Farelerde parabiyoz: Detaylı Bir Protokol

Özet

Iki organizmanın Parabiyotik birleştiren ortak bir dolaşım sisteminin gelişmesine yol açar. Bu protokol, bir vahşi tip fare ve bir kurucu GFP-ifade eden fare arasında bir Parabiyotik bir bağlantı oluşturmak üzere cerrahi adımları açıklar.

Özet

Parabiyoz kan dolaşımı paylaşımı sağlayan iki organizmanın bir cerrahi birliği. İki hayvan cildi takılması iltihap bölgesinde de mikro-damar oluşumunu teşvik eder. Parabiyotik ortakları dolaşan antijenleri paylaşmak ve böylece olumsuz bağışıklık reaksiyonu ücretsizdir. İlk 1864 ¹ Paul Bert tarafından açıklanan, parabiyoz cerrahi hayvan hayatta ² geliştirmek için 1933 yılında Bunster ve Meyer tarafından rafine oldu. Mevcut protokolde, iki farenin cerrahi Bunster ve Meyer teknik bir modifikasyonu takip birleştirilir. Hayvanlar dikildi deride gerginliği önler sağlam destek sağlayan deri eki ardından dirsek ve diz eklemleri vasıtasıyla bağlanır. Burada, ayrıntılı olarak, vahşi tip (WT) fare fare için her yerde bulunan bir GFP ifade eden bir birleştirme Parabiyotik açıklar. Kan dolaşımdaki iki hafta işleminden sonra, çift ayrılır ve GFP pozitif hücrelerin akış sitometrik analizi ile tespit edilebilirWT fare iyon. Kan kimerizmi Bir diğer bir hayvandan elde dolaşan hücrelerin katkısını incelemek sağlar.

Giriş

Parabiyoz, cerrahi iki organizmaların katılmadan, ilk paylaşılan dolaşım sistemlerini incelemek için bir model geliştirmek için bir yol olarak Paul Bert tarafından 1864 yılında tanımlanan ve iki sıçanların ¹ deri ve kas duvarların katılma oluşuyordu. Parabiyoz ³ inflamasyon bölgesinde mikro-damar oluşumunu teşvik eder ve bu, hipofiz bezi ve yumurtalıklar hem de hipertansiyon ⁴ böbreğin rolü arasındaki hormonal iletişim gibi fizyolojik çalışmalarda çeşitli uygulamalar, etti. Ayrıca, bu da neovaskülarizasyon ^{5, 6,} hematopoetik kök hücre göçü ve lenfosit trafiği ^7, hem de tümör metastazı ^8,9 iltihaplı ya da kök hücreler dolaşımdaki rolü ve kinetik progenitör hücrelerin toplanmasını ve entegrasyon araştırmak için istihdam edilmiştir ve nörodejeneratif hastalıklar ^10.

Parabiyoz yalanlar önemli bir avantajıolması ile ortak hayvan bir bağışıklık tepkisini tetikleme olmadan hücre göçü ve neovaskülarizasyonu sağlayan ortak dolaşım antijenleri paylaşır. Daha da önemlisi, Weissman et al. Erkek ve dişi fareler arasındaki parabiyoz göstermiştir ^11, antikor anti-HY oluşumuna yol açmaz.

