Çok katmanlı Balık Ölçekler (Of Karakterizasyonu<em&gt; Atractosteus spatula</em&gt;) Nanoindentation, X-ray CT, FTIR ve SEM kullanma

Özet

Bu kağıt mekansal ilişkili kimyasal, yapısal ve nanoindentation kullanarak Atractosteus spatula katmanlı ölçeği (A. spatula) mekanik özelliklerinin incelenmesi için kullanılan yöntemler sunar, Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve X- ışını tomografi (X-ışını BT) bilgisayarlı. Deney sonuçları, koruyucu, biyolojik malzemelerin tasarım ilkelerini araştırmak için kullanılmıştır.

Özet

Böyle mineralli balık pulları, karındanbacaklı kabukları, koç boynuzu, boynuzları ve kaplumbağa kabuğu gibi koruyucu biyolojik materyallerin hiyerarşik mimarisi gelecekte koruyucu malzemelerin ve sistemlerin tasarımını rehberlik potansiyelleri ile benzersiz tasarım ilkeleri sağlar. Başarısızlık başlatır mikroölçeklerde ve nano malzeme bu sistemler için yapı-özellik ilişkileri anlamak önemlidir. Şu anda, bu tür nanoindentation, X-ray CT, ve SEM gibi deneysel teknikleri, bu maddi sistemlerin ^1-6 hiyerarşik mikroyapıların ile mekanik davranış ilişkilendirmek için bir yol ile araştırmacılara. Ancak, mineralli biyomateryallerin numune hazırlama için iyi tanımlanmış bir standart prosedür şu anda kullanılabilir değil. Bu çalışmada, uzamsal olarak ilişkili kimyasal, yapısal, A. ve çok tabakalı ölçek mekanik özellikleri tarama için yöntemler nanoindentation spatula kullanılarak FTIR ile, SEM, energy-dağılımlı X-ışını (EDX) microanalysis ve X-ışını BT sunulmaktadır.

Giriş

Araştırmacılar yapısal biyomateryalleri araştırıyor ve bu çok daha yüksek tokluk ve kendi bireysel bileşenlerinin kıyasla gücü olarak geliştirilmiş mekanik özelliklere sahip yapısal biyomalzemeleri sağlayan tasarım ilkeleri, aydınlatmak için çalışıyoruz. Için zırhlı balık pulları tasarım ilkeleri üzerinde araştırmalar Pagrus büyük ^7, Polypterus senagalus ^2,6, Arapaima gigas ^3, Cyprinus carpio ^4, ve Atractosteus spatula ¹ yapısal yanıtları incelemek için mevcut deneysel yöntemlerin uygulamasını genişletmek için ihtiyaç göstermiştir ve mikro özellikleri, detaylı standart prosedürler malzeme ve deneyler bu tür için geçerli değildir çünkü.

Tartışılan farklı zırhlı balık pulları arasında, A. spatula merkezi ABD'de ⁸ tarihsel tepe yırtıcı ve yüksek olan bir türdürly mineralli ölçekler. Cilt kitle için türler borsaları kas kütlesi daha önce ⁹ belirtilen karşılaştırılabilir büyüklükte balık karşılaştırıldığında geliştirilmiş bir avcı savunma sistemi elde etmek. Page ve Burr ^10, A'ya göre spatula beyaz mersin balığı (Acipenser transmontanus) ve daha büyük türler olmak Atlantik mersin balığı (Acipenser Oxyrhynchus) ile Kuzey Amerika'daki üçüncü büyük tatlı su balığıdır. A. yüksek mineralli balık terazi spatula sadece son çalışılmaktadır. Thompson ve McCune ¹¹ gar ölçekler morfolojisi ganoine bir dış tabaka, bir yaygın kemik tabakası ve lamellar kemik tabakadan oluşan bir üç-katmanlı bir bileşime sahip olduğunu önerdi. A. Cari araştırma spatula terazi yaygın veya lameller kemik bölgeye kemik tabakası ayırt değil, ama sadece tek bir iç tabakası ^1,12 olarak kemik bölgesini okudu.

Bu çalışmada, en çok prosedürlermikro, nano yapısını, kimyasal bileşimi, ve A. ölçeklerin mekanik özelliklerinin mekansal dağılımları vestigating spatula FTIR spektroskopisi sonuçlarına dayanarak, SEM, X-ray, CT, ve nanoindentation teknikleri sunulmaktadır.

