장 상피 세포의 장내 세균의 침입<em&gt; 체외</em&gt; 크게 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 향상

요약

호기성 조건에서 박테리아의 부착 및 침입 조사를위한 세포 배양 분석을 수행하면의 일반적으로 대표성이다 생체 내 환경을 제공합니다. 수직 확산 챔버 모델은 인간의 병원체의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다 캄 필로 박터 속 jejuni 더 아래에 장 상피 세포와 생체 내과 같은 향상된 세균 침입의 결과로.

초록

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용은 체외 세포 배양 방법에 사용 광범위하게 연구되고있다. 이러한 세포 배양 분석은 호기성 조건에서 수행됩니다 그러나, 이러한 체외 모델에서 정확하게 호스트 병원체 상호 작용이 일어날 수있는 생체 환경을 대표하지 않을 수 있습니다. 우리는 다른 매체와 가스 조건에서 세균과 숙주 세포의 배양을 허용 감염의 체외 모델을 개발했습니다. 수직 확산 회의소 (VDC)의 모델은 박테리아가 매우 낮은 산소 반면 조직의 조건이 될 사람의 대장의 조건 혈류의 산소 공급됩니다를 모방. VDC에 Snapwell 삽입에서 재배 편광 장 상피 세포 (IEC) 단일 층을 배치하면 별도의 정점과 기저 외측 구획을 만듭니다. 기저 외측 구획, 세포 배양 배지로 채워 밀봉 산소 w로 관류됩니다혀끝 함을 hilst는 국물로 가득 차 있습니다, 계속 열려있는 호기성 (microaerobic) 조건에서 배양 하였다. Caco-2와 T84 두 IECS는 세포의 생존이나 단층 무결성에 대한 명백한 해로운 영향없이 이러한 조건에서 VDC 유지 될 수 있습니다. Coculturing 실험은 서로 다른 C.으로 수행 혀끝의 구획 호기성 (microaerobic) 조건 속 jejuni 야생형 균주와 VDC 모델의 다른 IEC 라인 재현성 호기성 배양 조건에 비해 상호 작용의 수 (약 10 배) 증가와 세포 내 (약 100 배) 박테리아의 원인 ^1. VDC 모델에서 만든 환경이 더 가깝게 C.에 의해 발생하는 환경을 모방 그리고 인간의 창자에 속 jejuni는 더 밀접하게 생체 내 현실 모방하는 조건 하에서 생체 감염 분석의 수행의 중요성을 강조한다. 우리는 VDC​​ 모델의 사용은 상호 작용의 새로운 해석 내기 있도록 제안세균성 병원체와 숙주 세포를 싸우는.

서문

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용은 체외 세포 배양 방법에 사용 광범위하게 연구되고있다. 이러한 세포 배양 분석, 숙주 세포에 세균 부착, 숙주 세포 수용체 경로와 숙주 세포의 세균 침입 신호 숙주 세포의 식별을 사용하면 모든 많은 중요한 관찰의 결과로, 세부에서 공부하고 있습니다. 그러나 이러한 세포 배양 분석은 생체 환경에서 대표되지 않을 수 있습니다 호기성 조건에서 수행됩니다. 위장 감염을 연구하는 데 체외 모델에서의 주요 제한은 높은 산소 수준을 포함 배양 조건은 일반적으로 진핵 세포의 생존을 선호한다는 것입니다. 그러나 창자 루멘의 조건이 거의 혐기성 될 것입니다. 매우 낮은 산소 환경에서의 장내 병원체는 그의 표정 변화 호기성 조건 하에서 ² 독성 유전자를 표현한다. 같은 데이터는 표준 셀 문화 모델 M을 사용하여 얻은바깥 호스트 세포와 세균 상호 작용의 부정확 한 표시를 제공합니다.

