Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Özet

Bu hayvan modellerinin doku bölümleri içinde kalıcı bir DNA virüsü genomunun saptanması için in situ hibridizasyon protokolünde bir floresan kurulmuştur. Bu protokol, viral genomun codetection, kendi RNA ürünleri ve tek bir hücre içinde viral veya hücresel proteinleri tarafından enfeksiyon süreci üzerinde çalışırken sağlar.

Özet

Bir genin tek hücre codetection, kendi ürün ve hücresel RNA, düzenleyici proteinler gen ekspresyonu düzenleme çalışma için çok önemlidir. Bu, viroloji alanında bir sorundur, özellikle de bir nükleer kopyalayan bir kalıcı DNA virüs kendi çalışma için hayvan modellerini içerir ki. Herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1), çevresel nöronlarda bir ömür boyu latent enfeksiyon oluşturur. Latent virüsü reactivates ve yeni herpetik bölüm neden olan rezervuar olarak hizmet vermektedir. HSV-1 gecikme hücre biyolojisi, hayvan modellerinde in situ HSV-1 genomu tespit yöntemlerinin eksikliği, kısmen, az anlaşılmaktadır. Biz yaklaşımın verimli enfekte hayvan modellerinde nöronal dokularda kesimleri içinde düşük kopya viral genomları tespit situ hibridizasyon (FISH) bir DNA-floresan açıklar. Bu yöntem ısıya dayalı antijeninin ortaya çıkartılması dayanır ve direkt etiketlenmiş ev yapımı DNA probları ya da ticari olarak temin edilebilir sondalar. Biz üçlü stai geliştirdining yaklaşım, her boyama gereksinimi karşılamak için peroksidaz tabanlı sinyal amplifikasyonu kullanarak, RNA-FISH ve immünfloresansta ile DNA-FISH birleştirerek. Önemli bir gelişme konfokal mikroskopi ve geniş alan geleneksel epifluoresan yüksek çözünürlükte görüntülenebilir 10 um doku bölümleri, düşük arka plan sinyalleri içinde, elde etme yeteneğidir. Buna ek olarak, üç boyama, hücresel ve viral proteinlere karşı yönelik bir antikor yelpazesi ile çalışmıştır. Tüm protokol, doku içinde antikor ve prob girmesinin karşılamak için 2.5 gün sürer.

Giriş

Herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1) çoğaltmak ve yaymak için periyodik olarak yeniden etkinleştirir hangi periferal sinir sistemi, trigeminal ganglionların (TG) nöronlarda uzun vadeli bir latent enfeksiyon oluşturarak, kalıcı bir insan nörotropik virüsüdür. HSV-1 genomu bu konak hücre genomu içine entegre ^1,2 yok gibi çok kopyalı chromatinized plazmidler kalır, ana nöronun çekirdeğine bir 150 kb dsDNA saptanması. Gecikme sırasında, HSV-1 replikatif döngü programı genetik kuvvetle bastırılır ve gen ekspresyonu gecikme kurulması yeniden aktive ³ başlaması için gecikme ile ilişkili transkripti (LAT) locus, sınırlandırılmıştır. LAT bir büyük 2 kb istikrarlı kement içine işlenmiş uzun 8.5 kb noncoding RNA ve birkaç miRNA ^{4-7 arası} üretir. HSV-1 gecikme dolayısıyla viral genomik DNA, RNA LAT ve tespit replikatif döngüsü proteinlerinin yokluğunda varlığı ile karakterize edilir.

"ontent> Hayvan modelleri, ağırlıklı olarak fare ve tavşan, insan gecikme çeşitli özellikleri yansıtan deneysel modellerdir. bu modellerin ana çıkarları biri de imünokompetan konaklarda HSV-1 gecikme fizyolojik yönlerini okuyan sağlamasıdır. Geçtiğimiz on yıl içinde , bu tür genetik olarak değiştirilmiş virüsler ve fareler gibi pek çok deneysel araçları, fizyoloji, genetik ve hayvan dokularından HSV-1 gecikme, hücresel biyolojisi incelemek için geliştirilmiştir. Şimdiye kadar, viral genomik DNA miktarı tespit edilir ve Southern lekeleme yolu ile ve daha ayrışmış-ra ikinci QPCR. Ancak, şu anda doku bölümleri ^8. Sonuç olarak, gecikme rutin olarak in situ olarak melezleşme ile RNA LAT RNA'nın saptanması yerine yoluyla histolojik bölümler üzerinde değerlendirilir in situ olarak melezleşme ile HSV-1 genomu tespit etmek için uygun bir yöntem yoktur viral genom tespiti. viral genomların varlığında thi göre, enfekte olmuş hücrelere karakterize etmek mümkün olmuştur çünküs teknik sınırlama bu tür viral genom, hücresel ve viral gen ekspresyonu ya da konakçı hücre-aracılı bağışıklık karşılığının ^9,10 arasındaki ilişki olarak ana bilgisayar virüs etkileşimleri, birçok açıdan analizlerine büyük bir dezavantaj olmuştur.

