A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

Resumo

Foi estabelecido um protocolo de hibridização fluorescente in situ para a detecção de um genoma do vírus de ADN persistente nas secções de tecido de modelos animais. Este protocolo permite estudar processo de infecção por codetection do genoma viral, os seus produtos de ARN, e proteínas virais ou celulares no interior das células individuais.

Resumo

Codetection uma única célula de um gene, o seu produto de ARN e as proteínas reguladoras celulares é fundamental para o estudo da expressão gênica. Este é um grande desafio no campo da virologia e, em especial para os vírus de ADN persistentes-replicante nucleares que envolvem modelos animais para o estudo. Tipo de vírus Herpes simplex 1 (HSV-1) estabelece uma infecção latente ao longo da vida nos neurônios periféricos. Vírus latente serve como reservatório, a partir do qual reactiva e conduz a um novo episódio herpético. A biologia da célula de HSV-1 latência permanece mal compreendida, em parte devido à falta de métodos para detectar o HSV-1 genomas in situ em modelos animais. Descreve-se um DNA-hibridação in situ fluorescente (FISH) abordagem de detecção eficiente de baixa cópia genomas virais dentro das seções de tecidos neuronais a partir de modelos animais infectados. O método baseia-se à base de calor antigénio desmascaramento, e as sondas de ADN caseiros directamente marcados ou sondas disponíveis comercialmente. Desenvolvemos um stai triploabordagem ning, combinando DNA-FISH com RNA-FISH e imunofluorescência, utilizando peroxidase baseado amplificação de sinal para acomodar cada requisito de coloração. Uma grande melhoria é a possibilidade de obter, dentro de 10 um secções de tecido, os sinais de baixa de fundo que pode ser fotografada em alta resolução por microscopia confocal e de campo amplo epifluorescência convencional. Além disso, a coloração tripla trabalhou com uma ampla gama de anticorpos dirigidos contra as proteínas virais e celulares. O protocolo completo leva 2,5 dias para acomodar o anticorpo e a penetração da sonda no interior do tecido.

Introdução

Vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) é um vírus humano neurotrópico persistente, que estabelece uma infecção latente a longo prazo nos neurónios do gânglio trigeminal (TG) do sistema nervoso periférico, a partir do qual reactiva periodicamente para replicar e propagação. O HSV-1 é um genoma de 150 kb de dsDNA de localizações no núcleo do neurónio hospedeira, onde permanece como chromatinized plasmídeos multicópia, que não se integram no genoma da célula hospedeira ^{de 1,2.} Durante a latência, o programa genético de HSV-1 do ciclo replicativo é fortemente reprimida, e a expressão do gene é restringida ao transcrito associado à latência (TAL), locus de estabelecimento de latência para o início da reactivação ^3. LAT produz um longo 8,5 kb não codificante RNA transformado em um grande 2 kb lariat estável, e vários miRNA ^4-7. HSV-1 latência é assim caracterizado pela presença do ADN genómico virai, o ARN LAT, e a ausência de proteínas do ciclo replicativo detectáveis.

ONTEÚDO "> Os modelos animais, predominantemente rato e coelho, são modelos experimentais recapitulando várias características de latência em humanos. Um dos principais interesses desses modelos é que eles permitem estudar aspectos fisiológicos do HSV-1 latência em hospedeiros imunocompetentes. Nas últimas décadas , muitas ferramentas experimentais, tais como vírus e ratinhos geneticamente modificados, foram desenvolvidos para estudar a fisiologia, genética e biologia celular do HSV-1 de latência, a partir de tecidos animais. Até agora, ADN genómico virai foi detectado e quantificado por mancha de Southern e qPCR de TGs dissociada. No entanto, não existe presentemente nenhum método disponível para a detecção de HSV-1 do genoma por hibridização in situ em secções de tecido ^8. Consequentemente, a latência é rotineiramente avaliada em seções histológicas, através da detecção de LAT RNA por hibridação in situ de ARN em vez de A detecção do genoma viral. Porque não tem sido possível caracterizar as células infectadas com base na presença de genomas virais, this limitação técnica tem sido uma grande desvantagem para a análise de muitos aspectos das interacções hospedeiro-vírus, tais como a relação entre o genoma viral e a expressão de genes celulares e virais ou do hospedeiro mediadas por células de resposta imune ^9,10.

Mais importante ainda, a heterogeneidade da célula-a-célula da infecção latente permanece relativamente inexplorado e foi mostrado ser uma característica chave de latência em ratos e em neurónios sensoriais ganglionares humanos implantados em ratos SCID ^11-17. Tipicamente, foi mostrado por qPCR que o genoma de HSV-1 Número de cópia por célula varia de 5 a várias centenas. Embora LAT aparece como um regulador chave da latência e reativação, os dados de qPCR em neurônios isolados e in situ PCR indicaram que apenas um subconjunto de neurônios latentes infectadas, tão baixo quanto 30%, expressa o locus LAT ^11,12,18-21. Como a célula hospedeira e o ambiente celular no tecido impacto sobre o estabelecimento de latência do vírus ea expressão do gene viral permanece obscura. Descrevemos aqui um sólido fluorescente de hibridização in situ (FISH), o método para a detecção eficiente de baixa cópia de HSV-1 de ADN genómico dentro de secções de tecido de animais neuronais. Este método foi desenvolvido e utilizado por nós para obter acesso a resolução da microscopia de imagem de alta que é necessário estudar a interação do genoma viral com a célula hospedeira componentes intra-nucleares ^22. Além disso, é descrito um método de coloração de múltiplos para a detecção simultânea do DNA viral com RNA e proteínas, o que é uma ferramenta única para descrever as interacções vírus-hospedeiro que regulam a expressão de genes virais. O método também pode ser aplicado a uma ampla gama de análises que requerem a detecção de HSV-1 do genoma latente, tais como a quantificação neurónios infectados em grande número de secções. Um passo fundamental é aplicar o tratamento de recuperação antigênica para fazer o DNA viral acessível a hibridização. Assim, este protocolo também pode ser eficiente para a detecçãode outros vírus dsDNA, que não são atualmente detectável por abordagens DNA-FISH convencionais dentro tecidos animais.