캄 필로 박터 속 jejuni는 가벼운 설사에서 심한 염증성 장염에 이르기까지 다양하는 증상, 세계적으로 세균성 급성 위장염의 주요 원인이되는 에이전트입니다. C. 대부분의 단순한 위장염에 속 jejuni 감염 결과, 그러나 C. 속 jejuni는 길랑 - 바레 증후군 (GBS) 등의 말초 신경 병증에서 가장 일반적으로 발견 전염성 에이전트입니다. 영국에서는, 그것은 C.에 의한 장염의 500,000 경우가있는 것으로 추정된다 5억8천만파운드의 영국 경제에 예상 비용으로 속 jejuni 감염 매년. 개발 도상국에서, C. 속 jejuni는 어린이들에게 사망의 주요 원인이다. 의심 할 여지 캄 필로 박터 감염의 중요성과 철저한 유전체학 기반의 분석, C. 등의 연구 수십 년,에도 불구하고 속 jejuni의 병인은 아직 저조한 underst입니다OOD, 살모넬라, 대장균, 이질균, 그리고 비브리오 콜레라 등의 장내 병원체에 대비합니다. 편리한 작은 동물 모델의 부족이 ³ 하나의 주요 이유입니다. 또한 널리 생체 감염 모델에서 사용이 호기성 C. 공부에 더 부적절 통성 혐기성있는 다른 장내 병원균에 비해 속 jejuni. 반면 C. 속 jejuni는 침입 병원체, C.의 메커니즘으로 인식되고 장 상피 세포의 속 jejuni의 침략 (IECS)는 여전히 ^4,5 불분명합니다. C. 속 jejuni의 침략은 어느 미사, 미세 소관,이 둘의 조합 또는 ^5도에 의존 것으로 표시되었습니다. 이 지역의 혼란은 아마 대부분 체외 분석 조건 부적절한 사용으로 인한 것입니다.

다른 세포 배양 분석의 수는 C의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다 속 jejuni숙주 세포와 함께. Caco-2 ^6, INT 407 ⁷ 및 T84 ⁸ 셀 라인은 모든 다른 C의 접착력과 침략 기능을 연구하는 데 사용되었습니다 속 jejuni 균주. 그러나 C.에 대한 세균의 부착과 침략의 수준 IECS에 속 jejuni 다른 장내 병원균 ^9보다 크게 낮다. C.의 coculturing IECS에 속 jejuni는 일반적으로 IECS의 생존에 필요한 공기 중의 산소 농도에 가까운 조건에서 CO ₂ 배양기에서 수행됩니다. C.는 속 jejuni 유전자 발현은 대기 중 산소 조건에 비해 창자 루멘의 낮은 산소 환경에서 매우 다른 것입니다.

수직 확산 회의소 (VDC) 시스템의 사용은 다른 매체와 가스 상태 ^{1,10,11에서} 세균과 숙주 세포의 배양을 허용하는 개발되었습니다. 이 시스템은 박테리아가 취소 될 사람의 대장의 조건을 모방매우 낮은 산소 반면 조직의 데르 조건은 혈류에서 산소 공급 될 것이다. 특수 0.4 μm의 필터에서 재배 편광 IEC 단층은 개별적으로 세균 배양액은 각각 세포 배양 배지 (그림 1) 가득 차 있었다 정점과 기저 외측 구획을 만드는 VDC에 배치되었다. VDC는 변수 분위기 인큐베이터가 37 ~ 85 % N _2, 5 % O _2, 10 % CO _2를 포함 ° C, C. 최적의 조건을 나타내는에 배치되었다 속 jejuni. 정점 함을 열어 왼쪽 변수 분위기 인큐베이터 내에서 호기성 (microaerobic) 대기에 노출되고, 밀봉 기저 함을 동안은 5 % CO ₂ / 압력 축적을 방지 콘센트 튜브 95 % O ₂ 혼합 가스의 지속적인 관리에 의해 산소와 함께 제공된 . 이러한 조건에서 Caco-2 세포의 생존 및 단층 무결성 transepithelial ELE를 모니터링하여 확인 하였다24 시간 동안 단층에 걸쳐 ctrical 저항 (티이)는 정점 구획의 낮은 산소 조건에서 정점과 기저 외측 구획의 Caco-2 세포 단층 및 물리적 분리의 생존을 증명한다. 변수 분위기 인큐베이터 (호기성 (microaerobic) 조건)과 표준 셀 문화 CO ₂ 배양기 (호기성 조건)에서 유지 VDC에있는 단층의 봉사자는 다른 대기 조건 ^1에서 세포 단층의 무결성을 나타내는 유의 한 차이를 보이지 않았다. 호기성 (microaerobic) 조건에서, 꽉 분기점이 존재하고 균등 호기성 조건 ^1에서 유지 세포와 유사한 occludin 염색 패턴 셀 테두리 사이에 분포 남아 있었다.