En önemlisi, gizli enfeksiyon, hücre-hücre heterojenlik nispeten keşfedilmemiş kalır ve SCID farelerde ve ^11-17 farelere implante insan duyu ganglion nöronlarında gecikme önemli bir özelliği olduğu gösterilmiştir. Tipik olarak, bu hücre başına HSV-1 genomu kopya sayısının 5 ila birkaç yüz değişir qPCR gösterilmiştir. LAT gecikme ve reaktivasyonu önemli bir düzenleyici olarak görünse de, izole nöronların ve yerinde PCR QPCR veri latent enfekte nöronların sadece bir alt kümesi, 30 gibi düşük%, LAT lokusunu ^11,12,18-21 ifade ettiğini belirtti. Ne konakçı hücre ve virüs gecikme kurulması ile ilgili doku etkisinin içindeki hücre ortamı veviral gen ekspresyonu açık değildir. Burada hayvan nöronal doku bölümleri içinde düşük kopya HSV-1 genomik DNA'nın saptanması için etkin bir in situ hibridizasyon (FISH) yöntemi, güçlü bir floresan tarif eder. Bu yöntem, tasarlanmış ve konakçı hücre içi nükleer bileşenleri ²² ile viral genomun etkileşimini incelemek için gerekli olan yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntüleme erişmek için tarafımızdan kullanılmıştır. Ayrıca, viral gen ekspresyonunu düzenleyen virüs-host etkileşimleri için eşsiz bir araçtır RNA ve proteinler ile viral DNA, eş zamanlı olarak saptanması için bir çok boyama yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, aynı zamanda, bölme sayıda enfekte nöronlar miktarının gibi HSV-1 genomu latent saptanmasını gerektiren analizlerin geniş bir aralığı için uygulanabilir. Bir anahtar bir adım hibridizasyona viral DNA erişilebilir yapmak için antijen alımı tedavi uygulamaktır. Böylece, bu protokol, aynı zamanda saptanması için etkili olabilir,hayvansal dokular içinde geleneksel DNA FISH yaklaşımlarla anda algılanamaz diğer dsDNA virüslerin.

Protokol

Bu yöntem, daha önce ²² yayınlanan bir çalışmada kullanılmıştır. ISH, IF ve FISH genel arka plan ve konvansiyonel manipülasyon açıklaması için, aşağıdaki mevcut literatürü ²³ öneririz.

1.. Hayvan Enfeksiyon

Deney hayvanları ile ilgili tüm işlemler Vizyon Araştırma Derneği ve Göz araştırmalarda hayvanların kullanımı için (ARVO) Bildirimi etik sorunlar uymakta ve Avrupa Birliği çerçevesinde UPR-3296-CNRS yerel Etik Komitesi tarafından onaylandı Konsey Direktifi 86/609/EEC. Tüm hayvanlar, yiyecek ve su sınırsız erişim verildi.

HSV-1, aşağıda tarif edilen ile enfeksiyonun bir fare gibi bir yöntem, daha önce ^24-26 yayınlanmış araştırmalarda kullanılmıştır.

1. Başlangıç ​​önce hazırlamak için aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   
   HSV-1 virüsü stok solüsyonu
   Çözüm anestezi - KetaminE-100 mg / kg ve Xylazine-10 mg / kg
   
2. 0.1 ml / sn sağlayan bir mikroenjektör pompa cihazına bağlı bir 5 ul bir cam mikroenjektörüyle içine virüs 1 ul (10 ⁶ pfu) toplayınız Not:. Kırmızı yağ arasındaki sınırı görmek için bir fenol kırmızı içermeyen ortamda virüs stokları yeniden süspanse kılcal ve virüs çözeltisi içinde mevcut ve virüs inokülasyon yerinde hava enjeksiyon önlemek için.
3. Arka yüzü yukarı anestezi fare (ketamin-100 mg / kg ve Xylazine-10 mg / kg) yatıyordu.
4. Binoküler stereo-mikroskop altında anestezi fare kafasını yerleştirin ve mukokutanöz sınırda sol üst dudağın subepiteliyal tabakasında iğne takın. 5 saniye başına 0.5 ul 'lik bir hızda, iki aşamada (iki kez 0.5 ul)' de virüs solüsyonu enjekte edilir Not:. Enjeksiyon yerinde emmek için viral süspansiyon sağlamak için, her iki 0.5 ul enjeksiyonlar arasında 10 saniye bekleme uyun.
5. Fare yerleştirinuyandırma kadar 37 ° C inkübatör.
6. Gerekli zaman boyunca geri almak için hayvan tesislerinde fare bırak Not:. Fare modelinde, HSV-1 inokülasyon yerinde de dahil olmak üzere birçok nöron dokular içinde en az 10 gün sürer akut enfeksiyon olarak adlandırılır bir birincil enfeksiyon, indükler TG, inokülasyon yapılan bölgeden bağlı olarak üstün servikal gangliya (SCG) ve dorsal kök gangliyon (DRG). Birincil enfeksiyon belirtileri giderek yok ve gecikme tamamen itibaren yaklaşık 28-30 gün sonrası enfeksiyon (dpi) kuruldu kabul edilir. Nöronal dokular akut enfeksiyon üzerinde çalışmalar için 4 dpi genellikle hasat ve gecikme çalışmalar için 28 dpi olabilir.

2. Fare Perfüzyon-fix

1. Fizyolojik tuzlu su tampon maddesi 50 ml: başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın
   
   1x PBS, 60 ml
   1x PBS içinde taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit 150 mi
   1 x PBS içinde% 20 sukroz, 60 ml. 'br />
2. Perfüzyon boru hazırlayın: bir peristaltik pompaya bağlı olan bir kapiler için iğne bağlayın.
3. (SREP 1.2) yukarıda anlatıldığı gibi fare anestezisi ve iğne ile dört ayakları bağlı bir diseksiyon tepsi, sırtını yatıyordu.
4. Kullanarak makas * boğazına kadar karnından keseceksiniz. Organları kaplayan ince doku tabakası yırtın. Sternum bir tarafındaki kaburga keserek göğüs kafesini açın. Yırtılmasını cildi çıkarın. Birbirlerinden uzakta kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin sağ ve sol parçaları taşımak Not:. Perfuse-sabitleme imkansız hale getirecek cesareti, akciğerleri ve büyük damarları (karotis arterler ve şah damarlar), deşmek için değil dikkat edin.
5. * Sol ventrikül içinde iğne takın. Makas ile sağ atrium İnsizyon. Kalbinden kan damarlarındaki fizyolojik tuzlu su içinde 20 ml enjekte edilerek kesilmesi ile devam edin. Tepsideki kan akışını sağlar. Yokte: Bu işlem sırasında, kalbin diğer tarafında aracılığıyla delmek için değil dikkat edin.
6. 15 dakika boyunca * 1 x PBS içinde% 4 PFA 150 ml serpmek (Dikkat: PFA toksiktir, davlumbaz altında manipüle). 6 dakika boyunca 1 x PBS içinde% 20 sukroz 60 mi serpmek. . Bu aşamada fare TG hasat Not hazır: 10 ml / dk için pompayı ayarlayın. İyi bir perfüzyon fare kuyruğu kadar sertleştiği zaman, belirgindir sonra tekrar düşmeye yukarı kaldırın.