Protocolo

Este método foi utilizado num estudo publicado anteriormente ^22. Para o fundo geral e descrição de manipulação convencional em ISH, IF e FISH, sugerimos o seguinte literatura disponível ^23.

1. Infecção Animais

Todos os procedimentos envolvendo animais experimentais conformados com as questões éticas da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em pesquisa, e foram aprovados pelo Comitê de Ética local do UPR-3296-CNRS, em conformidade com a Comunidade Europeia Directiva 86/609/CEE do Conselho. Todos os animais receberam acesso ilimitado a comida e água.

O método de infecção do rato com o HSV-1 descrito abaixo foi usado em estudos anteriormente publicados ^24-26.

1. Prepare as seguintes soluções para se preparar antes de partida:
   
   Solução HSV-1 estoque de vírus
   Solução anestesiar - cetaminae-100 mg / kg e xilazina, 10 mg / kg
   
2. Tome-se 1 ml de vírus (10 ⁶ pfu) numa micro-seringa 5 ul de vidro, ligado a um dispositivo de entrega de bomba de micro-seringa de 0,1 mL / seg Nota:. Ressuspender o stock de virus em meio isento de vermelho de fenol para ver o limite entre o óleo vermelho apresentar no capilar e a solução de vírus e para evitar a injecção de ar no local da inoculação com o vírus.
3. Coloque o rato anestesiado (Ketamina-100 mg / kg e xilazina-10 mg / kg) em suas costas viradas para cima.
4. Posicione a cabeça do rato anestesiado sob uma binocular estéreo-microscópio e inserir a agulha na camada subepitelial do lábio superior esquerdo na fronteira mucocutânea. Injectar a solução de vírus em dois passos (por duas vezes 0,5 ul) a uma velocidade de 0,5 ul por 5 s Nota:. Respeitar uma pausa de 10 segundos entre as duas injecções de 0,5 ul, para permitir que a suspensão viral para absorver no local da injecção.
5. Posicione o mouse ema 37 ° C incubadora até despertar.
6. Deixar o rato nas instalações animais recuperar durante o tempo necessário Nota:. No modelo de rato, o HSV-1 induz uma infecção primária, chamada de infecção aguda, que dura menos de 10 dias, no local da inoculação e após vários tecidos neuronais incluindo Os TGs, gânglios cervicais superiores (SCG), e gânglios da raiz dorsal (DRG), dependendo do local de inoculação. Sinais de infecção primária progressivamente desaparecer e latência é considerado plenamente estabelecida cerca de 28-30 dias pós-infecção (dpi) em diante. Tecidos neuronais pode ser colhida a partir de 4 dpi geralmente para estudos de infecção aguda, e a partir de 28 dpi para estudos de latência.

2. Rato Perfusão-fix

1. Preparar as seguintes soluções antes da partida: 50 ml de tampão de soro fisiológico
   
   60 ml de PBS 1x
   150 ml de preparado de fresco a 4% de paraformaldeído em PBS 1x
   60 ml de 20% de sacarose em PBS 1x.
   
2. Prepare o sistema de perfusão: conectar a agulha para um capilar, o qual está ligado a uma bomba peristáltica.
3. Anestesiar o rato, como descrito acima (SREP 1.2) e colocá-lo em suas costas em uma bandeja de dissecação, presa por quatro pernas com pinos.
4. Com uma tesoura cortar a pele da barriga até a garganta *. Jogue fora a camada de tecido fino que cobre os órgãos. Abrir a caixa torácica, cortando as nervuras de um lado do esterno. Retire a pele, arrancando. Afaste-se uns aos outros a partes direita e esquerda da caixa torácica para revelar o coração Nota:. Preste atenção para não inciso coragem, pulmões e grandes vasos (artérias carótidas e veias jugulares), o que tornará orvalhar-fixação impossível.
5. Insira a agulha no ventrículo esquerdo *. Inciso átrio direito com a tesoura. Prossiga com a sangria, injetando 20 ml de soro fisiológico nos vasos sanguíneos através do coração. Deixe o fluxo de sangue no tabuleiro. Semte: Durante este procedimento, prestar atenção para não perfurar através do outro lado do coração.
6. Perfundir com 150 ml de PFA 4% em 1x PBS durante 15 min * (Atenção: PFA é tóxico, manipular sob coifa). Perfundir 60 ml de 20% de sacarose em PBS 1x, durante 6 min. Nessa fase, o mouse está pronto para a colheita TG Nota:. Defina a bomba a 10 ml / min. Uma boa perfusão é perceptível quando a cauda do rato endurece-se, levante-se, em seguida, cair de novo.

