Parabiose chez la souris: un protocole détaillé

Résumé

Parabiotic jonction de deux organismes entraîne le développement d'un système de circulation commun. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes chirurgicales pour former une connexion entre parabiotic une souris de type sauvage et une souris exprimant la GFP constitutive.

Résumé

Parabiose est une union chirurgicale de deux organismes permettant le partage de la circulation sanguine. Fixation de la peau de deux animaux favorise la formation de microvaisseaux au niveau du site de l'inflammation. Partenaires Parabiotic partagent leurs antigènes circulants et sont donc libres de la réaction immunitaire indésirable. D'abord décrit par Paul Bert en 1864 ^1, la chirurgie parabiose a été affinée par Bunster et Meyer en 1933 pour améliorer la survie des animaux ^2. Dans le protocole courant, deux souris sont joints par voie chirurgicale suite à une modification de la technique et Bunster Meyer. Les animaux sont reliés par des articulations du coude et du genou, suivie par la fixation de la peau permettant un soutien ferme qui empêche de pression sur la peau suturée. Ici, nous décrivons en détail la parabiotic assemblage d'un GFP omniprésent exprimant la souris à un type sauvage (WT) de la souris. Deux semaines après l'intervention, la paire est séparée et les cellules positives à la GFP peut être détectée par analyse par cytométrie de flux circulant dans le sangion de la souris WT. Le chimérisme de sang permet d'examiner la contribution des cellules circulantes d'un animal à l'autre.

Introduction

Parabiose, rejoindre le chirurgicale de deux organismes, a été décrite pour la première en 1864 par Paul Bert comme un moyen de développer un modèle pour étudier les systèmes circulatoires partagées et composée de l'assemblage de la peau et des parois musculaires de deux rats ^1. Parabiose favorise la formation de microvaisseaux au niveau du site de l'inflammation et ³ a eu de nombreuses applications dans des études physiologiques, telles que la communication entre hormonal de la glande pituitaire et les gonades, ainsi que le rôle de l'hypertension rénale chez ^4. Il a été en outre utilisé pour étudier le recrutement et l'intégration des cellules progénitrices dans la néovascularisation ^5, la migration des cellules souches hématopoïétiques ^6, et le trafic des lymphocytes ^7, ainsi que le rôle et la cinétique de cellules circulantes inflammatoires ou souches dans la métastase de la tumeur ^8,9, et les maladies neurodégénératives ^10.

Un avantage important du mensonge de parabioseen ce que les animaux en couple part antigènes circulants communs, ce qui permet la migration cellulaire et la néovascularisation, sans déclencher une réaction immunologique. Fait important, Weissman et al. Ont montré que parabiose entre les souris mâles et femelles ne conduit pas à la formation d'anticorps dirigés contre HY ^11.

Dans le protocole original décrit par Paul Bert les deux animaux ont été réunis par le raccordement de la peau et des parois musculaires ^1. Toutefois, cette méthode a provoqué souche importante pour les animaux et a abouti à une forte mortalité due à une infection de la plaie. Depuis lors, la technique de parabiose a été révisé par plusieurs groupes avec le plus prédominant étant le protocole proposé par Bunster et Meyer en 1933 ^2. Leur méthode a inclus l'assemblage des joints de l'omoplate, des cavités du corps et de la peau, ce qui permet un meilleur soutien et moins de douleur pour les animaux. Dans le même temps, la nouvelle méthode a donné lieu à des soins et signifi post-opératoire minimalsignificative diminution des taux de mortalité. Le protocole décrit ici est une modification de la technique Bunster Meyer et qui est moins invasive et permet de rejoindre plus ferme. À savoir, les souris sont reliés par des articulations du coude et du genou ainsi que la peau. Cette jonction empêche l'extension de la peau et donc provoque moins de douleur et les complications. Nous décrivons ici la jonction d'un type sauvage (WT) de souris adulte à une GFP constitutive exprimant la souris. Nous montrons que deux semaines après la chirurgie, nous pouvons réaliser 50% de chimérisme de sang démontrant l'efficacité de cette procédure chirurgicale pour créer un système de circulation commun.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été réalisés selon les directives de protection des animaux et l'utilisation du comité de l'UCLA et les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La durée de la procédure décrite ci-dessous est d'environ 45 à 60 min, du début à la fin.

Une. Préparation du champ opératoire

1. Exécuter la procédure dans une salle de chirurgie des animaux propres.
2. Équipement: isoflurane vaporisateur, Gaymer T Pompe avec coussin chauffant.
3. Outils stériles: deux pinces, ciseaux courbes fines, porte-aiguille.
4. Des gants stériles doivent être utilisés au cours de toute la procédure.