3. TG Hasat

1. Başlamadan önce aşağıdaki çözümü hazırlayın:
   
   1 x PBS içinde% 20 sükroz
   
2. Boyun seviyesinde baş kesin. Burun boşluğu ortaya çıkarmak amacıyla, sadece ön dişlerin arkasında burun ucu kesilir. Makasla iki damak kesilirken ve damak her tarafı uzaklaşmaya Not:. TGs, sadece damak altında belirir iki beyaz ve dikdörtgen sağda bulunan uzunluğunda 2-3 mm kitleler gibisol taraf ve trigeminal sinirin bağlı.
3. Beyin sapından TG serbest bırakmak için TGs her tarafında trigeminal sinir dalları kesmek. Cerrahi pense ile TG çıkarın ve 24 saat Not için% 20 sukroz steril solüsyon içinde saklayın:. Sol ve sağ TGs için iki farklı alıcılar, sol TG (enfekte) ve sağ TG (değil ya arasındaki karışıklığı önlemek için zayıf) enfekte. Yerleştirilmeden önce, 24 saat boyunca 1 x PBS içinde% 20 sukroz içinde TG inkübe edin.
4. -80 ° C'de orta ve donma gömme cryosectioning tek blokta embed TGs
5. Mağaza bloklar -80 ° C'de kesit kadar.

4. Cryosection Hazırlık

1. 10 mikron bölümleri gibi TGs uzunlamasına kesilmiş -20 ° C karyostat ve hafifçe ısıtılır (30 ° C) Superfrost slaytlar onları yerleştirin. . Dilimler 5-10 dakika sonra -80 ° C'de kullanımı Not kadar dondurulması ve depolanması için kurumasını bekleyin: Dakikada 4-5 bölümleri pla olabilirbölme sayıda aynı zamanda işlenecek ise, tek bir slayt üzerinde ced. Biz aşağıdaki gibi hareket edin: Seri bölümleri böylece A1, B1 etiketli slaytlar 3 serisi üzerine yatırılır, ve C1, sonra A2, B2, C2 ve vardır. Bu nedenle, her bir slayt dizi (A, B, ve C) (in situ, PCR, LCM olarak, in situ hibridizasyon, FISH) boyanması için farklı işlenebilir ve farklı teknikler kullanılarak elde edilen veriler, aynı sayıda taşıma slaytlar uygun bilerek karşılaştırılabilir TG aynı bölgeye.

5. HSV-1 Probe Etiketleme

Protokol DNA FISH ile HSV-1 genomunun saptanması için aşağıda tarif başarılı probların iki tür kullanılmıştır. İlk, yüksek büyütme floresan mikroskopisi ile tek tek hücreler içinde nükleer kuruluşun ince analizi için uygun olan bir ev yapımı Cy3-etiketli floresan sonda olmaktadır. İkinci kombine edilebilir bir ticari olarak temin edilebilir biyotinile probu, birparlak bir sinyal sağlamak için peroksidaz-tabanlı sinyal amplifikasyon d. İkincisi, tüm bölümünde düşük büyütmede nöron içeren virüsün belirlenmesi ve ölçümü için uygun olan, ve HSV-1 genomu kalıplarının analizi için. Son kullanıcılar yaptıkları çalışmada hedefe en uygun olan yaklaşım değerlendirmelidir. Ticari olarak mevcut prob reaktif bölümünde listelenen ve ev yapımı sondasının hazırlanması aşağıda tarif edilmiştir.

1. Başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   
   HSV-1 genomu içeren vektörler (adım 1)
   % 70 etanol, moleküler biyoloji notu.
   
2. . HSV-1 genomlarının 30 kb bölümlerini içeren kozmid (sayı 14, 28 kozmidler ve 56 büyük vektörlere adanmış arıtma kolonları kullanılarak referans ²⁰ de tarif hazırlayın Not: bekteriyel yapay kromozomlar gibi HSV-1 genomu ihtiva eden kütüphanelerin diğer özellikleri olmalıdır sürece prob al kapakları gibi, hem de işe^27-29 yeterli sinyal üretmek üzere HSV-1 genomunun ARGE bölümü. Elimizde olanlar, kozmid vektör omurgası yapılmış probları herhangi bir sinyal üretmedi ve negatif kontrol olarak kullanılmıştır. HSV-1 sekansı ihtiva eden Böylece tüm kozmid vektörler çalışmada kullanılmıştır. Bu, HSV-1 dizisini kesmek ve prob hazırlamak için kullanmak da mümkündür.
3. . Etiket üretici yönergelerine göre bir nick-çeviri kiti kullanılarak Cy3-dCTP her kosmidden 2 mikrogram Not: Sadece Cy3-dCTP ve hiçbir etiketsiz dCTP içeren bir reaksiyon karışımı ile etiketleme gerçekleştirin.
4. 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtma ve karışım 0.5 M EDTA 3 ul ekleyerek reaksiyonu durdurun. Buz üzerinde soğutun.
5. Bir G50 jel dışlama Minikolon üzerinde prob arındırın. Sondaya somon sperm DNA 150 ug ekleyin ve etanol çökeltme ile prob hızlandırabilir. DNA topağı nedeniyle Cy3 için dahil pembe olmalıdır. % 70 etanol ile yıkanır ve pelet kadar etanol çıkarmakbir pipet ile mümkün. Pelet kuru izin vermeyin.
6. Deiyonize formamid 100 ul ile pelet çözülür (Dikkat: formamid toksik olan davlumbaz altında işleyin.). Prob konsantrasyonu güvenilir Bu noktada ölçülen olamaz. Metin içinde adı geçen sonda miktarları sonda yapmak için kullanılan şablon DNA miktarına bakın. Protokol DNA şablonu ve formamid 100 ul 2 ug dayalı olarak, bu 20 ng / ml olarak kabul edilir. -20 ° C'de saklayın Etiketli probu büyük miktarda hazırlanmıştır ve aylarca dondurulmuş saklanabilir.