3. TG colheita

1. Prepare a seguinte solução antes de começar:
   
   20% de sacarose em PBS 1x
   
2. Cortar a cabeça ao nível do pescoço. Cortar a ponta do nariz, logo atrás dos incisivos, a fim de revelar a cavidade nasal. Faça uma incisão na boca em dois com uma tesoura e afastar-se de cada lado do palato Nota:. TGS aparece logo abaixo da boca, como duas massas brancas e oblongo de 2-3 mm de comprimento localizado no lado direito edo lado esquerdo e ligado ao nervo trigeminal.
3. Corte os ramos do nervo trigêmeo em cada lado da TGs para liberar o TGs do tronco cerebral. Retire a TGs com um alicate cirúrgicos e mantê-los em uma solução estéril de sacarose 20%, durante 24 horas Nota:. Use dois destinatários diferentes para a esquerda e TGs direita, para evitar a confusão entre o TG esquerda (infectados) eo TG direito (ou não fracamente infectado). Incubar a TGs em 20% de sacarose em PBS 1x, durante 24 h antes de embutir.
4. Embed TGs em um único bloco em cryosectioning incorporar médio e congelar a -80 ° C.
5. Blocos de armazenar a -80 ° C até o corte.

4. Criocorte Preparação

1. Corte as longitudinalmente TGs como 10 mM seções em um -20 ° C criostato, e colocá-los em um pouco aquecidas lâminas (30 ° C) Superfrost. Deixe as fatias de secar durante 5-10 min, em seguida, congelar e armazenar a -80 ° C até à sua utilização Nota:. Até 4-5 secções pode ser placed em uma única corrediça, se grande número de secções está a ser processadas ao mesmo tempo. Procedemos como se segue: as secções seriadas são depositadas em três séries de lâminas marcado A1, B1, C1 e, em seguida, A2, B2, C2 e assim por diante. Assim, cada série de lâminas (A, B, e C) podem ser processados ​​para a coloração diferente (hibridização in situ, FISH, a RCP in situ, LCM) e os dados obtidos com as diferentes técnicas podem ser comparados sabendo que as lâminas que transportam o mesmo número correspondem para a mesma região do TG.

5. HSV-1 Sonda Labeling

O protocolo a seguir descrito para a detecção de HSV-1 do genoma de ADN FISH tem sido usado com sucesso com os dois tipos de sondas. O primeiro é um Cy3 marcado sonda fluorescente caseiro que é adequado para a análise fina de organização nuclear dentro de células individuais, por microscopia de fluorescência de alta ampliação. A segunda é uma sonda biotinilada disponíveis comercialmente, que podem ser combinard com a amplificação de sinal com base em peroxidase para proporcionar um sinal luminoso. O último é adequado para a identificação e quantificação do vírus, contendo neurónios a baixa ampliação da secção inteira, e para a análise dos padrões do genoma de HSV-1. Os utilizadores finais devem avaliar qual abordagem se encaixa melhor o objetivo de seu estudo. A sonda disponível comercialmente está listado na secção de reagente, e a preparação da sonda de casa--se descrito abaixo.

1. Prepare as seguintes soluções antes de começar:
   
   HSV-1 do genoma que contém vetores (veja o passo 1)
   Etanol a 70%, grau de biologia molecular.
   
2. . Preparar cosmídeos contendo porções de 30 kb do genoma de HSV-1 (cosmídeos número 14, 28 e 56 descritos em referência ²⁰ usando colunas de purificação dedicados a grandes vectores Nota: Outro tipo de bibliotecas contendo genomas de HSV-1, tais como cromossomas artificiais de bactérias deve trabalhar bem, desde que as capas de sonda aiparcela arge do HSV-1 do genoma para produzir o sinal suficiente ^27-29. Em nossas mãos, as sondas feitas a partir do backbone cosmidico vetor não produziu qualquer sinal, e foram usados ​​como controle negativo. Vetores cosmid Assim inteiras contendo HSV-1 seqüência foram usados ​​em nosso estudo. Também é possível cortar a seqüência de HSV-1 e usá-lo para preparar a sonda.
3. . Etiqueta 2 ug de cada cosmídeo com Cy3-dCTP utilizando um kit de nick-tradução de acordo com as orientações do fabricante Nota: Executar a marcação com uma mistura de reacção contendo apenas Cy3-dCTP e não dCTP não marcado.
4. Parar a reacção por adição de 3 mL de 0,5 M de EDTA na mistura e aquecimento a 70 ° C durante 10 min. Arrefecer em gelo.
5. Purificar a sonda em um minicoluna exclusão gel G50. Adicionar 150 mg de DNA de esperma de salmão com a sonda e precipitar a sonda por precipitação com etanol. O sedimento de DNA deve ser rosa devido à incorporação Cy3. Lava-se a pastilha com etanol a 70% e remover o máximo de etanolquanto possível, com uma pipeta. Não deixe que o pellet seco.
6. Dissolver o pellet com 100 ml de formamida deionizada (Atenção: formamida é tóxico Manipular sob coifa.). A concentração da sonda não pode ser mensurado de forma confiável neste momento. As quantidades das sondas mencionadas no texto referem-se à quantidade de ADN molde utilizado para fazer a sonda. O protocolo a ser baseado em 2 ng de molde de ADN e 100 ml de formamida, que é considerado como sendo de 20 ng / ul. Armazenar a -20 ° C. A sonda marcada pode ser preparada em grandes quantidades e armazenadas congeladas durante vários meses.