Protokol

1.. Balık Ölçek Numune Hazırlama

Bu çalışma için, ölçekler, yaklaşık 600 mm uzunluğunda gar (A. spatula) den ABD Ordusu Mühendis Araştırma ve Geliştirme Merkezi orta uzunlukta (ERDC) Çevre Laboratuvarı (29 ^inci kaudal sütun) elde edilmiştir. Balık pulları Sağlık (NIH) hayvan bakım kuralları, ERDC ve Ulusal Enstitüsü göre elde edilmiştir.

1. Malzemeler
   Çalışmada elde ölçeklerin balık mekansal konumu kaydedin. Uygun kuruluş veya NIH hayvan bakım kurallar olarak biyolojik örneklerin elde etmek için, toplum kurallarına uymak için emin olun. Hidrasyon korumak ve bunlar balık kaldırılır sonra mineral içeriğini korumak için bu tür fosfat tamponlu tuz çözeltisi gibi uygun bir ortam içinde ölçekler saklayın. Nanoindentation verileri etkileyebilir, mineral kaybına neden olabilir uzun süreli depolama kaçının. Fırça ve t kıl bir ortamı kullanınSert pullarından herhangi bir yumuşak doku kaldırmak için weezers.
2. Montaj ve Kesit Numune
   Enine bir FTIR balık ölçeğin kısa ekseninin bölümüne (Şekil 1) ve nanoindentation incelenmesi ilk olarak böyle bir reçine ve sertleştirici içeren iki parçalı bir epoksi gibi sert bir ortamda ölçek montaj gerektirir. Örneğin en az 55 ° C bir en üst nokta sıcaklığı olan çalışmada kullanılan ticari genel amaçlı epoksi gibi düşük tepe sıcaklıklarına sahip genel amaçlı bir RT sertleşen epoksi kullanarak

A. Şekil 1. X-ışını BT görüntüleri A. Bu çalışmada incelenen kısa eksen enine bölümünü resmeden spatula ölçek nanoindentation ve FTIR kullanılarak spatula [A (anterior), P (posterior), D (dorsal), V (ventral)].

2. 1. Piyasada mevcut bir plastik numune tutucusu kullanılarak, 32 mm çaplı numune kalıbı içinde balık ölçek tutun. Bu epoksi içinde montaj sırasında doğru odaklı örnek tutar.
   2. Numune kalıp içinde tutulduğunda, örnek sertleşmemiş epoksi dökün ve daha sonra epoksi, üretici firmanın talimatlarına uygun olarak tedavi için izin verir.
   3. Epoksi kürünü sonra, bölümde elmas bıçak, yüksek hassasiyetli kesim-off kullanarak monte örnek numunenin orta hatta gördüm.
   4. Örnekten birikintileri temizlemek için 15 dakika için damıtılmış su içinde sonikasyon.
3. Nanoindentation ve FTIR için cilaları
   Şekil 2'de gösterildiği gibi nanoindentation için pürüzsüz düz bir yüzey elde etmek için, aşağıdaki prosedür parlatma ve parametreler, parlatıcı üretimi ve test numuneleri ile tartışmalara göre önerilmektedir. Ancak parametreler yanıtları göre farklı biyomalzeme için ayarlanması gerekebilirBu malzeme kaldırma oranı gibi. Cilalama adımları arasında damıtılmış su banyosu içinde numune Ultrasonikasyon aşamasını parlatma iri parçacıkların sağlanması için çok önemli olan daha sonraki bir aşamada daha ince bir parlatma sokulur değildir.

Cilalı kısa eksen enine kesit A. Şekil 2. Image epoksi monte spatula ölçek.