6. DNA-FISH

Şekil 1, bu DNA-FISH protokolü ve nasıl Protocols 7-9 de tarif edildiği gibi, RNA ve protein codetect için bir çok boyama deneyin bir parçası olarak DNA-FISH gerçekleştirmek için ana adımların bir genel görünüşünü göstermektedir.

1. Başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   
   1x PBS içinde% 0.5 Triton X-100
   2x SSC ve 0.2x SSC tamponu
   100 mM pH 6.0 sitrat tamponu (10x stok çözelti) ve 10 mM pH 6.0 sitrat tamponu (çalışma çözeltisi)
   2x hibridizasyon tamponu (Protokolü 4)
   
2. 1. günde, oda sıcaklığında, bir slayt tutucu slaytlar yerleştirin ve bölümler, 10 dakika boyunca kurumaya bırakın. Bir hidrofobik kalemle bölümleri daire. 10 dakika süre ile 1x PBS bölümleri rehidrate. Doku permeabilize 1x PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile bölümleri 20 dakika inkübe edin. Yıkama 3x 10 2x SSC ile dakika ve maskesinin tampon kadar ısıtılır (aşağıya bakınız) 2x SSC içinde tutmak.
3. Ortaya çıkartılması için, 10 mM sodyum sitrat tampon maddesi (pH 6.0), 200 ml ile dolu bir cam slayt, tepsi (20 slaytlar kapasite) hazırlar. Damıtılmış 500 ml su ile dolu bir kap içinde daha büyük bir tepsiye yerleştirin. Bu ayar, ısıtma bakliyat daha iyi bir kontrol sağlar. Tepsideki slaytlar yerleştirmeden önce, met kadar mikrodalga fırında tampon ön ısıtmaffer (800 W 8 dakika civarında) kaynama ulaşır.
4. Önceden ısıtılmış sitrat tamponu içeren tepsiye slaytlar yerleştirin ve tamamen tampon maddesi ile kaplanmıştır emin olun. Isı yaklaşık 20 saniye boyunca tampon kaynama ulaşana kadar. Dikkat dokuya zarar verebilir, hangi kaynatın üzerinde tampon izin VERMEYİN. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumaya. Isıtma çevrimi 6x (7 ısıtma çevrimleri toplam) * tekrarlayın. 2 dakika soğumasını ve 5 dk için 2x SSC slaytlar aktarmak.
   * Not: Bu en önemli adımlardan biridir. Isıtma çevrimi en uygun sayısı ve süresi ampirik olarak belirlenmelidir ve doku türüne veya kullanılan prob tipine bağlı olarak değişebilir. Mikrodalga, tepsi, kap ve kap içindeki tepsi ve su içinde tampon hacmi maskesinin düşürülmesi yeniden üretilebilirlik için ayn tutulmalıdır. Aşırı kaynama doku kaybı ve hasar görmüş hücrelerin neden olabilir. Her bir ısıtma darbe için, kaynama belirmesi dikkatli bir şekilde izledi, ve ısı ileing kaynatmadan ilk belirtileri durdurmak gerekir. Bir kez kurmak, maskelenmesinin sağlam ve tekrarlanabilir. Şekil 2A maskelenmesinin koşulları daha keşfedilmeyi olabilir belirten, HSV-1 genom farklı tamponlar ile maskesinin tarafından tespit edilebildiğini göstermektedir görünür. Sitrat tabanlı maskesinin sürekli olarak, laboratuar ve hayvan modellerinde gelen bölümleri ile, iyi bir sinyal FISH ve doku korunmasını sağlamak için bulunmuştur.
5. Asetik asit: metanol slaytlar inkübe edin, 15 dakika boyunca PBS karışımı (03:01:04), daha sonra bir metanol: 15 dakika (Dikkat için asetik asit karışımı (3:1): asetik asit aşındırıcı duman altında işleyin. kaput ve yeterli koruma kullanmak.) sağ Kullanmadan önce bu çözüm hazırlayın.
6. ,% 70 birbirini takip eden 10 dakika kuluçkalama yoluyla kurutmak bölümü daha sonra% 100 etanol içinde 10 dakika 2x. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuru olsun. Sondalama kadar kuru tutun.
7. Aşağıdaki gibi tarama çözümü hazırlayın: Önceden 2x hibridizasyon tampon ortak bir 20 ml stok hazırlamak% 20 dekstran sülfat (MW 500000), 2x Denhardt çözeltisi, 4x SSC * ntaining. -20 ° C'de 500 ul mikro-tüpler içinde ve deposu olarak çözelti alikotu 1 slayt (50 mm x 22 mm'lik bir örtücü cam,) için, HSV-1 Cy3-etiketli prob (Her kozmid için prob 30 ng) 90 ng karıştırın ve formamid ile 40 ul hacim tamamlayın. 2 x hibridizasyon tampon maddesi 40 ul ekle. Pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın.
   * Not: 2 x hibridizasyon tamponu hazırlamak damıtılmış su, 10 ml MW 500.000, dekstran sülfat, 4 g karıştırın. Bu, 70 ° C'de 3-4 saat sonra çözünür bir yapışkan karışım yapar Eritmek için düzenli olarak karıştırın. 20x SSC, 100 x Denhardt çözeltisi 400 ul 4 ml ilave edilir. 20 ml tamamlayın ve bir vorteks ile iyice karıştırın.
8. Kurutulmuş bölümleri üzerine çözüm sondalama 80 ul bırakın. 22 mm x 50 mm cam lamel ile kaplayın ve sondalama çözüm üzerinde yayılır doğrulayınlamel bütün yüzeyi. Dikkat: kabarcıklar olmalıdır. Kabarcıklarının varlığı hibritleşme etkinliğini azaltır. Kauçuk çimento kullanarak lamel mühür ve kurumaya bırakın. Sürgü boyunca en uygun hibridizasyon sinyali için en az 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta slaytlar tutun.
   Not: çabuk kurur gibi kauçuk çimento uygun, su geçirmez ve melezleme sırasında kurutmadan örnek korur. Bu melezleme sonra lamel kaldırmak için kalkmasına da kolaydır. Tırnak cilası verimli bir alternatif olduğunu, ama daha az uygun bir seçenek.
9. 5 dakika için bir 80 ° C inkübatöre slayt üzerine slaytlar koyarak denatürasyon ile devam edin. Alternatif olarak, bir metal tepsinin üzerine yerleştirin ve slaytlar (tepsi şamandıra gerekir), bir 80 ° C su banyosu içinde tepsiye yerleştirin. Daha sonra hızla buz üzerine yerleştirilmiş bir metal tepsi üzerine slaytlar aktarın. 5 dakika bekletin. Hibridizasyon gece boyunca 37 ° C (slayt ısıtıcı veya inkübatör) de slaytlar aktarın.
   Not: Biz daha kısa zayıf sonuçları hibridizasyon, ya da hiç sinyal önermiyoruz.
10. 37 ° C 'de bölümünü tutmak için ısıtıcı üzerine sürgüyü muhafaza ederken, 2. günde, forseps ile kauçuk çimento kaldırma Bir neşter bıçak ucu ile hafifçe lamel çıkarın.
11. 5 dakika ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de 0.2x SSC ile üç kez, 37 ° C'de 2 x SSC ile yıkama 3x. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 2x SSC ile bir kez yıkayın ve DNA boyama ve montaj ile devam (aşağıda Protokolü 10).
    Not: Bu yöntem, sentromerik ve perisentromerik dizileri ²² için yayınlanmış, HSV-1 spesifik problar ile birlikte tarama çözeltisi içine karşılık gelen problar kullanılarak, hücre genomik hedeflerin tespiti için izin verir.