6. DNA-FISH

A Figura 1 mostra uma visão geral dos principais passos do protocolo de ADN FISH, e como realizar ADN FISH, como parte de uma experiência de marcação múltipla de codetect RNA e proteínas, tal como descrito em Protocolos 7-9.

1. Prepare as seguintes soluções antes de começar:
   
   0,5% de Triton X-100 em PBS 1x
   2x SSC e tampão SSC 0,2 x
   PH 100 mM de tampão de citrato 6,0 (10x solução de reserva) e 10 mM pH 6,0 tampão de citrato (solução de trabalho)
   Tampão de hibridação 2x (ver Protocolo 4)
   
2. No dia 1, coloque as lâminas em porta-lâminas à temperatura ambiente, e deixa as secções secar durante 10 min. Circule as seções com uma caneta hidrofóbica. Reidratar as seções em 1x PBS por 10 min. Incubar as secções de 20 min com 0,5% de Triton X-100 em 1x PBS para permeabilizar o tecido. Lavar 3x 10 min com 2x SSC, e manter-se em 2x SSC, até o tampão de desmascaramento é aquecido (ver abaixo).
3. Para desmascaramento, preparar uma bandeja lâmina de vidro (capacidade 20 slides) cheia com 200 ml de tampão de citrato de sódio 10 mM (pH 6,0). Colocar o tabuleiro num recipiente maior cheio com 500 ml de água destilada. Esta configuração permite um melhor controle de pulsos de aquecimento. Antes de colocar os slides na bandeja, pré-aqueça o tampão no forno de microondas até a buffer atinge ebulição (cerca de 8 minutos a 800 W).
4. Colocar as lâminas na bandeja contendo tampão citrato a pré-aquecido, e verifique se eles são completamente cobertas com tampão. Aquecer durante cerca de 20 segundos até que a memória intermédia atinge ebulição. Cuidado, não deixe que o tampão sobre ferver, o que pode danificar o tecido. Esfriar à temperatura ambiente por 2 min. Repita o ciclo de aquecimento 6x (7 ciclos de aquecimento no total) *. Refresque-se 2 min e transferir os slides em 2x SSC por 5min.
   * Nota: Este é um dos passos mais críticos. O número óptimo e duração de ciclos de aquecimento deve ser determinado empiricamente, e pode variar de acordo com o tipo de tecido ou do tipo de sonda utilizada. O micro-ondas, a bandeja, o recipiente e o volume do tampão do tabuleiro e da água no recipiente deve ser mantida idêntica para a reprodutibilidade de desmascaramento. Ebulição excessiva pode resultar em perda de tecidos e células danificadas. Para cada pulso de aquecimento, o aparecimento de ebulição é cuidadosamente observado e calorção deve ser parar em primeiros sinais de ebulição. Uma vez configurado, o desmascaramento aparece robusto e reprodutível Figura 2A. Mostra que o HSV-1 do genoma pode ser detectado por desmascaramento com diferentes tampões, indicando que as condições de desmascaramento pode ser ainda mais explorado. Desmascaramento baseado em Citrato foi encontrado para fornecer consistentemente bom sinal FISH, e preservação de tecido, com seções de vários modelos de laboratório e animais.
5. Incubar as lâminas em uma mistura de metanol: ácido acético: Mistura de PBS (03:01:04) durante 15 min, em seguida, numa mistura de metanol: mistura de ácido acético (3:1) durante 15 minutos (cuidado: ácido acético é corrosivo Manipular sob fumos. capô e usar proteção adequada. Prepare esta solução certa antes do uso).
6. Desidratar a secção, através de sucessivas de 10 min de incubação em 70%, em seguida 2x 10 min em etanol a 100%. Deixar secar à temperatura ambiente durante 10 min. Manter em local seco até sondagem.
7. Prepare a solução de sondagem da seguinte forma: se preparar com antecedência um estoque de co tampão de hibridação 2x 20 mlntaining 20% ​​de sulfato de dextrano (MW 500.000), solução de Denhardt 2x, 4x SSC *. Alíquota da solução como 500 mL em microtubos e armazenar a -20 ° C. Para 1 slide (lamela de 22 x 50 mm), misturar 90 ng de HSV-1 sonda Cy3 marcado (30 ng de sonda para cada cosmidico) e completar o volume para 40 mL com formamida. Adicionar 40 ul de tampão de hibridação 2x. Misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes.
   * Nota: Para preparar o tampão de hibridação 2x, mistura de 4 g de sulfato de 500.000 MW de dextrano em 10 ml de água destilada. Faz uma mistura viscosa que se dissolvem após 3-4 horas a 70 ° C. Misture regularmente para ajudar a dissolver. Adicionar 4 ml de 20x SSC, a 400 mL de solução de Denhardt 100x. Completar para 20 ml e misture bem com um vórtice.
8. Queda de 80 ml de solução de sondagem para as seções secas. Cubra com uma lamela de 22 x 50 mm de vidro, e verificar que a solução sondagem espalha sobreToda a superfície da lamela. Cuidado: não deve haver bolhas. A presença de bolhas diminui a eficiência de hibridação. Selar a lamela utilizando cimento de borracha, e deixe secar. Mantenha os slides no escuro à temperatura ambiente por pelo menos 2 horas para o sinal de hibridização ideal durante todo o slide.
   Nota: cimento de borracha é conveniente, pois seca rapidamente, é resistente à água e protege a amostra de secagem durante a hibridação. Também é fácil de descascar para remover a lamela após hibridização. Nail polonês é uma alternativa eficiente, mas opção mais conveniente.
9. Continuar com a desnaturação, colocando os diapositivos numa incubadora corrediça 80 ° C durante 5 min. Alternativamente, coloque as lâminas num tabuleiro de metal e colocar o tabuleiro num banho de água a 80 ° C (o tabuleiro deve flutuar). Em seguida, transferir rapidamente as lâminas para um tabuleiro metálico colocado em gelo. Deixe por 5 min. Transferir as lâminas a 37 ° C (aquecedor de slides ou incubadora) para a hibridização durante a noite.
   Nota: Nós não recomendamos mais curto hibridização, o que resulta em fraco ou sem sinal.
10. No dia 2, remover o cimento de borracha com uma pinça, enquanto se mantém a corrediça para o aquecedor para manter a secção a 37 ° C. Retirar a lamela suavemente com a ponta de uma lâmina de bisturi.
11. Lavar 3x com 2x SSC a 37 ° C durante 5 min, e três vezes com 0,2 x SSC a 37 ° C durante 5 min. Lavar uma vez com SSC 2x à temperatura ambiente durante 5 min e prosseguir com a coloração do ADN e a montagem (ver Protocolo 10 abaixo).
    Nota: Este método permite a detecção de alvos genómicos celulares, por utilização de sondas correspondentes na solução de sondagem em conjunto com o HSV-1 como sondas específicas para publicado centromérica e sequências pericentroméricas ^22.