4. 1. Yağlayıcı olarak 15 mikron SiC ped ve su ile kaba lehçe numune kadar dakika (rpm) başına 200 devir 7 Ibf ve hız otomatik parlatma kafa kuvvet kullanarak uçağıdır.
   2. 15 dakika için damıtılmış su banyosu içinde örnek sonikasyon.
   3. Ara ürün 130 rpm bir merdane hızında su yağlayıcı kullanarak 6 mikron SiC pad ile lehçe ve 7 Ibf bir kuvvet5 dak.
   4. 15 dakika için damıtılmış su banyosu içinde sonikasyon örneği.
   5. 130 rpm bir merdane hızı ve 5 dakika boyunca 7 Ibf bir kuvvet su yağlayıcı kullanılarak, 1 mikron SiC ped ile Polonya.
   6. 15 dakika için damıtılmış su banyosu içinde örnek sonikasyon.
   7. Böyle bir üretici 50 nm süspansiyonlar için önerdiği yüksek yoğunluklu, dokuma olmayan, düşük-şekerleme gözenekli poliüretan gibi uygun bir parlatma pedi kullanılarak 50 nm koloidal silika süspansiyonu ile Final lehçe. 5 dakika boyunca 7 Ibf bir kuvvet ile 130 rpm'lik bir hızda Polonya.
   8. 15 dakika için damıtılmış su banyosu içinde örnek sonikasyon.

2.. Nanoindentation Test

1. Başına test her parti önce nanoindentation sistem kalibre kurallarına üretmektedir. Kalibrasyon Berkovich ucu ve çerçeve sertlik için sistem bölge işlevinin belirlenmesi içermelidir. Ayrıca, bu aşamada bir mikroskop-to-indenter kalibrasyonu gerçekleştiringirintiler seçilen mikroskop yerlere ilişkili sağlamak.
2. Nanoindenter örnek Yük ve odak noktası haline getirmek için örnek nanoindenter üzerinde optik mikroskop denetimlerini kullanın.
3. Ilk girinti için yere numune taşımak için yazılım denetimlerini kullanın. İdeal olarak, bu ölçeğin enine kesitinin merkez hattı boyunca ganoine tabakanın kenarından epoksi yaklaşık olarak 10 mm.
4. Gerçekleştirmek girintiler 4 paralel sıra istatistiksel olarak anlamlı bir veri bu konumdan başlayarak set elde etmek için birbirinden 15 mikron aralıklı. 5 0.1 mN / sn mN, yükleme ve boşaltma oranları, 30 sn 'lik bir tutma süresi ve her satır için 5 um'lik bir minimum boşluk girinti maksimum yüke nanoindenter ayarlayın. Girintiler satır ganoine yüzeyine dik çalıştırmak için kurulum olmalı ve Epox içine yaklaşık olarak 10 um geçme sırasında girintiler yeterli sayıda ölçeğin enine kesiti boyunca seyahat için belirtilmelidirkemik tabakası geçen y.
5. Toplu tamamlandığında, nanoindenter sırasıyla ganoine tabaka önce ve kemik tabakası sonra epoksi olmalıdır ilk ve son girinti 100 mN maksimum yük, referans ile girintiler oluşturmak sahiptir. Bu girintiler her satır için başlangıç ​​ve bitiş noktaları ile bağlantılıdır.
6. Nanoindentation sonra, daha fazla su kaybını önlemek için PBS çözeltisi içinde örnek geri koyun.
7. Bir zaman bağımsız malzeme tepki gözlenmiştir ise Oliver-Pharr yöntemine göre ¹³ modülü ve sertliği belirlemek için nanoindentation yazılımı kullanın. Aksi tutma zamanı çok hızlı boşaltma gözlenen sürünme aşmak için uzatılabilir gerekebilir.

3.. Mekansal Çözülmüş ATR-FTIR Spektroskopisi

Bir slayt-on, bir FTIR mikroskop bağlı ATR aksesuarın kullanılması la kızıl ötesi (FTIR) spektrumları Fourier dönüşümü uzamsal olarak çözündürülerek toplamak için önerilen bir yöntemBir balık pulu numunede yers. ATR aksesuarı başka FTIR tekniği ile ulaşılabilir değil çok küçük (~ 10 mikron ²⁾ uzaysal çözünürlüğü, yüksek kaliteli spektrumları toplanması için izin verir. Aynı cilalı örnek nanoindentation deneyleri için hazırlandı (Şekil 2), bu deneylerde kullanıldı.

