Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı

Özet

Aerobik koşullarda bakteri yapışma ve işgali araştırmak için hücre kültürü deneyleri Sahne genellikle temsil edici olduğu In vivo Ortam. Bir Dikey Difüzyon Odası modeli insan patojen etkileşimleri çalışma sağlar Campylobacter jejuni Daha altında bağırsak epitel hücreleri ile In vivo gibi, gelişmiş bakteri istilası sonucu.

Özet

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Farklı orta ve gaz koşullarında bir bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin enfeksiyonun bir in vitro modeli geliştirdik. Dikey difüzyon hücresinde (VDC) modeli bakteriler çok düşük oksijen iken doku koşulları altında olacak insan bağırsak koşulların kan akışından oksijen ile tedarik edilecek taklit eder. Bir VDC içine Snapwell ekler yetiştirilen polarize bağırsak epitel hücre (IEC) mono tabakaları yerleştirilmesi ayrı apikal ve bazolateral bölmeleri oluşturur. Bazolateral bölmesi, hücre kültür ortamı ile doldurulmuş ve kapatılmış oksijen w ile perfüzeApikal bölmesi Hilst suyu ile doldurulur, açık tutulur ve mikroaerobik koşullar altında inkübe edildi. Caco-2 ve T84 Hem IECS hücre yaşamını ya da tek tabaka bütünlüğü üzerinde belirgin bir zararlı etki olmaksızın, bu koşullar altında VDC korunabilir. Coculturing deneyler değişik C ile gerçekleştirilir apikal bölmeye mikroaerobik koşullara jejuni, vahşi tip suş ile VDC model içinde farklı IEC hattı tekrarlanabilir aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısı (yaklaşık 10 kat) artış ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakterilerin neden ^1. VDC modeli oluşturulan ortamı daha yakından C. karşılaştığı çevre taklit eder ve insan bağırsak jejuni daha yakından in vivo gerçekte taklit eden şartlar altında in vitro enfeksiyon deneyleri gerçekleştirmek önemini vurgulamaktadır. Biz VDC modelinin kullanımının etkileşim yeni yorumlar bahis sağlayacak teklifbakteriyel patojenler ve konak hücreleri da muhtemelen bir.

Giriş

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri, ev sahibi hücrelere bakteriyel yapışma, konak hücre reseptörleri, yollar ve ev sahibi hücrelerin bakteri istilası sinyal konak hücrenin kimlik kullanan tüm birçok önemli gözlemler sonucu, ayrıntılı olarak incelenmiştir. Ancak bu hücre kültürü deneyleri in vivo ortamda temsil olmayabilir aerobik koşullar altında yapılmaktadır. Gastrointestinal enfeksiyonlar incelemek için kullanılan in vitro modellerinde önemli bir sınırlama yüksek oksijen seviyesi de dahil olmak üzere kültür koşulları genellikle ökaryot hücre sağkalım lehine olmasıdır. Bununla birlikte, bağırsak lümeninden koşulların hemen hemen anaerobik olacaktır. Çok düşük bir oksijen ortamında enterik patojenlerin olan ekspresyon değişikliği aerobik şartlar altında ² enfeksiyon genlerini ifade eder. Bu nedenle, veri standart hücre kültürü modelleri m kullanılarak eldeay konak hücreleri ile bakteriyel etkileşimlerin bir yanlış göstergesidir.

Campylobacter jejuni hafif ishal şiddetli enflamatuar enterit değişir bu belirtiler, dünya çapında bakteriyel akut gastroenterit önde gelen etken olduğunu. C çoğunluğu basit gastroenterit jejuni enfeksiyonları sonucu, ancak C. jejuni da Guillain-Barre sendromu (GBS) dahil olmak üzere çevresel nöropatiler, en yaygın olarak tespit bulaşıcı bir ajandır. İngiltere'de, bu C'nin neden enterit 500.000 'den fazla vaka olduğu tahmin edilmektedir 580.000.000 £ Birleşik Krallık'ın ekonomisine tahmin maliyeti jejuni enfeksiyonu her yıl. Gelişmekte olan ülkelerde, C. jejuni çocuklar arasında ölüm önde gelen nedenidir. Şüphesiz Campylobacter enfeksiyon önemi ve kapsamlı genomik-tabanlı analiz, C dahil olmak üzere araştırma yıllardır rağmen, jejuni patogenezi hala tam underst olduğunuood, Salmonella, Escherichia coli, Shigella, ve Vibrio cholerae gibi diğer enterik patojenler aksine. Uygun bir küçük hayvan modeli eksikliği bu ³ için önemli bir nedenidir. Ayrıca yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik C çalışmak için daha uygun değildir fakültatif anaeroblar diğer enterik patojenler için daha jejuni. Iken C. jejuni istilacı patojen, C. mekanizmaları olarak kabul edilmektedir bağırsak epitel hücrelerinin jejuni işgali (IECS) hala ^4,5 belirsiz. C. jejuni işgal ya mikrofilamanlar, mikrotübüller, her ikisi de bir arada ya da ikisinin de ⁵ bağımlı olduğu gösterilmiştir. Bu alanda karışıklık muhtemelen in vitro test koşullarında uygunsuz kullanım kaynaklanmaktadır.