7. Dupla de ARN-ADN FISH

Veja a Figura 1, caixas verdes para uma visão geral.

Para múltiplacoloração procedimentos, incluindo um passo de RNA-FISH, é geralmente aconselhável primeiro realizar a detecção de RNA alvo, como tal, é sensível à degradação por ARNase e produtos químicos. Além disso, o procedimento de ADN FISH inclui tratamentos que reduzem a eficiência da outra coloração. Para RNA-FISH, escolhemos uma abordagem de detecção de enzima com base (tiramida Signal Amplification (TSA), utilizando sondas biotiniladas e peroxidase (HRP) estreptavidina acoplada). TSA baseia-se num substrato de tiramida fluorescente (ver tabela reagente para detalhes), que está covalentemente ligada ao tecido através de uma reacção enzimática da peroxidase. O sinal de RNA-FISH é assim preservados durante a ADN-FISH.

1. Prepare as seguintes soluções antes de começar:
   
   Vetor para transcrição in vitro do locus LAT (pSLAT-2)
   1x de PBS contendo 2 mM de RVC
   0,5% de Triton X-100 em 1x PBS contendo 2 mM de RVC
   3% _de H ₂ 0 ₂ em água destilada.
   70%, 80%, etanol a 95%, grau de biologia molecular.
   Solução de hibridização RNA 4x (ver Protocolo 4)
   