7. Çift RNA-DNA FISH

Şekil 1, bir bakış için yeşil kutuları görebilirsiniz.

Çoklu içinbir RNA-FISH adım da dahil olmak üzere boyama işlemleri, genellikle, ilk olarak örneğin bir hedef RNA gibi tespit etme işlemini gerçekleştirmek için tavsiye edilir RNAse ve kimyasal bozulmaya karşı duyarlıdır. Buna ek olarak, DNA-FISH prosedür diğer boyama verimini azaltır tedavileri kapsar. RNA-FISH için, biz (biyotinilatlı sondalar ve peroksidaz (HRP) bağlanmış streptavidin kullanılarak Tyramide Sinyal Amplifikasyon (TSA)) bir enzim tabanlı algılama yaklaşımı seçti. TSA kovalent bir peroksidaz enzimatik reaksiyon ile dokuya bağlı bir floresan tiramid substrat (ayrıntılar için reaktif tabloya bakınız), dayanmaktadır. RNA-FISH sinyal böylece DNA-FISH sırasında korunur.

1. Başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   
   Vektör LAT lokusu in vitro transkripsiyonu için (pSLAT-2)
   1x PBS 2 mM Rvc içeren
   2 mM RVC içeren 1 x PBS içinde% 0.5 Triton X-100
   % 3 H, distile su içinde ₂ 0 _2.
   % 70,% 80,% 95 etanol, moleküler biyoloji sınıf.
   4x RNA hibridizasyon solüsyonu (Protokolü 4)
   
