Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Özet

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Özet

Hücre-dışı matris proteinleri de dahil olmak üzere hücre yüzeyi proteinleri, örneğin büyümesi, farklılaşması ve proliferasyonu gibi tüm önemli hücresel süreçleri ve fonksiyonlar, katılabilir. Bu proteinlerin kapsamlı bir karakterizasyonu biomarker keşif, hücre tipi belirlenmesi ve ilaç-hedef seçimi yanı sıra, hücre biyolojisi ve fizyolojisi anlayışımızı ilerletmek için yardımcı olmak için zengin bilgi sağlar. Yüzey proteinleri Ancak nedeniyle doğal olarak düşük yoğunlukta, yüksek hidrofobik ve ağır post-translasyonel modifikasyonlar, önemli analitik zorluklar oluşturmaktadır. Yüzey proteinleri üzerinde yaygın glikolizasyon yararlanarak, biz burada birkaç mevcut N-Glycoproteomics araçlarının avantajlarını entegre bir yüksek verimli glikopeptit yakalama yaklaşımını tanıtmak. Bizim yöntem yüzey proteinleri elde glıkopeptıtlerı zenginleştirmek ve LC-MS kullanılarak uyduruk Proteomikte için kendi glikanları kaldırabilirsiniz. Çözülmüş N-glycoproteome inf içerirprotein kimlik ve miktarı gibi glycoslasyonun sitelerinin ormation. Bu yöntem, kanser, kök hücreler ve ilaç zehirlenmesi gibi alanlarda bir dizi çalışma uygulanmıştır. Bu yöntemin örnekleri sınırlama nispeten büyük bir miktarı, sitosolik proteinler merkezli çalışmalara göre bu analiz için gerekli olan şekilde, bir yüzey zar proteinleri, en düşük yoğunlukta yer alır.

Giriş

Hücre yüzey proteinleri, hücre dışı çevre ile etkileşim ve bir hücrenin içine dışarıdan gelen sinyalleri iletir. Bu nedenle, hücre dışı matris proteinleri de dahil olmak üzere, bu proteinler, hücre biyolojisi ve çoğalma, büyüme, göç, farklılaşmadan benzeri yaşlanma ve fizyoloji kadar tüm yönleriyle kritik roller oynar. Yüzey proteinleri diğer hücrelerin, proteinler ve küçük moleküller ^1-3 etkileşerek çalışır. Ilaçların fazla% 60 hücre yüzeyi proteinleri ⁴ hedeflenir gibi hücre yüzeyi proteinlerinin moleküler karakterizasyonu, biyologlar için değil, aynı zamanda farmasötik şirketler için sadece büyük bir ilgi çekmektedir.

Üstün duyarlılık, ve protein ve peptitlerin tanımlanması için verim ile tandem kütle spektrometrisi (MS), küresel, proteomik ^5,6 çalışmalar için güçlü bir araç olmuştur. Oysa, yüzey proteinleri gibi, MS tabanlı Proteomikte için önemli sorunlar teşkilÇoğu yüzey proteinleri düşük miktarlarda ve ağır değişiklikler ile mevcut. Yüzey proteinleri membran-yayılan bölgeleri bunları hidrofobik hale getirmek; Bu, özellikle çok pasolu zar proteinleri için geçerlidir. Bir deterjan yardımı olmadan, sulu çözeltiler içinde zar proteinleri çözmek için olan, böylece zordur; Bununla birlikte deterjanların kullanımı genellikle protein tanımlama HPLC ve MS ^1,7,8 performansını engeller. Bu nedenle, membran proteinleri zayıf doğrudan LC-MS tabanlı proteomik karakterize edilmiştir.

Glikozilasyon hücre yüzey proteinleri ⁹ içinde yer alan en önemli ve bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Glikanların muazzam karmaşıklığı ve heterojenite peptidin MS sinyali ¹⁰ engelleyebilir. Bununla birlikte, pek çok yöntem proteomik yüzey proteinlerini zenginleştirmek ve önceki LC-MS analizi için proteinlerden şeker bölümlerine kaldırmak için bu tek değişiklik kullandık. Bu yöntems lektin bazlı afinite yakalama ¹¹ ve hidrazid bazlı ya da borik asit bazlı kimyasal yakalama ¹² hem de hidrofilik kromatografisi ayrımı ^8,13 içerir. Glikanların kaldırılması normal proteinlere dönüştüren zar proteinleri ve büyük ölçüde MS karakterizasyonu kolaylaştırır. Glikosilasyon da zar proteinleri aksine, yüksek çözünürlüğe sahip olan salgılanmış proteinler yer alır, çünkü birçok glycoproteomic yöntem çözünür proteinler için optimize edilmiş, ve daha düşük seçicilik ve glikopeptid proteinleri ^8,14 zar konuşlandırılmış olan duyarlılığı sahip olma eğilimi vardır. Başka yöntemler de ettirecek vardır, özellikle de, bu tür ultrasantrifüjleme ¹⁵ ve markalama stratejileri ¹⁶ kullananlar gibi hücre yüzeyi proteinleri. Membran proteinleri karakterize bizim yöntem ve diğer mevcut yöntemler arasında ayrıntılı bir karşılaştırma son zamanlarda ¹⁷ yürütülen ve sonuçları bizim yöntem eşit derecede iyi gerçekleştirebilirsiniz belirtti, eğer değildiTüm karşılaştırıldığında membran proteomiks yöntemlere göre daha iyi, ancak daha yüksek sadeliği ile.