2. Pelo menos um dia antes do experimento RNA-FISH, preparar a sonda FISH RNA. Para detectar o HSV-1 latência Associated Transcrição (LAT), preparar uma ribo-sonda biotinilada do vector pSLAT-2 ^30, ou outro vector para a transcrição in vitro do locus LAT, como anteriormente descrito em referência ^26. Resumidamente: Linearize 10 ug de pSLAT-2 com Hind III e purifica-se o vector digerido com um kit de purificação de ADN. Sintetizar um fio único ribo-sonda a partir de 2 ug de digerida pSLAT-2 com uma T7 in vitro kit de transcrição na presença de biotina-16-UTP *. Purifica-se a sonda com uma mini-coluna de RNA e quantificar a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. Diluir a sonda a 50 ng / mL em DNAse / RNAse livre água e armazenar a -80 ° C, em pequenas alíquotas para evitar ciclos de congelamento-descongelamento.
   * Nota: A biotina-16-UTP: UTP proporção deve ser determinada empiricamente. Nós found proporção 40:60 para proporcionar sondas de detecção eficiente LAT pela RNA-FISH.
3. No dia 1, coloque as lâminas em porta-lâminas à temperatura ambiente, e deixa as secções secar durante 10 min. Circule as seções com uma caneta hidrofóbica. Reidratar as seções em 1x PBS contendo 2 mM ribonucleosido Vanadyl Complex (RVC) * por 10 min. Incubar as secções durante 20 minutos com 0,5% de Triton X-100 em 1x PBS contendo 2 mM de RVC para permeabilizar o tecido. Lavar 3x 10 minutos com PBS 1x, RVC 2 mM. Para extinguir qualquer actividade da peroxidase endógena, incubar a secção em 3% _de H ₂ O ₂ durante 2x 10 minutos, e, em seguida, lavar uma vez com PBS 1x, RVC 2 mM.
   * Nota: Durante o processo de RNA-FISH, vanadil ribonucleósido complexo (RVC) é adicionado para tampões e soluções para evitar a degradação de RNA.
4. Incubar 2x 10 min em etanol a 70%. Nesta fase, as secções podem ser armazenados em etanol a 70% a -20 ° C durante várias semanas. Desidratar as secções por incubação em 80%, 95%, e 100% ethanol, 5 min cada. Deixe a seção secar por pelo menos 10 min.
   Nota: em alguns casos, tratamento com etanol pode ser prejudicial para a detecção de outros alvos. Um protocolo alternativo usando uma etapa de pré-hibridação em formamida 50% - 2x SSC pode ser usado (veja abaixo no Protocolo n º 9 para obter detalhes sobre a coloração triplo). No entanto, o tratamento de etanol é a abordagem mais versátil para o RNA-FISH e proporciona o menor fundo.
5. Prepare a solução de sondagem da seguinte forma: se preparar com antecedência a 10 ml de uma solução estoque RNA hibridização contendo 4x 8x SSC, 20x solução de Denhardt, EDTA 4 mM, 40% dextrano *. Alíquota da solução como 500 mL em microtubos e armazenar a -20 ° C. Para preparar uma corrediça 80 ul de solução (lamela de 22 x 50 mm), misturando 20 ng de ribossonda biotinilado LAT, 40 ng de ARNt de levedura, RVC 2 mM, e completa a 20 ul com água. Adicionar 20 ul de solução de hibridação de ARN de 4x, e 40 ulde formamida (50% de concentração final). Para facilitar a pipetagem e de mistura, é recomendado para pré-aquecimento da solução de hibridação de ARN de 4x a 75 ° C. Misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes.
   * Nota: Para preparar a solução de hibridação de ARN de 4x, mistura de 4 g de sulfato de dextrano (MW 500.000) em 3 ml de água destilada e 4 ml de 20x SSC. Faz uma mistura viscosa que se dissolve após 3-4 horas a 70 ° C. Misture regularmente para ajudar a dissolver-se. Adicionar 2 ml de solução de Denhardt 100X, e 80 ul de uma solução de EDTA a 0,5 M. Completar para 10 ml com água e misture bem com um vórtice. Cuidado: use somente RNAse / DNase produtos gratuitos.
6. Desnaturar a sonda de 10 min a 75 ° C. Enquanto isso, colocar as lâminas numa incubadora deslizante definido como 65 ° C. Queda de 80 ml de solução de sonda para as seções e rapidamente colocar uma lamela para a queda. Cuidado: não deve haver nenhuma bolha. Presença de bolhas diminui hibridização efficiency. A incubação tem que ocorrer em câmara úmida desde a lamela não está selado. Use uma incubadora de slides que pode conter água (ver tabela material), ou preparar uma câmara úmida dentro de uma caixa selada e colocá-lo em um 65 ° C forno de hibridização.
7. Incubar durante a noite a 65 ° C. Nota: LAT RNA-FISH é realizada a 65 ° C para evitar ligação não específica da sonda, a qual é observada a 37 ° C. Muitas outras sondas RNA-FISH deve resultar em bom sinal a 37 ° C.
8. No dia 2, antes de se iniciar a lavagem, preparar os reagentes de detecção de acordo com as instruções do fabricante do kit de detecção de TSA. A detecção é realizada com um kit comercial de detecção TSA incluindo uma peroxidase de rábano (HRP) conjugada com estreptavidina e um substrato fluorescente verde ou azul.
9. Mantenha as lâminas sobre o aquecedor de slides a 65 ° C. Remova cuidadosamente a lamela e rapidamente adicionar 1 ml de formamida 50% em 2x SSC, pré-aquecido at 65 ° C. Cuidado, não deixe que a seção seca. Lavar duas vezes por 10 minutos a 65 ° C em formamida a 50% em 2x SSC e 2 x 10 min em 2 x SSC a 65 ° C. Lave mais uma vez com SSC 2x e coloque o slide em um aquecedor de slides 37 ° C.
10. Prossiga com o passo de detecção de acordo com as instruções do fabricante kit de detecção de TSA. A concentração de HRP-estreptavidina, a concentração de substrato fluorescente e o tempo de reacção deve ser determinado empiricamente *. Para a detecção de RNA LAT, que rotineiramente utilizado a seguinte condição: HRP-estreptavidina diluída a 1/500, reagente fluorescente a 1/100 de fluorescência azul e 1/500 para a fluorescência verde, e o tempo de reacção de 10 min. O sinal pode ser rapidamente verificado com um microscópio de fluorescência invertido, sem montagem, antes de prosseguir com DNA-FISH.
    * Nota: O protocolo de amplificação será projeto de acordo com os principais objetivos do experimento. Por exemplo, para localizar finamente o RNA alvo, é advisada a usar o tempo de reação curto. Em contraste, para identificar e contar células positivas a baixa ampliação rapidamente, o tempo de reacção pode ser aumentada para gerar um sinal luminoso.
11. Para ADN FISH, seguir o procedimento indicado acima, a partir do passo desmascaramento (passo 6.2).

8. FISH-DNA Immuno

Veja a Figura 1, caixas roxas para uma visão geral.

À semelhança do RNA-DNA-FISH, é aconselhável realizar a primeira imunofluorescência, já que o DNA-FISH é susceptível de desnaturar proteínas e evitar a sua detecção pelos anticorpos. A qualidade de sinal de imunofluorescência é altamente dependente das características do anticorpo, e vários anticorpos deve ser testado sempre que possível. Epitopo desmascaramento é realizada uma vez antes da imunofluorescência para melhorar tanto a detecção de proteínas e de ADN-FISH. Para preservar o sinal de imunofluorescência sobre a amostra durante o processo de ADN FISH é necessário covalently vinculá-lo ao tecido. Apresentamos aqui duas abordagens que proporcionaram bons resultados em nossas mãos, detecção de pós-fixação e tiramida baseada em anticorpos (veja o passo 8.5). A escolha deve ser conduzido por testes preliminares para cada par alvo / anticorpo.