1. Yüksek kaliteli spektrumları ATR-FTIR spectromicroscopy elde sağlamak için analiz için kullanılan FTIR mikroskop için uygun bir yüzey ve boyutlara sahip bir numune seçin.
2. Veri toplamak için FTIR mikroskop hazırlayın. FTIR mikrospektroskopideki örnek ölçmek için kullanılacak olan ile aynı koşullar altında örnekleme FTIR sinyalinin kalibrasyon gerektirir. Genellikle, bu detektör, soğutma ve stabilize etmek için zaman sağlar hem de aynı çevresel şartlar altında her türlü arka plan spektrumu ve örnek spektrumları toplama içerir. Bu hava nedeniyle CO ₂ ve su buharı, özellikle önemli olabilir can dramatically FTIR spektrumları etkiler. Bu cihazın optik uyumlu olduğundan emin olmak için de önemlidir.
3. Karşı örnek çıkarmak için uygun bir arka plan spektrum toplamak. Bu deneyler için, cilalı, altın kaplamalı mikroskop slayt FTIR spectromicroscopy için bir arka plan olarak kullanıldı.
4. Uygun bir objektif kullanılarak, örnek üzerinde odaklanmak ve analizi için bir ilgi alanı seçin.
5. Ilgi alanı bulunduğunda, FTIR mikroskop objektif için ATR aksesuarı bu ATR iç yansıma elemanı ile yakın temas edinceye kadar örnek yükseltmek ve örnek bir spektrum toplamak.
6. FTIR spektrumları topladıktan sonra, gerekli standart veri işlem gerçekleştirmek gereklidir.

4. X-ray Bilgisayarlı Tomografi (BT)

1. Elde Bölüm 1.1 tartışıldığı gibi ölçek hazırlamak
2. Tarayıcı Kurulumu
   1. Üreticinin talimatlarına göre ısınma X-ışını kaynağı.
   2. Set X-ray gerilimi ve sırasıyla 50 kV ve 160 uA, akım.
   3. 1.450 msn pozlama süresini ayarlayın.
   4. 1.0 mm alüminyum filtre seçin.
   5. X-ışını kaynağı off (karanlık alan) ve (parlak alan) üzerinde zaman önce yükleme numune için, bir düz alan düzeltme yapmak.
3. Dağı ve Yük Numune
   Onlar vardiya veya tarama uzunluğu boyunca hareket kalmamak Ölçekler bir şekilde monte edilmelidir. Bu örnekler aynı zamanda X-ışını neredeyse şeffaf malzemeler kullanılarak monte edilmelidir. Strafor ve Parafilm bir arada BT aşamasına ölçek sabitlemek için kullanılabilir.
   1. En uzun boyut detektöre paralel olacak şekilde sabit bir şekilde monte örnek.
   2. Tarayıcı sahneye monte örnek sabitleyin.
   3. Bu tarama boyunca dönme merkezinde olacak, böylece örnek yerleştirin.
   4. Bu durumda tüm ölçek görünümünde (FOV) alanında olmasını sağlar yüksek çözünürlük seçin7.5 um.
4. Toplama Ayarlar
   0.25 ° 'lik bir dönme adımı ve 15 bir kare ortalama değeri ile bu çalışmada tarama gerçekleştirin. Düşük çözünürlükleri kabul iseniz, adım boyutunu artırmak ve / veya toplam tarama süresini azaltmak için ortalama çerçeve azaltmak.
5. İmar Parametreler
   Bir veri seti elde edildikten sonra, kesitsel görüntüler içeren bir veri kümesi oluşturmak için X-ışını projeksiyon görüntüleri yeniden. Aşağıdaki hariç SKYSCAN en NRecon yazılım varsayılan ayarları seçin.
   1. 20 Halka Artifact Düzeltme değiştirin.
   2. % 25 Işın Sertleşme Düzeltme değiştirin.
   3. Kesitsel görüntü düzeyi yapmak CS Statik Rotasyonu ayarlayın.
6. Görüntü İşleme
   Nihai 3D gri ölçekli görüntü elde etmek SKYSCAN en Ctan yazılımını kullanın. Strafor ve Parafilm gelen eserler çıkarmak için uygun bir seviyeye gri skala aralığını ayarlayın.

