Glycopeptides Capture pour protéomique de surface cellulaire

Résumé

les protéines de surface cellulaire sont biologiquement importantes et largement glycosylée. Nous présentons ici une approche glycopeptides capture pour solubiliser, enrichir et deglycosylate ces protéines pour les analyses protéomiques faciles à base LC-MS.

Résumé

les protéines de surface cellulaire, y compris les protéines de la matrice extracellulaire, de participer à tous les processus et les fonctions cellulaires importantes, telles que la croissance, la différenciation et la prolifération. Une caractérisation complète de ces protéines fournit de l'information riche pour la découverte de biomarqueurs, l'identification du type de cellule, et la sélection cible thérapeutique, ainsi que d'aider à faire progresser notre compréhension de la biologie cellulaire et physiologie. protéines de surface, toutefois, posent des défis analytiques importantes, en raison de leur nature faible abondance, hydrophobie élevée, et des modifications post-traductionnelles lourds. Profitant de la glycosylation répandue sur les protéines de surface, nous présentons ici une approche glycopeptides capture à haut débit qui intègre les avantages de plusieurs moyens N-glycoprotéomique existants. Notre méthode peut enrichir les glycopeptides dérivés des protéines de surface et de retirer leurs glycanes pour la protéomique faciles à l'aide de LC-MS. La N-glycoproteome résolu comprend l'information de l'identité de la protéine et la quantité ainsi que de leurs sites de glycosylation. Cette méthode a été appliquée à une série d'études dans des domaines tels que le cancer, les cellules souches, et la toxicité des médicaments. La limitation de la méthode réside dans la faible abondance des protéines membranaires de surface, de telle sorte qu'une quantité relativement importante d'échantillons est nécessaire pour cette analyse par rapport à des études ont porté sur des protéines cytosoliques.

Introduction

les protéines de surface cellulaire interagissent avec l'environnement extracellulaire et transmettent des signaux à partir de l'extérieur vers l'intérieur d'une cellule. Ainsi, ces protéines, comprenant des protéines de la matrice extracellulaire, jouent un rôle essentiel dans tous les aspects de la biologie cellulaire et la physiologie allant de la prolifération, la croissance, la migration, la différenciation au vieillissement et ainsi de suite. les protéines de surface fonctionnent en interaction avec d'autres cellules, des protéines et des petites molécules ^3.1. La caractérisation moléculaire des protéines de surface cellulaire est....

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Protocole

1. Récolte membranes

1. Ajouter un tampon hypotonique (10 mM Tris-HCl, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl _2, pH 8,0) avec un cocktail inhibiteur de protease sur un culot de cellules (~ 10 ⁸ cellules) et incuber pendant 15 à 30 min sur de la glace. Lyse des cellules par l'échantillon au travers des aiguilles de seringues (5-10 passes) ou l'homogénéisation de l'échantillon par un homogénéisateur Dounce (15-30 coups). Utilisez un hématimètre et coloration au bleu trypan pour vérifier l'efficacité de la lyse.
2. Obtenir la fraction microsomale par une centrifugation différentielle du lysat à 3000 gx 15 min puis à 100 000 gx 2 h....

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Résultats

Un organigramme représentant la procédure expérimentale est résumée sur la figure 1. L'étiquetage et d'autres étapes de fractionnement sont facultatifs et les détails sont décrits dans une publication récente ^18. Une autre option est d'analyser les peptides non modifiés, qui ne réagissent pas avec la résine. Les avantages de l'analyse des peptides non modifiés comprennent l'identification potentielle des peptides et des protéines non glycosylées, telles que.......

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Discussion

Ici, nous introduisons une stratégie glycopeptides capture pour le profilage des protéines de surface cellulaire. Le procédé peut être appliqué pour étudier les protéines sécrétées, tels que ceux dans le sang, ainsi que dans d'autres liquides corporels ou dans des milieux de culture cellulaire.

Le succès de la méthode repose sur la digestion complète d'échantillons; Par conséquent, une SDS-PAGE, la caractérisation de l'efficacité de la digestion est nécessaire,.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755