Araştırmacılar bu yöntemi kullanmak yardımcı olmak için, burada detay genel bir protokol. Bu yöntem, mevcut Glycoproteomics stratejileri çeşitli avantajları entegre ve zar glikoproteinlerinin için özel olarak tasarlanmış olan, ancak yöntem salgılanan proteinler için de aynı derecede iyi çalışır. Bu yöntemin özellikleri şunlardır: 1) zar proteinlerinin tam bir çözünmesi, 2) kullanılarak bir katı madde yakalama alt katmanını kullanırken, potansiyel sterik engellemeyi ortadan kaldırmak için glikoproteinlerin glıkopeptıtlerın bir zenginleştirme, 3) hidrazid kimyası kullanımı ile kovalent bağlar oluşturmak için glikopeptidler ve yakalama alt-tabaka, bağlı glikopeptitler yüksek glycoselectivity için sıkı yıkama tolere edebilir, ve 4) yeteneği azalır örnek kaybı ve daha kısa işlem süresi için, bir tüp içinde tüm yakalama işlemi yapmak için bu gibi. Bir değişken okuyan için bu yöntemi uyguladıktan sonrahücreler ve dokular dahil olmak üzere, biyolojik örneklerin ety biz glikoproteinler ^8,17,18 için yüksek seçicilik (> 90%) gözlenmiştir.

Protokol

1.. Hasat Membranlar

1. Bir hücre peleti (~ 10 ⁸ hücreleri) üzerine proteaz inhibitör kokteyli ile, hipotonik tampon maddesi (10 mM Tris-HCI, 10 mM KCI, 1.5 mM _MgCl2, pH 8.0) ilave edilir ve buz üzerinde 15-30 dakika boyunca inkübe edin. Lyse şırınga iğneleri (5-10 geçiş) ile örnek geçen ya da bir Dounce homojenleştirici (15-30 vuruş) ile homojenize ile hücreler. Lisisin verimliliğini kontrol etmek Hemasitometre ve tripan mavi boya kullanın.
2. 3000 gx 15 dk lizatının bir diferansiyel santrifüjleme ile mikrozomal fraksiyonu elde edilir ve daha sonra da 100,000 gx 2 hr. İlk santrifüj nükleer fraksiyonu olan bir pelet alır ve süpernatan daha sonra santrifüj plazma membranı hem de zara bağlı organelleri ⁸ içerir, mikrozom kısmı olan bir ikinci pelet, oluşturur. Nihai süpernatan, sitosolik fraksiyonu. Daha fazla analizana için -80 ° C dondurucu içinde mikrozomal fraksiyonlar saklayınaşağıda gösterildiği gibidir.

2.., Çözülür denatüre ve Digest Membran Proteinleri

1. Denatürasyon tampon maddesi (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP,% 0.5 Rapigest, pH 8) 'de mikrozomal fraksiyonu çözündürülür ve daha sonra 10 dakika boyunca 100 ° C'de çözelti inkübe edin.
2. , Oda sıcaklığına kadar ısıtılmış çözeltisini 8 M nihai konsantrasyona kadar çözelti içinde çok yüksek saflıkta üre toz ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe örnek.
3. 15 mM nihai konsantrasyona kadar numuneye iyodoasetamid stok solüsyonu ekleyin ve numune içinde serbest tioller alkillemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe çözeltisi. 10 mM nihai konsantrasyona kadar numuneye DTT stok solüsyonu ilave edin ve aşırı iodoasetamid söndürmek için oda sıcaklığında diğer bir 10 dakika için çözelti inkübe edin.
4. PH 8 40 mM Tris tampon maddesi ile elde edilen çözelti 10x seyreltilir, ve daha sonra trypsi bir 01:20 oranında numuneye tripsin eklemektoplam proteine ​​n. Reaksiyon tamamlandıktan emin olmak için bir 37 ° C fırın içinde gece boyunca reaksiyonu sindirim koruyun.
5. Yani Rapigest HCI, aynı zamanda deterjan bozulduğu bir durum ile pH 1'e numune solüsyonu asitleştirilerek sindirim iptal eder. 1 saat boyunca 37 ° C'de Rapigest düşürebilir ve santrifüjleme ile geliştirilen çökelmesini çıkarın.
6. Bir C-18 katı faz ekstraksiyonu (SPE) kartuşlardan örnek peptidleri içeren ve hızlı vakumla ile elde edilen numunenin kuru süpernatantı temizlemek.
7. Önce ve sindirim etkinliğini doğrulamak için ise tripsin hazmından sonra numune SDS-PAGE analizi yapın.