C.의 상호 작용 VDC의 Caco-2와 T84 세포 속 jejuni는 세균의 상호 작용 (접착력과 침략)와 침략을 평가하여 조사 하였다. 두 개의 서로 다른 C. jejuni와 야생형 straiNS는 ¹ 사용 하였다. C.는 jejuni와 11168H는 원래 시퀀스 변형 NCTC11168의 hypermotile 파생됩니다. 11168H 변형 병아리 식민지 모델에서 더 높은 식민지 수준을 보여 주며, 따라서 호스트 병원체 상호 작용 연구에 사용하기 적합한 균주로 간주됩니다. 81-176은 인간을 분리하고 대부분의 침략 널리 연구 실험실의 변종 중 하나입니다. C.는 속 jejuni 균주는 호기성 (microaerobic) 또는 호기성 조건 중 하나에 따라 VDC의 정점 구획에 추가되었습니다. 우리는 상호 작용과 침략을 모두 더 높은 금리 C.에 대하여 관찰 호기성 (microaerobic) 조건 ¹ 아래 속 jejuni. 증가 C. 속 jejuni의 상호 작용은 호기성 (microaerobic) 조건 ^1에 따라 세균 수의 증가로 인해 아니 었습니다. 이 데이터는 VDC의 정점 구획의 낮은 산소 환경은 박테리아 호스트 상호 작용을 강화하고 나타냅니다 우리의 가설을 지원하는 C의 침략 등록 속 jejuni는 매입 채무 및 기타 채무의 증가입니다이러한 조건 완화. 이 침입 세균 병원체를 공부하는 VDC 모델의 사용의 첫 번째 보고서이었고, 더 밀접하게 생체 내 상황을 모방하는 조건 하에서 생체 감염 분석의 수행의 중요성을 강조한다. VDC 모델은 여러 세균 종에 대한 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 특수 0.4 μm의 필터에 IEC 단층의 성장

1. Dulbecco의 수정 된 필수 미디어 문화 Caco-2 세포 (DMEM)의 10 % (v / v)의 송아지 태아 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신, 1 % (v / v)의에 불필요한 아미노산 보충 37 표준 조직 문화 인큐베이터 ° 5 % CO _2, 95 %의 공기 C. 씨앗 4 × 10 ⁵ Caco-2 0.4 μm의 당 IECS 필터링 21 일 동안 양극화로 성장 매체에게 2-3 일마다 변경.
2. 볼트 옴 저항 측정기를 사용하여 단층의 편광 상태를 확인하는 봉사자를 측정한다. 우리의 연구에서 21 일의 봉사자는 Caco-2이 0.4 μm의 필터에서 자란 세포는 700 ~ 800 Ωcm ^2입니다.

2. C.의 준비 속 jejuni와 Coculturing 분석 실험에 대한 세균의 중간

1. VDC의 coculturing 분석의 원하는 시작 지점 이전에 24 시간은, C의 신선한 혈액 한천 플레이트를 준비. 37 속 jejuni와 부화 ° C 변수의 분위기 배양기에서 호기성 (microaerobic) 조건 (85 % N _2, 5 % O _2, 10 % CO _2)에 따라.
2. 동시에, 변수의 분위기 배양기에서 호기성 (microaerobic) 조건 하에서 37 ° C에서 브루셀라 국물의 30 ML을 preinc​​ubate.

3. 준비 및 분석에 앞서 VDC 하프 챔버의 살균

1. 완전히 담그지 VDC 반 챔버뿐만 아니라 O-링과 살균 용액에 플러그.
2. 멸균 20 ML의 주사기를 사용, 반 챔버 모두에서 가스 입구를 통해 살균 용액을 세척하십시오. 그렇게하지 ​​않으면 coculturing 동안 시료의 오염을 초래할 수 있습니다.
3. > 1 시간 동안 살균 용액에 모든 구성 요소를 둡니다.
4. 가스 주입구를 세척하기 위해 다른 멸균 20 ML의 주사기를 사용하여, 신선한 멸균 물을 모든 구성 요소를 씻어.

4. 준비하기세균 접종의

1. C. 반 접시를 수확 혈액 한천 배지에서 속 jejuni의 성장은 전 배양 브루셀라 국물 1 ㎖로 전날 준비. 이 ~ ¹⁰ 10 CFU / ㎖를 산출해야한다.
2. 세균 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 semiquantify 600 nm에서 세균 현탁액의 광학 밀도를 측정한다.
3. 전 배양 브루셀라 국물 4 ML에서 원하는 접종 수준으로 세균 현탁액을 조정합니다.
4. 다음 접종에 존재하는 세균 CFUs의 수를 정량화하기 위해 48 시간 동안 변수 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다 세중의에서 혈액 한천 플레이트에 적절한 희석의 도금 다음이 마지막 세균 현탁액에서 시리얼 희석을 수행합니다.