2. En az bir gün, RNA-FISH deneyden önce, RNA FISH prob hazırlamak. Daha önce referans ²⁶ de tarif edildiği gibi, HSV-1 Gecikme İlişkili Transkript (LAT) tespit pSLAT-2 vektörü, ³⁰ ya da LAT lokusunun in vitro transkripsiyonu için bir vektörden bir biyotinlenmiş ribo-sonda hazırlamak. Kısaca: Hind III ile pSLAT-2 10 ug Linearize ve bir DNA saflaştırma kiti ile sindirilmiş vektör arındırmak. Biyotin-16-UTP mevcudiyetinde T7 bir in vitro kopyalama kiti * ile sindirilmiş pSLAT-2'nin 2 ug tek iplikli ribo-prob sentez. Bir RNA mini sütunu ile prob arındırmak ve bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de nicelleştirmektedir. Dondurma-eritme döngüsünden kaçınmak için küçük parçalar halinde, -80 ° C'de DNAse / RNAse içermeyen su ve mağaza içinde 50 ng / ul prob seyreltin.
   Not *: biyotin-16-UTP: UTP oranı deneysel olarak tespit edilmelidir. Biz found 40:60 oranı verimli RNA-FISH ile LAT tespit probları sağlamak.
3. 1. günde, oda sıcaklığında, bir slayt tutucu slaytlar yerleştirin ve bölümler, 10 dakika boyunca kurumaya bırakın. Bir hidrofobik kalemle bölümleri daire. 10 dakika boyunca 2 mM ribonükleosit Vanadyl kompleksi (RVC) * ihtiva eden 1x PBS bölümleri rehidrate. Doku permeabilize 2 mM RVC içeren 1 x PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ile 20 dakika boyunca inkübe edin bölümleri. 1x PBS, 2 mM RVC 3x ile 10 dakika yıkanır. , Herhangi bir endojen peroksidaz etkinliğini gidermek 2 x 10 dakika boyunca% 3 H ₂ O _2'deki bölümü inkübe ve daha sonra 1 x PBS, 2 mM RVC ile bir kere yıkayın.
   * Not: RNA-FISH prosedür boyunca, (RVC) ribonükleosit vanadil kompleks RNA bozulmasını önlemek için tamponlar ve solüsyonlar da ilave edilir.
4. % 70 etanol içinde 2 x 10 dakika boyunca inkübe edin. Bu aşamada, bölümler birkaç hafta boyunca -20 ° C'de% 70 etanol içerisinde saklanabilir. % 80 içinde inkübe,% 95 ve% 100 ETH ile bölümleri kurutmakmetanolün, her biri 5 dakika. En az 10 dakika boyunca bölüm kurumaya bırakın.
   Not: Bazı durumlarda, etanol tedavi diğer hedeflerin tespiti için zararlı olabilir. % 50 formamid, bir melezleştirme aşaması kullanılarak alternatif bir protokol - 2 x SSC (üçlü boyama ile ilgili ayrıntılar için Protokol 9'da aşağıya bakınız) kullanılabilir. Ancak, etanol tedavi RNA-FISH için çok yönlü yaklaşım ve düşük arka plan sağlar.
5. Aşağıdaki gibi tarama solüsyonu hazırlayın: önceden hazırlamak, 10 ml 8x SSC, 20x Denhardt çözeltisi, 4 mM EDTA,% 40 dekstran * ihtiva eden bir 4x RNA hibritleme çözeltisi stoku. -20 ° C'de 500 ul mikro-tüpler içinde ve deposu olarak çözelti alikotu 1 slayt için 20 biyotinile LAT riboprob'un ng maya tRNA 40 ng, 2 mM RVC ve su ile 20 ul tam karıştırılarak, çözelti (50 mm x 22 mm'lik bir örtücü cam,) 80 ul hazırlar. 4x RNA hibritleme çözeltisinin 20 ul ve 40 ul ekleformamid (% 50 nihai konsantrasyon). Kolay pipetle ve karıştırma için, 75 ° C 'de 4x RNA hibritleme çözeltisi prewarm önerilir Pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın.
   * Not: 4x RNA hibritleme çözeltisi hazırlamak damıtılmış su içinde 3 ml 20x SSC içinde 4 ml dekstran sülfat, 4 g (MW 500,000) karıştırınız. Bu, 70 ° C'de 3-4 saat sonrasında çözülür, karışım, yapışkan bir hale getirir Çözmek için yardımcı olmak için düzenli olarak karıştırın. 100x Denhardt çözeltisi 2 ml ve 0.5 M EDTA solüsyonu 80 ul ekle. Su ile 10 ml tamamlayın ve bir vorteks ile iyice karıştırın. Dikkat: Yalnızca RNAse / DNaz ürünleri kullanın.
6. 75 ° C'de 10 dakika denatüre sonda Bu arada, 65 ° C'ye ayarlanmış bir slayt inkübatör slaytlar yerleştirin Bölümleri üzerine prob çözeltisinin 80 ul damla ve hızlı bir damla üzerine bir lamel yerleştirin. Dikkat: hiçbir kabarcık olmalıdır. Kabarcıklarının varlığı melezleştirme eff azalıriciency. Kuluçka lamel kapalı değildir çünkü nemli bir oda içinde yer almak zorundadır. (Malzeme tabloya bakınız) su tutun, ya da kapalı bir kutu içinde nemlendirilmiş bir odasını hazırlamak ve bir 65 ° C hibridizasyon fırında yerleştirebilirsiniz slayt inkübatör ya kullanın.
7. 65 ° C de bir gece inkübe Not: LAT RNA-FISH 37 ° C de görülmektedir prob, spesifik olmayan bağlanma önlemek için 65 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir Diğer birçok RNA-FISH problar, 37 ° C'de iyi bir sinyal ile sonuçlanmalıdır
8. 2. günde, yıkama başlamadan önce, TSA tespit kitinin üretici talimatlarına uygun olarak algılama reaktifleri hazırlar. Saptama, bir yaban turbu peroksidazı (HRP) bağlanmış streptavidin ve bir yeşil veya mavi floresan alt-tabaka da dahil olmak üzere, ticari TSA tespit kiti ile gerçekleştirilir.
9. 65 ° C'de slayt ısıtıcı slaytlar tutun Dikkatlice lamel kaldırmak ve hızlı bir şekilde 2x SSC% 50 formamid 1 ml ekleyin, önceden ısıtılmış birt 65 ° C. Dikkat bölüm kuru izin vermeyin. 65 ° C'de 2 x SSC,% 50 formamid içinde 65 ° C 'de iki kez 10 dakika yıkanır ve 2 x SSC içinde 10 dakika 2x 2x SSC ile bir kez daha yıkayın ve 37 ° C slayt ısıtıcı üzerinde slayt yerleştirin.
10. TSA tespit kiti üretici talimatına göre algılama adım ile devam edin. HRP-streptavidin konsantrasyonu, fluoresan alt-tabaka konsantrasyonu ve tepkime zamanıdır ampirik * tespit edilmelidir. 1/500 seyreltilmiş HRP-streptavidin, mavi ve yeşil floresan floresan için 1/500 için 1/100 floresan reaktif ve 10 dakika reaksiyon süresi: LAT RNA saptanması için, rutin olarak aşağıdaki koşulu kullanılabilir. Sinyal hızla DNA FISH ile geçmeden önce, montaj olmadan ters bir floresan mikroskop ile kontrol edilebilir.
    * Not: amplifikasyon protokolü denemenin ana hedefleri doğrultusunda tasarım olacaktır. Örneğin, ince bir hedef RNA lokalize etmek için, bu ad olduğukısa reaksiyon zamanı kullanmak revizesi. Buna karşılık, hızlı bir şekilde tanımlamak ve düşük büyütmede pozitif hücreleri saymak için, reaksiyon süresi, parlak bir sinyal oluşturmak için arttırılabilir.
11. DNA FISH için, maskelenmesinin adım (6.2 adım) başlayarak, yukarıda belirtilen prosedürü takip edin.