3.. Glikopeptid Yakalama

1. Bağlama tamponu (100 mM sodyum asetat, pH 5.5) 'de temizlenmiş peptidler çözülür. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 30 dakika için bir 10 mM nihai konsantrasyonda en peptit çözeltisi içine sodyum periodat ekleyin. Bu aldehitlere glikanlarında cis-diol grubu oksitlenir, Burada hidrazid kimya aracılığıyla reçineye bağlanması için glikanlar izin verir. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, 20 mM nihai konsantrasyona ve pH 5 sodyum sülfit ile aşırı periodat söndürülür.
2. Reçineye çift glikopeptidlere 01:04 (çözeltiye reçine) bir oranda peptit çözeltisi içine hidrazid türevlendirilmemiş reçine tanıtılması. , Tam bağlanma için uç uca rotasyon ile 1-2 gün boyunca 37 ° C'de reaksiyonu inkübe edin.
3. Aşağıdaki her bir kez 1 ml reçine yıkanarak bağlanmamış peptidleri kaldırın: DI su, 1.5 M NaCl, metanol ve% 80 asetonitril. Son olarak, 100 mM _NH4 HCO ₃ sistemin tampon alışverişi için pH 8, 100 mM _NH4 HCO ₃ 1 ml reçine, 3 kez yıkayın.
   1. (Isteğe bağlı) bağlı olmayan peptidlerin analizi için supernatant toplamak ve yıkar.
4. Bir 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübasyona PNGase F ile reçineden N-peptidi bırakınn sonuna kadar uç dönme. Santrifüj ve% 80 asetonitril yıkama tarafından yayımlanan peptidler toplayın. LC-MS analizi için hızlı vakumla elde edilen çözelti kurutun.

4.. Ayrıca Fraksiyonu (İsteğe bağlı)

Daha fazla örnek karmaşıklığını basitleştirmek için, elde edilen N-glıkopeptıtlerı ayırımlamak. Örneğin, 10 mM amonyak format,% 20 asetonitril ile pH 3'e kurutuldu peptidler içinde yeniden çözülür ve peptidleri fraksiyonlanması güçlü katyon alışveriş (SCX) kromatografisi kullanır. Elde edilen yıkama sıvısı kurutun ve daha sonra, ters fazlı LC-MS ile ^8,17,18 Elde edilen peptid fraksiyonları analiz.

Çıkış N-glıkopeptıtlerın 5. Temizleme (İsteğe bağlı)

Endişeler peptidlerin potansiyel kirlenme artış ise,% 0.1 formik asit içine kurutuldu peptidleri yeniden çözünmesine ve daha fazla ters fazlı LC-MS analizi, önceki peptidleri temizlemek için bir MCX SPE kolon.

Not: Veritabanı arama parametreleri.

Reçine N-glıkopeptıtlerın seçici olarak ayrılması sırasında, PNGase F bir aspartik asit N-glikan bağlantılı asparagin dönüştürür. Bu nedenle, serbest N-glıkopeptıtlerın bir 0,9840 Da kütle kayma yoktur. Doğru bu peptidleri belirlemek için, bu değişiklik bu metionin ve sistein oksidasyon karbamido gibi ortak değişikliklerle birlikte, arama parametre ilave edilmesi gerekmektedir.

Sonuçlar

Deneysel prosedür temsili bir akış şeması Şekil 1 'de özetlenmiştir. Etiketleme ve daha fazla fraksinasyon adımlar isteğe bağlıdır ve bilgilerini yeni yayın ¹⁸ tarif edilmiştir. Başka bir seçenek reçine ile reaksiyona girmeyen, değiştirilmemiş peptidleri, analiz etmektir. Değiştirilmemiş peptidleri analiz avantajları bu sıkı birleşme bölgesindeki klaudin gibi glikosile edilmemiş peptidler ve proteinler, potansiyel belirlemek; Ek bir avantaj daha doğru kantit...

Tartışmalar

Burada hücre yüzey proteinleri profil için bir glikopeptid-yakalama stratejisini tanıtmak. Yöntem, bu tür salgılanmış kan gibi proteinler, yanı sıra diğer vücut sıvılarında veya hücre kültür ortamı içinde incelemek için uygulanabilir.

Yöntemin başarısı numunelerin tam sindirim dayanır; bu nedenle, sindirim bir verimlilik SDS-PAGE karakterizasyonu, özellikle numunenin ilk kez analizi için, gereklidir. Tam bir sindirim zar proteinleri için zor olabilir ve sadece m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755