5. VDC 설정

1. 벤치 위에 VDC 평면의 아래쪽 챔버를 놓습니다. 아래쪽 챔버에 O-링을 맞 춥니 다.
2. t에서 IECS을 들고 하나의 필터를 분리그는 캐리어 및 멸균 PBS 400 μL로 3 회 세척한다. O-링이 제자리에 남아 확인하고, 아래쪽 챔버에 필터를 놓습니다.
3. 조심스럽게 상반신 챔버 제자리에 내려 놓습니다. 두 반 챔버가 조립되면, 링 클램프를 함께 사용하여 클램프. 위쪽을 향하도록 두 개의 구멍과 더불어, 벤치 위에 수평으로 VDC를 놓습니다.
4. 혀끝의 절반 실에 세균 접종의 4 ML을 추가합니다.
5. 기저 반 챔버에 세포 배양 배지 4 ML을 추가합니다.
6. 반 챔버 양쪽 구멍에 끝 조각을 놓습니다.

6. 변수 분위기 인큐베이터 내에서 가스 매니 폴드에 VDC 부착

1. 가스 매니 폴드에 근접 변수 분위기 인큐베이터에 VDC를 놓습니다.
2. 가스 매니 폴드에 연결된 가스 공급 레귤레이터를 엽니 다. VDC의 기저 반 챔버의 가스 입구에 매니 폴드 튜브를 연결합니다. 조지아 연결의 출구 파이프 기저 반 챔버의 끝 부분에있는 콘센트 하나에 변수 분위기 인큐베이터에서 선도.
3. 기저 반 챔버의 끝 부분에있는 다른 출구를 닫습니다. 이 기저 매체의 추방으로 이어질 수 있으므로, 과도한 가스 압력을 피하기 위해 매우 천천히 열을 돌보는, 가스 매니 폴드 가스 흐름을 엽니 다.
4. 목표는 1 거품마다 2-5 초 가스 흐름입니다. 주기적으로 실험의 과정에서 가스의 흐름을 확인하고 필요한 경우 조정합니다.

7. 배양 후 VDC 분해

1. 적절한 배양 기간 후에, 가스 매니 폴드에 연결된 가스 공급 레귤레이터를 닫습니다. 매니 폴드에서 VDC에 가스 흐름을 닫습니다. 가스 입구, 가스 출구 및 VDC에서 마개를 분리합니다.
2. 변수의 분위기 인큐베이터에서 VDC를 제거합니다. subsequen -80에서 정점과 기저 상층 액 및 저장 ° C를 제거T 분석.
3. 링 클램프를 제거하고 부드럽게 VDC를 분해. 반 챔버와 멸균 6 자 세포 배양 접시로 전송에서 필터를 제거합니다. 멸균 PBS 400 μL와 IECS 세 번 씻으십시오.
4. 상호 작용하는 세균의 총 수의 열거를 들어, 트리톤 X-100 IECS 0.1 %를 포함하는 멸균 PBS 400 μL (V / V)를 추가하고 IEC를 용해 실온에서 20 분 동안 품어. 다음 세균 CFUs 상호 작용의 수를 정량화하기 위해 48 시간 동안 변수 분위기 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다 세중의에서 혈액 한천 플레이트에 적절한 희석의 도금 이어이 세포 파쇄물에서 시리얼 희석을 수행합니다.
5. 침입 세균의 총 수의 열거를 들어, 5 % CO ₂ 95 %에서 37 표준 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간 동안 IECS과 부화에 150 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 DMEM 세포 배양액 ° C의 400 μl를 추가 세포 박테리아를 죽일 공기,그런 다음 위의 단계 7.4 등 따릅니다.

8. 배양 후 VDC 청소

실험의 다음 라운드를 위해 멸균 물 저장소와 VDC를 씻으십시오.

결과

Coculturing 실험 C.으로 수행 jejuni와 야생형 균주 및 치근단 구획 호기성 (microaerobic) 조건 VDC 모델 IECS는 시간에 호기성 배양 조건에 비해 상호 작용의 수 증가 (약 10 배)과 세포 내 (약 100 배) 박테리아를 증명하고있다 의존적으로 ^1. 이 관찰은 두 개의 서로 다른 C를 사용하여 재현했다 속 jejuni는 야생형 균주 (11168H 및 81-176)와 두 개의 서로 다른 IEC 라인 (Caco-2 및 T84),...

토론

숙주 세포와 세균 병원균의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 방법에서의 사용은 널리 많은 연구 실험실에서 근무하는 기술입니다. 이러한 세포 배양 분석은 호기성 조건에서 수행됩니다 그러나, 이러한 체외 모델에서 정확하게 호스트 병원체 상호 작용이 일어날 수있는 생체 환경을 대표하지 않을 수 있습니다. 널리 생체 감염 모델에서 사용이 호기성 C....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts	Harvard Apparatus	66-0001	Manifold & six Snapwell chambers
Caps	Harvard Apparatus	66-0020
O-rings	Harvard Apparatus	66-0007
Clamps	Harvard Apparatus	66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer	Biochrom	80-3003-72