8. Immuno-DNA FISH

Şekil 1, bir bakış için mor kutuları görebilirsiniz.

Benzer RNA-DNA-FISH, DNA-FISH proteinler denatüre ve antikorlar ile onların algılanmasını önlemek için muhtemel olduğundan, ilk imünoflöresanmı gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Immünofloresan sinyalin kalitesi antikor özelliklerine oldukça bağlıdır ve çeşitli antikorlar, mümkün olan her durumda test edilmelidir. Epitop maskelenmesinin protein tespiti ve DNA-BALIK hem de geliştirmek için immünofloresans önce bir kez gerçekleştirilir. DNA FISH işlemi sırasında numune üzerinde immünofloresans sinyalini korumak için o cov için gereklialently dokuya bağlamak. Biz burada bizim ellerde iyi sonuçlar sağlanan iki yaklaşım, antikor fiksasyonu sonrası ve tiramid tabanlı algılama (adım 8.5) sunuyoruz. Her hedef seçimi / antikor çifti için ön testlerle sürülmelidir.

1. Başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   
   1x PBS% 3 normal keçi serumu (NGS) ihtiva etmektedir.
   1x PBS içinde% 2 PFA (% 4 stok çözeltiden seyreltme)
   
2. 1. günde, ilk adımlar (6,1-6,2 adımlar) maskelenmesinin adıma kadar, DNA-FISH ile aynıdır.
3. Deşifre sonra, 1 x PBS, 1 saat boyunca% 3 NGS içeren bölümleri inkübe edin.
4. 24 saat boyunca% 3 NGS içeren PBS içinde 1x seyreltilmiş primer antikor ile inkübe edin. Biz bir gecelik inkübasyon süresi daha güçlü bir sinyal ile sonuçlanır olduğu bulunmuştur, ancak düşük inkübasyon süresi, protokol kısaltmak için kullanılabilir. Inkübasyon kadar 48-72 saat gibi IgM olarak düşük afinite birincil antikorlar için gerekli olabilir.
5. Günde2, 1x PBS ile 3 kez 10 dakika yıkama.
6. Antikor ile tespit sonrası Protokol:% 3 NGS içeren PBS içinde 1 x 1/200 ile bir yeşil floresan boya ile birlikte, ikincil antikor ile 1 saat inkübe edilir. 1x PBS ile üç kez 10 dakika yıkayın. Post-sabitleme, 10 dakika * 1x PBS içinde% 2 PFA ile gerçekleştirilir. 1x PBS ile 3 kez 10 dakika yıkayın.
   TSA algılama Protokolü:% 3 NGS içeren 1 x PBS içinde 1/250 olarak ve HRP ile birleştirilmiş ikinci bir antikor ile 1 saat inkübe edilir. 1x PBS ile üç kez 10 dakika yıkayın. Üretici talimatlarına göre tiramid algılama ile devam edin. (Adım 7.9), reaktif seyreltme ve reaksiyon süresi, yukarıda belirtildiği gibi, deneysel olarak tespit edilmelidir. Çoğu durumda, protokol floresan alt-tabakanın bir 1/500 seyreltme ile, 10 dakikalık bir reaksiyon süresi dayalı olmuştur. 1x PBS ile 3 kez 10 dakika yıkayın.
   * Not: Post-fiksasyon immün-FISH kritik bir adım olduğunu ve dikkatli kurulum gerektirir. Fiksasyonu sonrası güçlüdaha iyi bir IF sinyali ve alt DNA-FISH verim.
7. Metanol-asetik asit, aşama (adım 6.3) için DNA-FISH devam edin. Immüno-DNA-FISH süresi bir gece boyunca inkübe birinci antikor ile, genellikle 3 gündür.

9. İmmünofloresan ile birleştiğinde çift DNA-RNA BALIK

Şekil 1, bir bakış için turuncu kutuları görebilirsiniz.

RNA-FISH, önce gerçekleştirilen immünofloresan takip ve son olarak DNA-balıktır. Imüno-tiramid reaksiyon ile tespit edilirse, o H, ₂ O ₂ RNA-FISH aşama tamamen HRP aktivitesi söndürmek için ve bu söndürme etkili olduğunu teyit etmek için bir anahtardır. Bu bir slayt bir "birincil antikor" kontrol olarak kullanılarak yapılır.

Etanol bazlı bir çözücü dehidrasyon duyarlı proteinler için zararlı olduğu için, RNA-FISH bu adım immünofloresan inhibe edebilir. Bu durumda, RNA-FISH w yapılabilirstpe 9.3 aşağıda ayrıntılı olarak i'inci alternatif bir protokol.

1. Başlamadan önce aşağıdaki çözümü hazırlayın:
   
   2 mM RVC içeren 1 x PBS içinde% 50 formamid
   
2. 1. günde, RNA-FISH prob hazırlamak ve H ₂ O ₂ söndürme adım (adım 7.2) kadar, çift RNA-FISH gibi devam edin.
3. Örnek 1, imüno-lekeleme etanol dehidrasyondan sonra çalışır: 7,3-7,9 adımda, yukarıda belirtildiği gibi, RNA-FISH devam edin. Sonra aşağıda 9,6 adıma geçin.
4. Örnek 2, imüno-lekeleme işlemi ile etanol önlenir: 65 ° C'ye ayarlanmış bir slayt ısıtıcı nemlendirilmiş bir odada slaytlar koyun ve% 50 formamid, 1 x PBS, ve 2 mM RVC ihtiva eden bir çözelti içerisinde melezleştirme 1.5 saat süre ile inkübe edilir. Ön-hibritleme çözeltisi boşaltın ve adım 7.4 ve 7.5 'de belirtildiği gibi, hibridizasyon çözeltisi 80 ul bırakın. Daha sonra belirtildiği gibi abov-RNA hibridizasyon ve FISH algılama ile devamadımları 7,6-7,9 (gün 2 ve 3) e.
5. RNA-FISH tamamlandıktan sonra 2. günde, immüno-DNA-FISH maskesinin aşama (adım 6.2) ile başlayarak devam edin. Daha sonra, adımlar 8,2-8,6 yukarıda belirtildiği gibi bağışıklık-DNA-FISH protokolü takip edin.