5. Görüntüleme SEM ve EDX Analizi

Nanoindentation ve micro-/nano-structure karakterizasyonu için parlatma ile hazırlanan numuneler taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak incelenmiştir. Düşük vakum mode numunelerin su kaybı ve iletken kaplamaların uygulanması ihtiyacını en aza indirmek için kullanılmıştır. Yerel kimyasal analiz enerji dispersif X-ışını spektroskopisi (EDX) kullanılarak SEM görüntüleme ile bağlantılı olarak cilalı numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. EDX analizleri, kimyasal ve mekanik özellikler arasında bir korelasyon sağlamak amacıyla nanoindentation ile analiz edilmiştir, aynı hat / ızgara üzerinde gerçekleştirilmiştir. Taze kırık yüzeyleri de balık pulları mevcut biomineralized yapıların morfolojisi ve yönelimi hakkında daha iyi bilgi vermek için SEM ile incelenmiştir. Kırıklı yüzeylerde nano ölçekli yapının gözlenmesi için çözünürlüğünü artırmak için, numuneler saçma altın (Au) ile kaplanmış ve yüksek vakum modunda görüntülendi. Aşağıdakikullanılan prosedürleri hakkında ek bilgi sağlar.

1. Cilalı Yüzeyler SEM Görüntüleme
   1. SEM bölmesine cilalı örnek koyun ve 0,1-0,5 mbar göz basıncı ile düşük vakum moduna odası pompası.
   2. Yaklaşık 5.0 mm çalışma uzaklığını ayarlayın.
   3. Yüksek gerilim (YG) etkinleştirin ve ganoine ve kemik alt katmanlar ya da diğer ilgi alanları arasındaki geçiş bölgesini içeren numune üzerinde ilgi bölgeye gidin.
   4. 15 kV YG ve yaklaşık 3,9 nA ışın akımına görüntüleri edinin.
   5. Görüntüyü odaklayın ve gerekli tüm hizalamalarını ve stigmation ayarlamaları gerçekleştirin.
   6. İlgili büyütme (tipik olarak 250X 10,000 X) gözenekli kemik vs biyomineral içeriği ve yoğunluğundaki değişiklikler (örneğin, yoğun kemik tanımlanmasında yardımcı olmak için düşük vakum geri-saçılmalı elektron (BSE) detektör kullanarak da ilgi dahilindeki en az üç bölgede görüntü yakalama .)
2. Kırık Yüzeylerin SEM Görüntüleme
   1. Kırık yüzeyi yukarı bakacak şekilde çift taraflı karbon bandı kullanarak 90 ° SEM saplama taze çatlaklı numune yapıştırın.
   2. Kırılma yüzeyinde bir alt nm kalınlığında bir iletken tabaka temin etmek üzere Au ile püskürtme ile kaplamak.
   3. SEM bölmesine örnek koyun ve yüksek vakumlu bir pompa odası moduna.
   4. 3,0 ila 5,0 mm çalışma uzaklığını ayarlayın.
   5. HV etkinleştirin ve numune üzerinde ilgi bölgelere gidin. Bu durumda ilgi duyulan birincil alanları ganoine ve kemik tabakalarında yapı mevcuttu.
   6. 5 kV ve 15 kV YG ve 0.24 çözünürlüğünü geliştirmek için nA düşük bir ışın akımı arasındaki görüntüleri edinin.
   7. Başlangıçta numune odak ve ön hizalamalarını gerçekleştirebilirsiniz.
   8. Daldırma / ultra-yüksek çözünürlükte (UHR) lens içine normal alan emisyon lensten daha büyük 5.000 X ve anahtarı Artış büyütme.
   9. Uhr hizalamalarını ve stigmation ayarlamaları gerçekleştirin.
   10. En az üç bölgede o görüntüleri yakalayabilirİlgili büyütme f faiz (genellikle 5,000 X X 250.000) ikincil elektron (SE) modunda çalışan lens dedektör (TLD) aracılığıyla kullanarak.
3. (SEM görüntüleme ile birlikte yapılır) cilalı yüzeylerin EDX analizi. Bu parametreler Moser ¹⁴ tarafından tartışılan şekilde EDX etkileşim hacmi nanoindentation etkileşim hacminin büyüklüğüne benzer malzeme bağımlı ve ayarlanması gerekir.
   1. Girintiler her satırın sonunda referans işaretleri ile belirtildiği nanoindentation ızgara içerir cilalı numune üzerinde ilgi bölgeye gidin.
   2. HV en az 15 kV olduğundan emin olun, ışın akımı en az 3.9 nA ve çalışma mesafesi 5.0 mm daha büyüktür.
   3. EDX analiz edilecek bölgenin BSE görüntü yakalayın.
   4. EDX analizi yazılımı kullanılarak, girintiler hattı boyunca, kimyasal analiz için alanlar bulmak yardımcı olmak için aynı görüntü yakalamak.
   5. "Hattı Analizi" tekniği, po kullanmailk girinti başlayan ve son girinti biten girintiler ilgi hattı boyunca kimyasal analizini gerçekleştirmek için bir çizgi sition.
   6. Hattı boyunca yerleştirilmesini analiz noktalarının sayısını belirtin. Bu kimyasal bileşimi ve mekanik özellikleri arasında doğrudan bir mekansal ilişki sağlamak için mevcut olan analiz noktaları ve girintiler aynı numarayı kullanmak en iyisidir.
   7. Hat doğru konumlandırılmış ve puanları belirtildiğinde, EDX yazılımı kullanarak çizgi analizi başlatmak.
   8. Hat analiz tamamlandığında, numunenin üst yüzeyi üzerinde, belirtilen hattı boyunca elde edilen nokta spektrumundan sayısal olarak ilgi elemanları tanımlar.
   9. Ilgi unsurları tespit edildikten sonra, Bremsstrahlung radyasyon ve diğer etkileri hesaba bir arka plan kalibrasyonu yapın.
   10. Quan belirtilen hat boyunca her noktada kantitatif analiz elde etmek için yazılımın deconvolution analizi seçeneği seçinher noktada kimyasal bileşimi haklı göstermeye çalışıyorlar.
   11. Nanoindentation kullanılarak ölçülen mekanik özelliklere sahip mekansal ilişki içinde yardımcı olmak için analiz edilmiştir, belirtilen hattının görüntüsü ile birlikte kantitatif kimyasal analiz sonuçları kaydedin.

