratte nach einer Erholungsphase von der Kanüle Implantationschirurgie durchgeführt werden. Für dieses Verfahren aus, muss Schritt 19 weiter durchgeführt werden und die Schritte 14-18 können zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. Um Führungskanüle Implantation und ET-1 Einspritzung während der gleichen Operation durchzuführen, muss Schritt 14 weiter durchgeführt werden.

14. Die Infusionsspritze mit ET-1 geladen (verdünnt auf 80 pM in PBS) und dann montiert in der stereotaktischen Injektors.
15. Diestereotaxischen Manipulatoren werden eingestellt, bis die Spitze der Nadel am Rand der Führungskanüle genullt wird.
16. Die Nadelspitze wird durch die Führungskanüle zu einer Position von 17,2 mm ventral von der Felge des Führungskanüle abgesenkt. Wenn eine Führungskanüle nicht verwendet wird, wird die Spitze der Nadel Bregma genullt und abgesenkt durch den Bohrer in eine Stellung Loch 8,7 mm ventral von Bregma.
17. 3 ul von 80 uM ET1 wird mit einer Rate von 1 ul pro min infundiert.
18. Die Spritze wird an Ort und Stelle für 3 min verlassen nachdem die Infusion beendet ist und dann langsam entfernt.
19. Der Schnitt wird mit 3,0 Nylonnaht und die Kanüle Dummy in die Kanüle verschraubt.
20. Eine Dosis von geeigneten Schmerzmitteln (zB Buprenorphin bei 0.05-0.1 mg / kg) sollte nach der Operation verwendet werden, um Schmerzen und Beschwerden während der Erholungsphase zu minimieren.
21. Die Ratte wird von der OP entfernt und in einem warmen, trockenen Recovery-Bereich auf Unterkühlung zu verhindern, mit kostenlosen, einfachen Zugriff auf weiche Nahrung und Wasser.

Ergebnisse

Ein. Post-Op neurologischen Untersuchung

Nachdem das Tier wieder zu sich, kann eine Vielzahl von Tests verwendet werden, um neurologische Defizite einschließlich Balance, Griffstärke paw Platzierung, Haltungsschäden Asymmetrie und Treppen steigen zu bewerten. Die Sonnenblumenkerne Aufgabe ist eine grobe Einschätzung der motorischen und sensorischen Funktion, die signifikante Korrelation hat mit Infarktvolumen ^{7, 12.} Während dieser Aufgabe werden Ratten Zeitüberschreitung beim ?...

Diskussion

Die ET-1-induzierten MCAO ist ein etabliertes Modell der experimentellen ischämischen Schlaganfall, die regelmäßig in mehreren Rattenstämmen verwendet wird. Viele Variablen, wie Rattenstamm, Alter der Tiere, die Körpertemperatur, Anästhesie-Methode und Betreiber Expertise kann zu einer erhöhten Variabilität Infarkt Volumina führen, wenn man dieses Modell ^{5, 14.} Jedoch haben mehrere Forscher gezeigt, dass Vorteile dieses Modell die relativ nicht-invasive Ansatz Dosis des zerebralen Blutflusses an ET-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Tiere: Acht-Wochen-alt, männlich, Sprague Dawley Ratten (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) mit einem Gewicht von 250-300 g zum Zeitpunkt der Operation. Anästhesie Inhalationsanästhesie System (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA) Isofluran Narkose (Baxter Pharmazie, Deerfield, IL, USA) Stereotaktische System (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) Kleintier stereotaktischen Systems Non-Ruptur Ohr Bars für Ratten Gas Anästhesie Kopfhalter für Ratten Temperatur-Regelung BAT-12 Mikrosonde Thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) T / PUMP, TP600 Thermal Decke (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA) Chirurgische Instrumente Skalpellgriff und # 11 Klinge, Iris Pinzette, Graefe Pinzette, bulldog clamp Retraktoren, Schraubendreher, 10 ul Spritze mit 26 Gauge abgeschrägte Nadel (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) Mikromotor Bohrer und stereotaktischen Halter, Quintessential Stereotaktische Injector (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) 1,0 mm Rosenbohrer bur, 1,0-mm-Upside Konusbohrer bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA) Surgical Supplies Befestigungsschrauben 0-80 X 3/32 mit 2,4 mm Schaftlänge, 21-Gauge Führungskanüle [4mm lang unterhalb des Sockels] und Kanüle dummy (Kunststoffe ein, Roanoke, VA, USA) Jet Prothesenkunststoff und Flüssigkeit (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA) 3,0 Nylonnaht (Oasis, Mettawa, IL, USA) Wattestäbchen, Puralube Augensalbe (Fisher Wissenschaftlichec, Pittsburgh, PA, USA) Haarschneidemaschine (Oster, Providence, RI, USA) Chemicals Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA) Chlorhexidin 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA) Buprenorphin HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA) Visualisierung Ausrüstung Operationsmikroskop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA) Fiber Optic Illuminator (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA) Laser-Doppler-Flussmessung System (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA) Standard Bleistift Probe Sondenhalter Blutflußmesser Powerlab 4/30 mit LabChart 7 Messung Infarktvolumen RattenhirnMatrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA) 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) und 0,05% in PBS verdünnt Flachbett-Scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA) Image J Software (ImageJ 1.42q Software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)