Paul Bert tarafından tarif edilen orijinal protokole olarak iki hayvan, deri ve kas duvar ¹ arasında bir bağlantı aracılığıyla birbirine katıldı. Bu yöntem, bununla birlikte, hayvanlar için önemli bir yük sebep nedeniyle yaranın enfeksiyona yüksek ölüm oranı ile sonuçlanmıştır. O zamandan beri parabiyoz tekniği en baskın 1933 ² Bunster ve Meyer tarafından önerilen protokol olmak üzere çeşitli gruplar tarafından revize edilmiştir. Onların yöntem hayvanlar için daha iyi destek ve daha az ağrı izin, skapula eklem, vücut boşluklarına ve cilt birleştirme dahil. Aynı zamanda, yeni bir yöntem minimal post-operatif bakım ve uygulamasına önemli sonuçlandırasyon ölüm oranları azalmıştır. Burada tarif edilen protokol daha az invaziv ve sıkı bir birleştirme sağlayan Bunster ve Meyer teknik bir modifikasyonudur. Yani, fareler, dirsek ve diz eklemleri gibi deri yoluyla bağlanır. Bu nedenle, birleştirme önler deri uzatma ve daha az ağrı ve komplikasyonlara neden olabilir. Burada fare ifade, yapısal GFP için vahşi tip (WT) yetişkin fare birleştirilmesi tarif eder. Biz ameliyattan iki hafta sonra paylaşılan bir dolaşım sistemi oluşturmak için bu cerrahi yöntemin etkinliğini gösteren kan kimerizmin% 50 elde edebilirsiniz olduğunu göstermektedir.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için UCLA hayvan bakımı ve kullanımı komitesi kuralları ve Sağlık Rehberi, National Institutes göre yapılmıştır. , Aşağıda tarif edilen prosedüre süresi başından sonuna kadar yaklaşık olarak 45-60 dk.

1.. Cerrahi Alan Hazırlık

1. Temiz bir hayvan ameliyathane prosedürü uygulayın.
2. Ekipman: izofluran Vaporizer, ısıtma pedi ile Gaymer T Pompa.
3. Steril aletler: iki kavisli forseps, ince makas, iğne tutucu.
4. Steril eldiven tüm işlem sırasında kullanılmalıdır.

2. Hayvanların hazırlanması

1. Aynı kafese benzer ağırlık ve boyut aynı genetik kökenli iki erkek veya dişi fareler, koyun ve uyumlu yaşamasını sağlamak için en az iki hafta boyunca monitör. Erkek fareler nedeniyle daha az agresif davranışa tercih edilir.
2. Tarafından hayvanların anestezisiizofluran buharlaştırıcı kullanılmıştır. Bir Posi-Seal İndüksiyon Odası Yeri fareler izofluran buharlaştırıcı (4-5% v / v) bağlı. Anestezinin sonra, izofluran (% 1.5-2 v / v) bağlı bir burun konisi ile işlem boyunca anestezi kürk traş alanına hayvan transferi ve korumak. Kuru göz önlemek için bir Q-ucu ile oftalmik merhem sürün.
3. Sırtüstü pozisyonda üzerindeki hayvan yerleştirin. Iyice doğru yaklaşık 1 cm 1 cm diz altında dirseğin başlayarak yerleştirilir ve sol fare sağ tarafına yerleştirilmiş fare sol tarafını tıraş.
4. Aseptik iyice alkol mendil ardından Betadinede batırılmış mendil ile (2-3x) silerek traş alanlar hazırlamak. Steril bir ped ile kaplı bir ısıtılmış yüzey üzerinde fareler yerleştirin.
5. Analjezi için, sırasıyla, 10 mg / kg ve 0.1 mg / kg 'lık bir dozda, karın içinden ya da deri altından Carprofen Buprenorfin ve yönetmek.
6. Bir ile, arka arkaya, kendi taraflarında hayvanları yerleştirinyukarı bakacak şekilde traş alanları djacent. Cerrahi alanın herhangi bir bulaşmayı önlemek için, sadece operasyon bölgesini açıkta bir steril örtü ile fareler kapağı. Ameliyatı yaparken steril kalmak için küçük bir örtü açılış oluşturun. Biz videoya sırasında daha iyi bir görüş için drape pencere büyük yaptı.