Farklı hücre kültürü analizlerinden bir dizi C etkileşimi araştırmak için kullanılmıştır jejuniev sahibi hücrelerle. Caco-2 ^6, INT 407 ^{7, 8} ve T84 hücre hatları tüm farklı C. adhezyon ve invazyon yetenekleri incelemek için kullanılmıştır jejuni suşları. Ancak, C. için bakteriyel yapışma ve invazyon seviyeleri IECS ile jejuni diğer enterik patojenler ⁹ daha önemli ölçüde düşüktür. C. coculturing IECS ile jejuni, normal IECS hayatta kalması için gerekli atmosferik oksijen seviyeleri yakın koşullar altında bir _CO2 inkübatör içinde gerçekleştirilir. ° C. jejuni gen ekspresyon atmosferik oksijen koşullarına göre bağırsak lümen düşük oksijen ortamda çok farklı olacaktır.

Dikey bir difüzyon hücresinde (VDC) sistemi kullanımı, farklı orta ve gazı koşulları altında ^1,10,11 bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin veren geliştirilmiştir. Bu sistem bakteri un olacak insan bağırsak koşullarını taklitçok düşük oksijen iken doku der koşulları kan akışından oksijen ile tedarik edilecektir. Özel bir 0.4 mikron filtre yetiştirilen Polarize IEC mono tabakaları bireysel bakteriyel suyu ve sırasıyla, hücre kültürü ortamı (Şekil 1) ile doldurulmuş bir apikal ve bazolateral bölmesi, oluşturma VDC içine yerleştirildi. VDC değişken bir atmosfer inkübatöründe 37% 85 _N2,% 5 _{O2 ve%} 10 _CO2 içeren ° C, C için en uygun koşulların temsil yerleştirildi jejuni. Apikal bölmesi açık bıraktı ve değişken atmosfer inkübatör içinde mikroaerobik atmosfere maruz kalmış, kapalı bazolateral bölmesi iken% 5 CO ₂ / basınç birikimi engelleyen bir çıkış borusu ile% 95 O ₂ gaz karışımı sürekli yönetimi tarafından oksijen ile sağlanan . Bu koşullar altında, Caco-2 hücre hayatta kalması ve tek tabaka bütünlüğü transepitelyal ele izlenmesi ile doğrulanmıştır24 saat boyunca tek tabaka üzerinde ctrical direnci (TEER), apikal bölmeye düşük oksijen koşullarında apikal ve bazolateral bölmelerinin Caco-2 hücre tek ve fiziksel olarak ayrılması hayatta göstermek için. Değişken atmosfer inkübatör (Mikroaerobik koşulları) ve bir standart hücre kültürü CO ₂ inkübatör (aerobik koşullarda) muhafaza VDCs içinde mono tabakaları TEER farklı atmosferik koşullar ¹ altında hücre tek tabaka bütünlüğünü gösteren, anlamlı farklılık gösterdi. Mikroaerobik koşullar altında, sıkı bağlantıları mevcut ve eşit aerobik koşullarda ¹ altında muhafaza hücreleri benzer bir occludin boyama deseni ile hücre sınırları arasında dağıtılır kaldı.