1. Prepare as seguintes soluções antes de começar:
   
   1x PBS contendo 3% de soro de cabra normal (NGS).
   2% de PFA em 1x PBS (diluição a partir da solução de reserva de 4%)
   
2. No dia 1, os primeiros passos são idênticos aos do ADN-FISH, até o passo desmascaramento (passos 6,1-6,2).
3. Depois de desmascaramento, incubar as secções com 1x de PBS contendo 3% NGS durante 1 hora.
4. Incubar com anticorpo primário diluído em 1x PBS contendo 3% NGS durante 24 horas. Menor tempo de incubação pode ser usado para reduzir o protocolo, verificou-se que apesar de uma incubação durante a noite geralmente resulta em um sinal mais forte. Até 48-72 horas de incubação pode ser necessária para a baixa afinidade de anticorpos primários, tais como IgM.
5. No dia2, lavar 3x 10 minutos com PBS 1x.
6. Protocolo de anticorpo pós-fixação: incubar 1 hora com o anticorpo secundário acoplado com um corante fluorescente verde, a 1/200 em 1x PBS contendo 3% de NGS. Lavar três vezes 10 minutos com PBS 1x. Pós-fixação é realizada com 2% de PFA em 1x PBS, durante 10 min *. Lavar 3x 10 minutos com PBS 1x.
   Protocolo de detecção com TSA: incubar 1 hora com o anticorpo secundário com HRP acoplado a 1/250 em 1x PBS contendo 3% de NGS. Lavar três vezes 10 minutos com PBS 1x. Continuar com a detecção de tiramida de acordo com as instruções do fabricante. Tal como indicado anteriormente (passo 7.9), a diluição do reagente e tempo de reacção tem de ser determinada empiricamente. Na maioria dos casos, o nosso protocolo foi baseada numa diluição do substrato fluorescente 1/500 e um tempo de reacção de 10 min. Lavar 3x 10 minutos com PBS 1x.
   Nota *: Pós-fixação é um passo crítico em imuno-FISH, e requer cuidado set-up. Quanto mais forte a pós-fixação domelhor o sinal de IF, e quanto menor for a eficiência de ADN FISH.
7. Prossiga com DNA-FISH da etapa metanol-ácido acético (passo 6.3). Duração de imuno-ADN-FISH é tipicamente 3 dias, com o primeiro anticorpo incubadas durante a noite.

9. Dupla FISH DNA-RNA Juntamente com Imunofluorescência

Veja a Figura 1, caixas de laranja para uma visão geral.

RNA-FISH é realizada em primeiro lugar, seguido por imunofluorescência, e finalmente o ADN-FISH. Se é detectado por imunofluorescência reacção tiramida, que é a chave para extinguir completamente a actividade da HRP do passo de ARN-FISH com H ₂ O _2, e para verificar que a extinção é eficiente. Isto é feito utilizando uma lâmina como um controlo "sem anticorpo primário".

Porque desidratação à base de etanol é deletério para algumas proteínas sensíveis ao solvente, esta etapa de RNA-FISH pode inibir imunofluorescência. Se assim for, o RNA-FISH pode ser realizada wom um protocolo alternativo, conforme detalhado abaixo em stpe 9.3.

1. Prepare a seguinte solução antes de começar:
   
   Formamida a 50% em 1x PBS contendo 2 mM de RVC
   
2. No dia 1, preparar a sonda RNA-FISH e proceder como para a dupla de RNA-FISH, até o H ₂ O ₂ passo têmpera (passo 7.2).
3. Caso 1, a técnica de imunofluorescência funciona após a desidratação do etanol: prosseguir com RNA-FISH, como indicado acima, em etapas 7,3-7,9. Em seguida, vá para o passo abaixo de 9,6.
4. Caso 2, a imunofluorescência é impedida pelo tratamento com etanol: Colocar as lâminas numa câmara húmida a um aquecedor de deslize definida para 65 ° C e incubar durante 1,5 horas numa solução de pré-hibridização contendo formamida a 50%, PBS 1x, 2 mM e RVC. Escorra a solução de pré-hibridação e queda de 80 ml de solução de hibridização, como indicado nos passos 7.4 e 7.5. Em seguida, prossiga com a hibridização RNA-FISH e detecção como abov indicadoe em passos 7,6-7,9 (dia 2 e 3).
5. No dia 2, depois de RNA-FISH é concluído, prosseguir com imuno-DNA-FISH começando com o passo desmascaramento (veja o passo 6.2). Em seguida, siga o protocolo de DNA imuno-FISH, como indicado acima, em etapas 8,2-8,6.

10. Montagem de slides e imagem

1. Prepare a seguinte solução antes de começar:
   
   Hoechst 33342 a 0,5 ug / ml em PBS 1x
   
2. Núcleos de mancha por 10 min com DAPI ou Hoechst 33342 * a 0,5 ug / ml em 1x PBS, durante 10 min. Lavar 3x 10 minutos com PBS 1x.
   Nota *:. Cuidado Se um dos sistemas de detecção usa uma tintura azul fluorescente, não use DAPI ou Hoechst. Em vez disso, utilizar um corantes de ADN fluorescentes, com um espectro de emissão no comprimento de onda vermelho distante como Topro3.
3. Escorra o máximo de líquido possível do slide. Queda de 80 ul de meio de montagem contendo um agente antifading em uma extremidade da lâmina. Cubra as seções com uma elevada qualidade ópticalamela (n ° 1.5 vidro). Deixe o lamela descer lentamente, mantendo-o em uma extremidade com uma pinça, a fim de deixar o meio de montagem spread sobre a seção sem bolhas.
4. Selo com unha polonês e armazenar a 4 ° C em uma caixa de slides escuro.
5. A observação directa do sinal de DNA-FISH de HSV-1 latente genomas requer uma ampliação objectiva de 40x de imersão em óleo ou superior, com abertura numérica elevada (por exemplo, NA 1.1 40X, 60X-63X NA 1.4, 100X NA 1.3) e uma fonte de luz de excitação , pelo menos, equivalente a uma lâmpada de mercúrio de 100 W. Aconselhamos o uso de um microscópio de transmissão de alta eficiência, tais como os fornecidos pelos fabricantes nos últimos 5 anos (ver tabela de equipamentos). A microscopia confocal fornece ferramentas para coletar imagens com menor fundo devido a auto-fluorescência do tecido, tais como o corte fino ou imagem espectral.