2. Préparation des animaux

1. Placez deux souris mâles ou femelles, de même fond génétique, de poids et de taille similaire dans la même cage et surveiller pendant au moins deux semaines afin d'assurer une cohabitation harmonieuse. Des souris femelles sont préférés en raison de leur comportement moins agressif.
2. Anesthésier les animaux parl'aide d'un vaporisateur à l'isoflurane. La place les souris dans une chambre d'induction Posi-Seal connectés au vaporisateur isoflurane (4-5% v / v). Une fois anesthésie est induite, transférer l'animal vers la zone de rasage de la fourrure et de maintenir l'anesthésie pendant toute la procédure par l'intermédiaire d'un cône de nez relié à l'isoflurane (1,5 à 2% v / v). Appliquer une pommade ophtalmique avec un Q-tip pour éviter la sécheresse des yeux.
3. Placez l'animal sur la position couchée. Bien raser le côté gauche de la souris placé sur la gauche et le côté droit de la souris placé sur la droite, en commençant à environ 1 cm au-dessus du coude à 1 cm au-dessous du genou.
4. Préparer de manière aseptique les zones rasées en essuyant soigneusement (2-3x) avec des lingettes de Betadine imbibé suivis par des tampons d'alcool. Placez la souris sur un coussin chauffant recouvert par une compresse stérile.
5. Pour l'analgésie, administrer Carprofen et buprénorphine par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée à une dose de 10 mg / kg et 0,1 mg / kg respectivement.
6. Placez les animaux de leur côté, dos à dos, avec undjacent zones rasées vers le haut. Pour éviter toute contamination de la zone chirurgicale, couvrir les souris avec un champ stérile exposer uniquement la zone d'opération. Créer une petite ouverture de champ à rester stérile lors de l'exécution de la chirurgie. Nous avons fait la fenêtre de champ importante pour avoir une meilleure vue pendant l'enregistrement vidéo.

3. Parabiose

1. L'utilisation d'un ciseau tranchant, effectuer des incisions longitudinales de la peau sur les côtés rasés départ de chaque animal à 0,5 cm au-dessus du coude tout le chemin à 0,5 cm en dessous de l'articulation du genou (figure 1). À la suite de l'incision, détacher doucement la peau contre le fascia sous-cutané en maintenant la peau vers le haut avec une paire de forceps incurvés et séparer le fascia avec une deuxième paire de créer 0,5 cm de peau libre. Effectuez cette séparation le long de toute incision.
2. Commencez l'assemblage en fixant l'olécrane gauche d'un animal à droite olécrane de l'autre. Les deux olecranons et les articulations du genou sont clairement distingués e suivantee incision cutanée. Pour faciliter l'assemblage, plier le coude de la première souris et passer l'aiguille de l'3-0 suture non résorbable sous l'olécrane. De même, plier le coude de la deuxième souris et passer le même suture dessous. Fixez solidement joints par un noeud chirurgical double.
3. Raccorder les articulations du genou suivant la même procédure.
4. Après la fixation des joints, relier la peau des deux animaux avec un absorbable 5-0 Vicryl surjet partir le ventre du coude vers le genou. Pour éviter une rupture de la peau et de la séparation effectuer une fermeture étanche de suture de la peau dans la zone autour des coudes et les genoux. Une fois l'attache ventral de la peau a été achevée, effectuer un noeud chirurgical double. Placez la souris en position couchée et continuer la dorsale de suture se terminant par un noeud chirurgical double. Vérifier la continuité du fil de suture et de confirmer l'absence d'ouvertures.
5. Administrer 0,5 ml de NaCl à 0,9% par voie sous cutanée à chaque souris pour empêcher déshyréhydratation.

4. Récupération postopératoire

1. Gardez les animaux sur tapis chauffé jusqu'à la guérison.
2. Après récupération, de fournir des analgésiques carprofène et la buprénorphine. Répéter par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée toutes les 24 heures et 12, respectivement, pendant 48 heures aux mêmes doses décrites ci-dessus (étape 2.5). Surveillez les animaux des signes de douleur et de détresse telles que des tremblements, de la léthargie, de mâcher de la queue, dos voûté, absence de toilettage, etc jour pendant deux semaines.
3. Prophylactique, traiter des souris avec la suspension orale sulfaméthoxazole / triméthoprime dans leur bouteille d'eau 2 mg sulfamide / ml 0,4 mg / ml les garnitures pendant 10 jours pour prévenir les infections bactériennes.
4. Maison chaque paire parabiotic dans une cage propre d'une litière monolithique (par exemple, de serviettes en papier ou un tampon stérile absorbant) pour éviter l'aspiration de litière. Remettre les animaux à une literie garni cage quand ils sont en mesure de maintenir décubitus sternal avec leur tête. Pour réduire au minimum la déformationd'atteindre pour la nourriture tout en s'adaptant à l'existence parabiotic, placer les boulettes de nourriture humides sur le sol de la cage. Fournir du matériel de nidification. Dans 1-2 semaines souris parabiotic ont la possibilité de déambuler normalement antérieurs et membres postérieurs chirurgicalement appariés.
5. chimérisme de sang se produit 10-14 jours après la chirurgie.