C. etkileşimleri VDC Caco-2 ve T84 hücreleri ile jejuni bakteriyel etkileşim (yapışma ve işgali) ve işgali değerlendirerek incelenmiştir. Iki farklı ° C. jejuni yabani tip strains ¹ kullanıldı. C. jejuni 11168H orijinal dizisi gerginlik NCTC11168 bir hypermotile türevidir. 11168H gerginlik bir civciv kolonizasyon modelinde çok daha yüksek kolonizasyon düzeyi gösterir ve bu nedenle konak-patojen etkileşim çalışmaları için kullanılacak uygun bir gerginlik olarak kabul edilir. 81-176 bir insan izole etmek ve en invaziv yaygın olarak incelenmiştir laboratuar suşları biridir. ° C. jejuni suşları mikroaerobik veya aerobik şartlar altında bir ya da VDC apikal bölmesine ilave edildi. Biz etkileşim ve işgali hem de yüksek oranda C için kaydedildi gözlenen mikroaerobik koşullar ^1. altında jejuni. Artan ° C. jejuni etkileşimleri mikroaerobik koşullar ¹ altında bakteri sayısındaki artış nedeniyle değildi. Bu veri VDC apikal bölmesinde düşük oksijen ortamında bakteri-konak ilişkileri geliştirir ve gösterir bizim hipotezi desteklediği C invaziv özellikleri jejuni incr olanBu koşullar altında hafifletti. Bu invaziv bakteriyel patojen incelemek için VDC modelinin kullanımının ilk rapor ve daha yakından in vivo durumda taklit koşullarda in vitro enfeksiyon tayinlerde performans önemini vurgulamaktadır. VDC modeli çok farklı bakteri türleri için konak-patojen etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir.

Protokol

1. Özel 0.4 mikron Filtreler IEC Tek katmanlar Büyüme

1. Dulbecco'nun modifiye temel ortam, kültür, Caco-2 hücreleri (DMEM)% 10 (v / v) fetal dana serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 1 (v / v) ile gerekli olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 standart bir doku kültürü kuluçka °% 5 _CO2 ve% 95 hava C 'dir. Tohum 4 x 10 ⁵ Caco-2 0.4 mikron başına IECS filtre ve 21 gün içinde kutuplaşma büyümeye, medya 2-3 günde değişiyor.
2. Bir Volt-Ohm direnç metre kullanarak tek tabaka polarizasyon durumunu onaylamak için TEER ölçün. Çalışmalarda, 21 günün TEER Caco-2 bu 0.4 mikron filtre yetiştirilen hücreler 700-800 Ωcm ^2'dir.

2. C. hazırlanması jejuni ve Coculturing tahlil için Bakteriyel Orta

1. VDC coculturing testinin istenen başlangıç ​​noktası önce 24 saat, C taze bir kan agar plaka hazırlamak. 37 jejuni ve inkübe ° C değişken atmosfer inkübatör mikroaerobik koşulları (% 85 N _2, 5% O _2, ve% 10 CO ₂₎ altında.
2. Aynı zamanda, değişken ortam inkübatör mikroaerobik koşullar altında 37 ° C 'de Brucella et suyu 30 ml Preincubate.

3. Hazırlık ve Test öncesinde VDC Yarım Odaları Sterilizasyon

1. Batırmayın VDC yarısı odaları yanı sıra O-ring ve sterilizasyon çözüm fişleri.
2. , Steril bir 20 ml'lik şırınga kullanarak, yarı odaları hem de gaz girişleri aracılığıyla sterilizasyon çözeltisi yıkayın. Aksi takdirde, coculturing sırasında numunelerin kirlenmesine neden olabilir.
3. > 1 saat için sterilizasyon solüsyonuna daldırılır tüm bileşenleri bırakın.
4. Gaz girişleri temizlemek için başka bir steril 20 ml şırınga kullanarak, temiz steril su ile durulayın.

4. HazırlıkBakteriyel inokulum

1. C. yarım tabak hasat kan agar plağından jejuni büyüme kuluçkaya yatırılmış brusella suyu 1 ml içine önceki gün hazırladı. Bu ~ 10 ¹⁰ kob / ml boyun eğmek zorundadır.
2. Bakteriyel koloni oluşturan birim (CFU) semiquantify ile 600 nm de bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğunun ölçülmesi.
3. Kuluçkaya yatırılmış Brucella brot 4 ml inokulum istenen seviyeye bakteri süspansiyonu ayarlayın.
4. Daha sonra, inokulum mevcut bakteriyel CFU sayısını ölçmek için, 48 saat boyunca, değişken bir atmosfer inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe üç tekrarlı olarak kan agar plakaları üzerine uygun dilüsyonları, kaplama, ardından, bu nihai bakteriyel süspansiyon bir seri seyreltme gerçekleştirin.