3. Parabiyoz

1. Keskin bir makas kullanılarak, dirsek üzerinde 0.5 cm, her hayvan başlayan traş yanlarına diz ekleminin altında 0.5 cm (Şekil 1) tüm şekilde uzunlamasına cilt insizyonu gerçekleştirin. Kesi ardından, hafifçe kavisli bir forseps bir çift ile cildi tutarak deri altı fasya cildi ayırmak ve ücretsiz cilt 0,5 cm oluşturmak için ikinci bir çift ile fasya ayrı. Tüm kesi boyunca bu ayrımı gerçekleştirin.
2. Diğer doğru olekranon bir hayvanın sol likasyon olarak, olekranon takarak birleştirme başlayın. Olecranons ve diz eklemleri hem de açıkça ayırt şu th vardıre cilt kesisi. Katılmadan kolaylaştırmak için, ilk fare dirsek eğmek ve olekranonun altında emilemeyen 3-0 dikiş iğnesi. Benzer şekilde, ikinci fare dirsek eğmek ve bunun altında aynı dikiş geçmek. Bir çift cerrahi düğüm tarafından sıkıca eklemleri takın.
3. Aynı prosedür izlenerek, diz eklemleri bağlayın.
4. Eklemlerin eki sonra, sürekli bir emilebilir 5-0 Vicryl dikiş diz doğru dirsek ventral başlayan iki hayvanların deri bağlayın. Cilt yırtılması ve ayrılmasını önlemek için, dirsek ve diz çevresindeki alanda cildin sıkı bir dikiş tekniği gerçekleştirin. Ventral deri eki tamamlandıktan sonra, bir çift cerrahi düğüm gerçekleştirin. Yüzüstü pozisyonda fareler yerleştirin ve çift cerrahi düğüm ile biten dikiş Dorsalinden devam ediyor. Dikiş sürekliliğini doğrulama ve açıklıklar eksikliğini onaylamak.
5. DEHY önlemek için deri altından her bir farenin% 0.9 NaCl, 0.5 ml yönetmedration.

4. Ameliyat sonrası Kurtarma

1. Kurtarma kadar ısıtılmış pad üzerinde hayvan tutun.
2. Kurtarma sonra, analjezikler karprofen ve buprenorfin sağlar. (Adım 2.5) yukarıda tarif edilen ile aynı dozlarda, 48 saat boyunca, sırasıyla periton içine ya da deri altından her 24 ve 12 saat tekrarlayın. Gibi sallayarak olarak ağrı ve sıkıntı belirtileri için hayvan izleyin, kuyruk uyuşukluk, çiğneme, vb bakım eksikliği, iki hafta boyunca günde geri kemerli.
3. Profilaktik, 2 mg sülfa / ml 0,4 mg bakteriyel enfeksiyonları önlemek için 10 gün boyunca / ml Döşeme onların su şişesi sulfamethoxazole / Trimetoprim oral süspansiyon ile fareler tedavi.
4. Evin yatak malzemesi aspirasyonu önlemek için monolitik yatak malzeme (örn. kağıt havlu ya da emici steril ped) ile temiz bir kafes içinde her Parabiyotik çifti. Onların baş up ile sternum yatma korumak mümkün olduğunda bir yatak dolu kafes hayvanları dönün. Gerginlik en aza indirmek içinParabiyotik varlığına ayarlanması sırasında gıda ulaşma, kafes katta nemlendirilmiş gıda pelet yerleştirin. Yuvalama malzeme sağlayın. 1-2 hafta içinde Parabiyotik farenin cerrahi eşleştirilmiş ön ve hind-bacaklarda gezinmeye yeteneği var.
5. Kan kimerizmi ameliyatı takiben 10-14 gün oluşur.