Resultados

Depois de vários meses de testes extensos descobrimos que baseada em calor latente desmascaramento química feita de HSV-1 do genoma disponível para hibridização in situ fluorescente. Durante o processo, tentámos vários processos de desmascaramento, e tratamentos baseados apenas pelo calor (ou seja, o aquecimento das secções até à temperatura sub-ponto de ebulição em um forno de micro-ondas) apareceu eficiente. Em seguida, testamos vários buffers de sal que são rotineiramente utilizados e...

Discussão

O protocolo aqui descrito permite a detecção de HSV-1 do genoma latente nos neurónios de secções de tecido neuronal de rato. O nosso conhecimento das vias que regulam a expressão de genes virais tem sido limitada pela falta de método para detectar ADN genómico de HSV-1 in situ no interior de tecidos neuronais. As informações sobre o número de cópias do genoma e proporção de neurônios infectados vieram principalmente de análise de PCR em neurônios dissociados ^11,12. Em elucidar o pape...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balb/c mice	Janvier, France		6 week-old females
HSV-1 strains	SC16 strain (wild type)		See Labetoule, M. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci 44, 217–225 (2003) for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride	Sigma	K2753	Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 4 g of PFA in 90 ml of water. Add 50 µl of 1N NaOH, and heat at 60 °C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30 min. Add 10 ml of 10x PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5 ml tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline	Sigma	07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (sterile)	Life Technologies	10010-015
Sucrose	Sigma	84100	Prepare a 20% sucrose solution in 1x PBS.
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	SAKURA	4583
Large vector DNA purification kit	Qiagen	12462	To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20 °C
Nick translation kit	Roche Applied Sciences	10 976 776 001
Cy3-dCTP	GE Healthcare	PA53021	Protect from light
0.5 M EDTA	Sigma	E6758
G50 Mini spin column	GE Healthcare	27-5330-01
Salmon sperm DNA 10 mg/ml	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Ethanol molecular biology grade	Sigma	87047	Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA	Invitrogen Life Technologies	15632-011
Formamid Molecular biology grade	Sigma	F9037	Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe	Enzo Life Sciences	ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
20x Saline Sodium Citrate (SSC)	Sigma	S6639	Prepare a 2x SSC solution in ddH20.
Triton X-100	Sigma	T8787	Prepare a 10% stock solution in water and store at +4 °C. Prepare the 0.5% solution in 1x PBS right before use.
10 mM Sodium citrate pH 6.0	Sigma	S1804	Prepare a 100 mM stock solution (10x). Weigh 10.5 g of citric acid (MW 210.14). Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400 ml water. Adjust pH at 6.0 with 1 N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500 ml with distilled water. Dilute 10x in distilled water before use.
Acetic Acid	Sigma	320099
Methanol, molecular biology grade	Sigma	322415
Dextran sulfate - MW 500,000	Euromedex	EU0606-A
Denhardt's solution (100x)	Euromedex	1020-A
Rubber Cement "FixoGum"	Marabut	290110000
DNA purification kit  - Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
T7 in vitro transcription kit	Ambion Life Technologies	AM1314
Biotin-16-UTP	Roche Applied Sciences	11388908910
RNA purification minicolumn	Qiagen	73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex	New England Biolabs	S1402S
H2O2	Sigma	H3410	Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA	Invitrogen	15401011	prepare a 10 mg/ml solution in RNAse free water
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000
Primary antibodies	any supplier		The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies	Invitrogen Life Technologies		The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with Alexa Fluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 350 (blue fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20937	TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit - Streptavidin + Alexa Fluor 488 (green fluorescence)	Invitrogen Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen Life Technologies	H3570	Prepare a 0.5 µg/ml solution in 1x PBS immediately before use. Discard the remaining solution.
22 mm x 50 mm coverslip. n°1.5 glass	Electron Microscopy Sciences	72204-04
Mounting medium with anti-fading agent - VECASHIELD	Vector Laboratories	H-1000	Another conventional product is Fluoromount G from Electron Microscopy Science
Superfrost glass slides	FisherScientific	12-550-15
Equipment/Material	Company	Reference	Note
Needle for infection			Glass micropipette hot drawn. Custom made.
Dissection equipment	Moria, France		Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump	Cole Palmer Instruments		Easyload Masterflex
Microsyringe pump device (Nano Pump)	kdScientific	KDS310
Cryostat	Leica France	CM 1510-1
-80 °C freezer	Sanyo		Ultra Low -80 °C
Domestic microwave oven
Dry block heater	Eppendorf	022670204
Incubator Slide moat	Boekel Scientific	240000
Coplin Jar	Dominique Dutscher	68512
Staining glass container	Dominique Dutscher	68506
Fluorescent microscope	Zeiss		The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6, and 100X PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43, and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series