Sonuçlar

Şekil 3, yaklaşık olarak 800 um uzunluğunda kısa ekseni enine kesiti üzerinde gerçekleştirilmiştir mekansal dekorele nanoinidentation / SEM / EDX analizleri ortalama sonuçlarını göstermektedir. Yaklaşık 60 mikron kalınlığında bir tabaka ganoine olarak, nanoindenter 69.0 GPa ve 3.3 GPa sertlik ortalama modülü hesaplanır. Nanoindenter yaklaşık 740 mikron kalınlığında bir kemik tabakası için 0.5 GPa 14.3 GPa ve sertlik arasında bir ortalama modülüne belirlenmiştir.

EDX karbon, oksijen, kalsiyum, ve tipik olarak mineralli ölçeklerde bulunan fosfor belirlenir. Bununla birlikte, ganoine ve kemik tabakaları kimyasal bileşimleri içinde ölçülebilir farklılıklar ihtiva etmiştir. Kemik tabakasında gözlenen karbon başak o bölge de BSE görüntünün genel parlaklığı gözlenen azalmaya neden karbon hafif bir artışa neden olan, gibi yüksek mineralli olmayan isnat edilebilir. Özel olarak, ganoine katmanın, S Ca atom konsantrasyonu oranı ortalama: 1.71 P 1.67 teorik oranı ile hidroksiapatite benzer çıktı. Kemik Katmanın ortalama Ca: P oranı ganoine tabakadan mineralizasyon miktarında bir azalma temsil eden 1.51 'e düşmüştür.

Kemik tabaka ve ganoine katman için Şekil 4'te FTIR tayfları amid, karboksilik, fosfat ve karbonil gibi ana fonksiyonel gruplar tanımlanır. Özel olarak, iç FTIR (kemik) tabakasında dış (ganoine) tabakası ve kollagen imzaları hidroksiapatit imzaların görsel gözlem doğrulandı. 3,500-3,000 cm ^-1 nedeniyle 1550 ve 1500 ^cm-1 arasında uzanan NH ve NH eğilme tepe kemik tabakası amid grupları temsil eder. Dalga sayısı 1,470-1,365 cm bölgede pikleri amid ikame edilmiş alkil gruplarını temsil eder ^-1. Buna ek olarak, 1641 cm 'de germe farklı bir C = O ^-1 kemik tabakası üzerinde gözlenmiştir. Bezelye3,000-2,500 ^{cm-1 ila} ks karboksilik grupları temsil eder. Kemik ve ganoine Hem katmanları 'spektrumları 1,079.33 cm ^-1 fosfat germe göstergesi yakınında belirgin bir tepe üretti.