5. Confirmation et de la procédure n º

1. Après deux semaines prélever du sang à partir des veines de la queue de chaque souris pour l'analyse de cytométrie de flux pour les chimérisme sanguin (Figure 3).
2. traitement de sang pour analyse par cytométrie de flux: diluer 2-3 gouttes de sang dans 500 ul de 10 mM d'EDTA. Ajouter 500 ul de 2% de dextran (dilué dans du PBS), bien mélanger et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube, centrifugation à 1200 rpm pendant 5 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS (tampon ou autre) aux fins d'analyse par cytométrie en flux.
3. Selon la conception expérimentale, la paire parabiotic peut être séparée d'unet points de temps ultérieurs. Dans notre expérience, nous avons maintenu paires parabiosed jusqu'à 9 mois sans aucune complication.
4. Effectuer la procédure inverse sur une surface chirurgical stérile. Anesthésier les souris en les plaçant dans une chambre d'induction reliée à un évaporateur de l'isoflurane (4-5%) et de maintenir l'anesthésie avec de l'isoflurane 1,5 à 2%, comme décrit ci-dessus (étape 2.2).
5. Enlever les poils de la zone entourant le fil de suture initiale et de manière aseptique préparer les zones rasées tels que décrits ci-dessus (étapes 2.3, 2.4).
6. Pour l'analgésie, d'administrer le carprofène et buprénorphine par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée à une dose de 10 mg / kg et 0,1 mg / kg, respectivement.
7. Couvrir zone chirurgicale avec un champ stérile comme décrit ci-dessus (étape 2.6).
8. Utilisation de ciseaux, séparer les souris à travers une incision longitudinale le long de la suture latérale et doucement détacher le fascia nouvellement formée entre les deux souris avec une paire de forceps incurvés. Pour séparer les articulations, couper les noeuds de la sutureles reliant. Coupez la peau le long de l'incision pour atteindre des bords lisses et rattacher la peau avec un enduit continu 5-0 suture Vicryl absorbable.
9. Pour prévenir la déshydratation, à administrer 0,5 ml de NaCl à 0,9% par voie sous cutanée à chaque souris. Gardez les animaux sur tapis chauffé jusqu'à la guérison.
10. Après la récupération, répéter l'administration d'analgésiques, carprofène (10 mg / kg) toutes les 24 heures et la buprénorphine (0,1 mg / kg) toutes les 12 heures pendant 48 heures.
11. Pour prévenir les infections bactériennes traitent souris avec la suspension orale sulfaméthoxazole / triméthoprime (2 mg sulfamide / ml 0,4 mg TRIM / ml) dans leur bouteille d'eau pendant 10 jours.

Résultats

Le résultat attendu de parabiose de deux organismes est la contribution égale de système circulatoire de chaque animal à une circulation sanguine commune (Figure 2). On peut facilement vérifier le succès de l'équilibration du sang de l'parabiosed des souris WT et positif GFP par analyse par cytométrie de flux. Ici, le sang veineux a été obtenue à partir des queues des deux parabionts à 2 semaines après l'intervention chirurgicale et a été fractionné pour les cellules du sang ...

Discussion

La méthode de parabiose discuté ici présente des difficultés et des résultats techniques minimales des taux de mortalité faibles. La fixation des articulations du genou et du coude constitue une amélioration importante de la technique et Bunster Meyer. Toutefois, la procédure invasive reste donc le maintien de conditions stériles pendant toute la chirurgie est impérative. Pour prévenir l'infection du site chirurgical, il est important que les animaux reçoivent parabiosed une combinaison d'antibiotiqu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of equipment	Company	Catalog number
Isoflurane-Phoenix	Clipper	NDC 57319-559-06
Posi-Seal Induction Chamber	Molecular Imaging Products	AS-01-0530-SM
Portable Anesthesia System	Molecular Imaging Products	AS-01-0007
Gaymer T Pump	Gaymar Industries, Inc	TP650
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp	TP-22G
Curved forceps	Roboz	RS-5101
Scissors	Fine Science Tools (FST)	FST 14063-09
Needle holder	FST	FST 12501-13
Electrical shaver	Oster	Golden A5