10. Slayt Montaj ve Görüntüleme

1. Başlamadan önce aşağıdaki çözümü hazırlayın:
   
   1x PBS içinde 0.5 ug / ml 'de Hoechst 33342
   
2. DAPI ve Hoechst 33342 *, 10 dakika boyunca 1 x PBS içinde 0.5 ug / ml 'de 10 dakika boyunca Leke çekirdekleri. 1x PBS ile 3 kez 10 dakika yıkayın.
   Not *:. Dikkat algılama sistemlerinden biri bir floresan mavi boya kullanıyorsa, DAPI veya Hoechs kullanmayın. Bunun yerine, Topro3 olarak uzak-kırmızı bir dalga boyu olan bir emisyon spektrumu ile bir floresan DNA boyalardır.
3. Slayt mümkün olduğunca fazla sıvı boşaltın. Sürgünün bir ucunda bir solmanın maddesi içeren montaj ortamı 80 ul bırakın. Bir yüksek optik kalite ile bölümleri kapsayacaklamel (n 1,5 cam °). Lamel kabarcıklar olmadan bölümünün üzerine montaj orta yayılmasını izin için, forseps ile bir ucunda muhafaza edilerek yavaş yavaş gidelim.
4. Karanlık bir slayt kutuda 4 ° C'de oje ve mağaza ile kapatılmalıdır.
5. Latent HSV-1 Genomların DNA FISH sinyali doğrudan gözlem yüksek sayısal diyafram ile 40X veya daha yüksek büyütme immersiyon yağı hedefi, (örneğin 40X NA 1.1, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) ve uyarma ışık kaynağı gerektirir 100 W cıva buharlı lamba en azından eşdeğer. Biz (ekipman tabloya bakınız) gibi son 5 yılda üreticileri tarafından sağlanan gibi bir yüksek verimli iletim mikroskop kullanarak öneriyoruz. Mikroskopisi gibi ince ince kesilir veya spektral görüntüleme vadesi doku otomatik floresan daha düşük arka plan görüntüleri, toplamak için araçlar sağlar.

Sonuçlar

Kapsamlı test birkaç ay sonra, ısı bazlı kimyasal maskesinin floresan in situ hibridizasyon için latent HSV-1 genomu hazır olduğunu keşfetti. Bu işlem sırasında, çeşitli prosedürler maskesinin denenmiş ve sadece ısıya dayalı tedaviler (örneğin bir mikrodalga fırın içinde alt kaynama sıcaklığına kadar ısıtılması bölümleri) etkili ortaya çıktı. Biz sonra rutin 0.01 M pH 6.0 sitrat tamponu (hepimizin çalışmalarda kullanılan), 1x PBS, 1 mM EDTA, 0.1 M dahil epitopla...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol Fare nöronal doku bölümlerinin nöronlar içinde HSV-1 genomu latent algılanmasını sağlar. Viral gen ekspresyonunu düzenleyen yollarının anladığımız nöronal dokular içinde in situ HSV-1 genomik DNA tespit etmek için bir yöntem eksikliği ile sınırlanmıştır. Genom kopya sayısı ve enfekte nöronların oranına ilişkin bilgiler ayrışmış nöronlar ^11,12 PCR analiz ağırlıklı geldi. HSV-1 gecikme üzerindeki rolü teklif konak hücre nükleer mi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice	Janvier, France		6 week-old females
HSV-1 strains	SC16 strain (wild type)		See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride	Sigma	K2753	Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline	Sigma	07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile)	Life Technologies	10010-015
Sucrose	Sigma	84100	Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	SAKURA	4583
Large vector DNA purification kit	Qiagen	12462	To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kit	Roche Applied Sciences	10 976 776 001
Cy3-dCTP	GE Healthcare	PA53021	Protect from light
0.5 M EDTA	Sigma	E6758
G50 Mini spin column	GE Healthcare	27-5330-01
Salmon sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Ethanol molecular biology grade	Sigma	87047	Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Formamid Molecular biology grade	Sigma	F9037	Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe	Enzo Life Sciences	ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
20x Saline Sodium Citrate (SSC)	Sigma	S6639	Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100	Sigma	T8787	Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0	Sigma	S1804	Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic Acid	Sigma	320099
Methanol, molecular biology grade	Sigma	322415
Dextran sulfate - MW 500,000	Euromedex	EU0606-A
Denhardt's solution (100x)	Euromedex	1020-A
Rubber Cement "FixoGum"	Marabut	290110000
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
T7 in vitro transcription kit	Ambion Life Technologies	AM1314
Biotin-16-UTP	Roche Applied Sciences	11388908910
RNA purification minicolumn	Qiagen	73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex	New England Biolabs	S1402S
H2O2	Sigma	H3410	Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA	Invitrogen	15401011	prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000
Primary antibodies	any supplier		The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies	Invitrogen Life Technologies		The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20937	TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen Life Technologies	H3570	Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass	Electron Microscopy Sciences	72204-04
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides	FisherScientific	12-550-15
Equipment/Material	Company	Reference	Note
Needle for infection			Glass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipment	Moria, France		Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump	Cole Palmer Instruments		Easyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump)	kdScientific	KDS310
Cryostat	Leica France	CM 1510-1
-80 °C freezer	Sanyo		Ultra Low -80 °C
Domestic microwave oven
Dry block heater	Eppendorf	022670204
Incubator Slide moat	Boekel Scientific	240000
Coplin Jar	Dominique Dutscher	68512
Staining glass container	Dominique Dutscher	68506
Fluorescent microscope	Zeiss		The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series