Şekil 5 X-ışını BT görüntüleri ganoine katman ölçekler birbirleriyle örtüşüyor kemik katmanı kapsar olmadığını yakalar. Koyu gri, kemik tabakaları daha az yoğun ve daha az sert fazlarını işaret ederken parlak gri ganoine katmanları, daha yoğun, daha sert ve daha sert aşamaları gösterir. Buna ek olarak, X-ışını CT görüntüleri ganoine tabaka kalınlığında olmayan bütünlüğü tespit destekli. Aslında, açık çukurları tüm kemik tabakası örtmeyen ganoine tabakanın merkezine yakın gözlenmektedir.

H ₃ PO _4, kazınmış kırılma yüzeyinin Şekil 6A'da SEM görüntü ganoine katmanı için katmanlı bir desende düzenlenen oluşturulan nano saptandı. Bu nanorod organizeyapı ganoine alanı için FTIR elde hydroxyapatite imzalara ilişkilendirir.

Şekil 6A, açık. Şekil 6B, ₃ H PO ₄ ile aşındırma sonra kırılma yüzeyinin daha yüksek büyütme SEM görüntüleri canlandıran kesikli çizgi ile ganoine ve kemik tabakaları arasındaki geçişi tanımlayan bir kırılma yüzeyi tipik bir düşük büyütme SEM mikrografı gösterilmektedir. Bir elyaf gibi nano kemik tabakası görülmektedir ise aşındırma sonra dış tabaka ganoine yönlendirilmiş nanorods açıkça belirtilmektedir.

Şekil 3. Modülü ve mekansal SEM / EDX kimyasal bileşimine korelasyon nanoindentation gelen sertlik verileri.

Şekil 4. Katmanları (kemikli) (ganoine) dış ve iç toplanan FTIR spektrumları.

Şekil 5. X-ışını dış (ganoine) üzerine çukurlaşma gösteren BT görüntüleri iç (kemikli) tabakası kaplama katmanı.

Şekil 6,. Tipik kırılma yüzeyinin (A) Düşük büyütme SEM görüntüsü, (B) ve dış (ganoine) içinde nanoçubuklar yüksek büyütme görsel ve iç (b elyaflarony) katmanları .. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bakış deneysel bir bakış açısıyla, araştırmacılar bağımlı önceden araştırma mineralli balık pulları mekanik özelliklerini göstermiştir beri doğal balık ölçek mekansal yerini bildirdiği gibi mineralli balık pulları gibi biyolojik materyalleri meydana çalışırken kritik olduğunu hatırlamamız gerekiyor nerede terazi balık ⁴ bulunuyordu.

Mineralize biyolojik malzemelerin mekanik özellikleri de, numunelerin ⁴ hidrasyon durumuna bağlı olduğu gösterilmiştir. Düzgün kuru fosilleşmiş örnekleri kullanmak açık literatürde yayınlanan sonuçlar, hidrate edilmiş taze örnekleri karşılaştırmak için çalışırken, bu tekniğin yararını kısıtlamaktadır. Bu nedenle, uzun süreli test kez nanoindentation sırasında numunenin mekanik özelliklerine dehidratasyon etkilerini en aza indirmek için kaçınılması gerekir. Malzeme belirli pilot çalışmalar deney sağlamak için tavsiye edilirment zamanı, malzemenin mekanik davranışı değiştirmez kadar az. Islak hücre nanoindentation test ekipmanları izin verirse, malzemenin sürekli bir hidrasyon durumu korumak için tercih edilen bir yöntem olacaktır.

Boşaltma eğrisinden elastisite modülü hesaplanmış, bu çalışmada kullanılan nanoindentation yöntem olup, malzeme bir doğrusal elastik izotropik malzemesi olarak davranır varsayar. Bu teknik indenter ipuçları çeşitli kullanılabilir. Bununla birlikte, 65,35 ° 'lik bir yarım açı ile üç taraflı Berkovich ucu bu çalışmada kullanılmıştır. Böyle küp köşesinde (yarım açı = 35.36 °) gibi alternatif ipuçları bu yazıda sunulan işlemi için uygun olan, ancak küp köşe ucu Berkovich ucu çatlakları daha akut olduğundan çok daha düşük yükler ile daha numunede oluşturulabilir Berkovich ucu.