5. Onay ve Ters Prosedürü

1. Iki hafta kan şimerizmi (Şekil 3) Onaylamak için akış sitometri analizi için her bir fare kuyruk damarlar kan çizdikten sonra.
2. Akış sitometrik analizi için kan işleme: 10 mM EDTA, 500 ul kan 2-3 damla seyreltilir. (PBS içinde seyreltilmiş)% 2 dekstran 500 ul ekleyin, iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 5 dakika için 1200 rpm'de bir yeni bir tüp, bir dönüş olarak süpernatant aktarın ve akış sitometrik analiz için PBS içinde pelet hücreleri (ya da diğer tamponu) yeniden süspanse edin.
3. Deneysel tasarım bağlı olarak, Parabiyotik çifti ayrılabilensonraki zaman puan t. Bizim deneyim, biz herhangi bir komplikasyon olmadan 9 ay boyunca parabiosed çiftleri korumuştur.
4. Steril cerrahi yüzeyde ters prosedürü uygulayın. (Adım 2.2) yukarıda tarif edildiği gibi, bir buharlaştırıcı izofluran (% 4-5) bağlı olan ve% 1.5-2 izofluran ile anestezi bakımı bir indüksiyon odasına yerleştirerek fareler anestezi.
5. (2.3, 2.4 adım) ilk dikiş çevreleyen alandan saç çıkarın ve aseptik olarak yukarıda tarif edildiği gibi traş alanları hazırlar.
6. Analjezi için, sırasıyla, 10 mg / kg ve 0.1 mg / kg 'lık bir dozda, karın içinden ya da deri altından Carprofen Buprenorfin ve yönetmek.
7. (Adım 2.6) yukarıda tarif edildiği gibi steril bir örtü ile cerrahi alanı kapsamaktadır.
8. Keskin bir makas kullanarak, yanal sütür boyunca uzunlamasına bir kesi yoluyla fareler ayırmak ve hafifçe kavisli bir forseps bir çift ile iki farelerin arasında yeni oluşturulan fasya ayırmak. Eklemleri ayırmak için, ameliyat dikiş ipliğinin knot kesilmişOnları bağlayan. Pürüzsüz yüzeyler elde ve emilebilir sürekli 5-0 kaplanmış vicryl ile cilt yeniden takmak için kesi boyunca cildi keserek.
9. Kaybını önlemek için, her fareye deri altından% 0.9 NaCl, 0.5 ml yönetmek. Kurtarma kadar ısıtılmış pad üzerinde hayvan tutun.
10. Çıktıktan sonra, 48 saat süre ile, her 12 saat analjezik uygulama, karprofen (10 mg / kg), her 24 saat ve buprenorfin (0.1 mg / kg) ile tekrar edin.
11. Bakteriyel enfeksiyonlar 10 gün boyunca kendi su şişesi içinde sulfamethoxazole / Trimetoprim oral süspansiyon (2 mg sülfamidler / ml 0,4 mg / ml Döşeme) ile fare tedavi önlemek için.

Sonuçlar

İki organizmaların parabiyoz beklenen sonucu ortak bir kan dolaşımı için her hayvanın dolaşım sisteminin eşit katkısı (Şekil 2). Bir kolaylıkla akış sitometrik analizi ile parabiosed WT ve GFP pozitif farelerin kan başarılı dengede doğrulayabilir. Burada, venöz kan ameliyattan sonraki 2 hafta içinde, her iki parabionts kuyrukları elde edilmiştir ve (eritrositler hariç), periferal kan hücreleri için damıtılır. Parçalanmış hematopoetik kaynaklı hücre fraksiyonu, daha son...

Tartışmalar

Burada tartışılan parabiyoz yöntem, düşük mortalite oranları asgari teknik zorluklar ve sonuçlar sunar. Ve dirsek, diz eklem bağlanma Bunster ve Meyer tekniğin önemli bir gelişmedir. Bununla birlikte, bu prosedür, böylece ameliyat boyunca steril koşullar bakım şarttır invaziv kalır. Ayrıca cerrahi bölgenin enfeksiyonu önlemek için, bu parabiosed hayvanların antibiyotik kombinasyonu almak ve düzenli olarak takip edilmesi önemlidir. Sağlam bir destek sağlamak ve ağrıyı önlemek için, dirse...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of equipment	Company	Catalog number
Isoflurane-Phoenix	Clipper	NDC 57319-559-06
Posi-Seal Induction Chamber	Molecular Imaging Products	AS-01-0530-SM
Portable Anesthesia System	Molecular Imaging Products	AS-01-0007
Gaymer T Pump	Gaymar Industries, Inc	TP650
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp	TP-22G
Curved forceps	Roboz	RS-5101
Scissors	Fine Science Tools (FST)	FST 14063-09
Needle holder	FST	FST 12501-13
Electrical shaver	Oster	Golden A5