5. VDC ayarlama

1. Tezgah üzerine VDC düz alt yarısında odasına yerleştirin. Alt yarısında odasının üzerine bir O-ring takın.
2. T IECS taşıyan bir filtre ayırıno bir taşıyıcı ve steril PBS 400 ul ile üç kez yıkayın. O-ring yerinde kalır emin, alt yarısı odasının üzerine filtre yerleştirin.
3. Yavaşça üst yarısında odasına yerine indirin. Iki yarı-odaları monte edildikten sonra, halka kelepçelerle birbirine kenetlenmiştir. Yukarı bakacak şekilde iki açıklık ile, tezgah üstüne yatay olarak VDC yerleştirin.
4. Apikal yarısı odasına bakteriyel inokulum 4 ml ekleyin.
5. Yarı bazolateral bölmeye hücre kültürü ortamı 4 ml ilave edilir.
6. Yarım odaları hem deliklerine sonunda parçaları yerleştirin.

6. Değişken Atmosfer İnkübatör içinde Gaz Manifold için VDC takılması

1. Gaz manifoldu yakın değişken atmosfer kuvöz içine VDC yerleştirin.
2. Gaz manifoldu bağlı gaz regülatörü açın. VDC bazolateral yarısı odasına üzerindeki gaz girişine manifoldundan tüp takın. Ga takıns çıkış borusu bazolateral yarım odası üzerinde son-parça satış birine değişken atmosfer inkübatör dışında lider.
3. Bazolateral yarım odası üzerinde son parçalı diğer çıkış kapalı kapatın. Bu bazolateral ortamın sınırdışı yol açabilir gibi, aşırı gaz basıncı önlemek için çok yavaş açmak için bakımı, gaz manifoldu üzerinde gaz akışını açın.
4. Amaç 1 kabarcık her 2-5 saniye bir gaz akışı. Periyodik olarak, deney sırasında gaz akışını kontrol etmek ve gerektiğinde ayarlayın.

7. Kokültürü sonra VDC sökülmesi

1. Uygun kokültürü süre sonra, gaz manifolduna bağlı gaz regülatörü kapatın. Manifoldunda VDC içine gaz akışını kapatın. Gaz girişi, gaz çıkışı ve VDC gelen stoper çıkarın.
2. Bir değişken atmosfer inkübatör VDC çıkarın. Subsequen için -80 apikal ve bazolateral süpernatanlar ve mağaza ° C çıkarınT analizi.
3. Halka kelepçeleri çıkarın ve yavaşça VDC parçalara ayırmak. Yarı odası ve steril bir 6-kuyulu hücre kültürü çanak transfer filtre çıkarın. Steril PBS ile 400 ul IECS üç kez yıkayın.
4. Etkileşim bakteri sayısının sayılması için, Triton X-100 IECS için% 0.1 içeren steril PBS içinde 400 ul (v / v) ekleyin ve IEC eritmek için, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Daha sonra bakteriyel CFU etkileşim sayısını ölçmek için, 48 saat boyunca, değişken bir atmosfer inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe üç tekrarlı olarak kan agar plakaları üzerine uygun dilüsyonları, kaplama, ardından, bu hücre lizatından bir seri seyreltme gerçekleştirin.
5. Istilacı bakteri sayısının sayılması için,% 5 _CO2 ve% 95 37 ° C'de standart bir doku kültürü inkübatörü içinde, 2 saat boyunca inkübe IECS ve 150 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM hücre kültür aracı maddesi ° C arasında 400 ul dışı bakterileri öldürmek için hava,daha sonra yukarıda adım 7.4 için olarak izleyin.

8. Kokültürü sonra VDC temizleme

Deneylerin bir sonraki tur için steril su ve mağaza ile VDC yıkayın.

Sonuçlar

Coculturing deneyler C ile gerçekleştirilen jejuni, yabani tip suşu ve apikal bölmeye mikroaerobik koşullara VDC modelinde IECS bir süre içinde aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısındaki artış (yaklaşık 10 kat) ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakteri göstermiştir bağımlı bir şekilde ^1. Bu gözlem, iki farklı C. kullanarak tekrarlanabilir olduğu jejuni yabani tip suşları (11168H ve 81-176) ve iki farkl...

Tartışmalar

Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenlerin etkileşimleri incelemek için in vitro hücre kültürü yöntemleri içinde kullanımı yaygın olarak pek çok araştırma laboratuarlarında kullanılan bir tekniktir. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik <...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts	Harvard Apparatus	66-0001	Manifold & six Snapwell chambers
Caps	Harvard Apparatus	66-0020
O-rings	Harvard Apparatus	66-0007
Clamps	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer	Biochrom	80-3003-72