Polisaj bir minimize Surfac ile pürüzsüz ve düz bir yüzey elde etmek için önemli bir adımdıre pürüz nanoindentation sonuçlarını etkileyebilir değil. Bu yazıda sunulan parlatma adımlar kullanılan parlatıcı türüne bağlı olarak modifiye edilmesi gerekebilir önerilen bir prosedür vardır. Ancak, doğru nanoindentation veri sağlamak için kritik bir adım yüzey pürüzlülüğü en aza indirilir ve bu özel madde için bir 50 nm son cila problanmış olan girinti derinliklerde pürüzsüz düz bir yüzey elde etmek için gerekli olmasıdır.

Girintiler aralanması daha önceki girintiler meydana gelen malzeme deformasyonu tarafından etkilenmeyen doğru nanoindentation verileri sağlar. Bu çalışmada ekipman için nanoindenter kullanım kılavuzu girinti boşluk Berkovich için maksimum penetrasyon derinliği ¹⁵ Indenters en az 20-30x olması gerektiğini önerdi. Alternatif malzemeler için, gerekli olan girinti boşluk açıkta daha önce ele alındığı gibi, uygulanan yük ve en fazla girinti derinliği göre tespit edilmesi gerekiredebiyat ^16,17. Ayrıca, bu malzeme için tutma süresi kullanılmak üzere nanoindenter yazılım Oliver-Pharr analiz yöntemi için izin problanan farklı malzeme aşamaları için gözlenen herhangi bir sürünme üstesinden gelmek için seçildi. Ancak, Oyen ¹⁸ tarafından tartışılan alternatif analiz yöntemleri zamana bağımlı madde yanıtları uygun tutma süreleri ile üstesinden olmayabilir biyolojik malzemeler için kullanılabilir.

X-Ray CT yüksek çözünürlüklü sonuçlar elde etmek için, çeşitli ayarları optimize edilmelidir. Bu kağıt bir eşsiz büyüklüğü ve katmanlı kalınlığında bir balık ölçekte kullanım için parametrelerin çok belirli özetliyor. Farklı örnek büyüklükleri ile, bu ayarlar yüksek kalitede bir veri almak için ayarlanması gerekir. Her parametre seçme süreci açıkça Makinenin kullanıldığı ile birlikte kılavuzdaki tanımlanmalıdır. Tarama ayarları (voltaj, akım, pozlama, filtre seçimi) ve rekonstrüksiyon ayarları(Halka eserler, ışın sertleşmesi), diğer numune boyutları ve geometrileri çeşitli karşılamak için modifiye gerekebilir.

X-ışını BT terazi birbirleriyle örtüşen vermedi, sadece malzeme bir kemik tabakası kapsayan ganoine katmanı tanımlayan tam ölçekli morfolojisi bir görüntü sağladı. X-ışını BT görüntüleri de ganoine tabaka düzgün olmayan bir ölçek üzerinde kalınlık ve tamamen yoksun ganoine tabaka da sergilenen çukurlar oluşturmuştur belirlenmiştir.

İlginç bir şekilde, uzamsal olarak SEM / EDX kimyasal analizler için korelasyon nanoindentation verileri yerine P. mineralize balık pulları için gözlemlenen daha kademeli bir geçiş 2 tabakaları arasında keskin bir geçiş tespit ayrık senagalus (Bruet et al. ² in.)

Nanoindentation bir arada, FTIR, EDX ve SEM onaylamak için mekanik özellik, kimyasal analiz ve yapısal bilgi verdiemaye-benzeri morfolojisi ve kimya ile ganoine olarak dış tabaka. Buna ek olarak, bu teknikler, bir malzeme tabakası olarak kemik iç tabaka doğruladı.

Sonuç olarak, bu çalışmada açıklanan yöntemleri A. mineralize balık ölçek incelemek için bir prosedür ve karşılık gelen sonuçlar tespit nanoyapılarını ve kimyasal bileşimi aşağı toplu yapıdan spatula.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy resin	Buehler	701-501512
Epoxy hardener	Buehler	703-501528
Samplkups	Buheler	20-8180
SamplKlips I	Buehler	20-4100-100S
High precision cut-off saw	Buehler	Isomet
UltraMet 2002 sonic cleaner	Buehler	B2510R-MT
Polisher	Buehler	49-1750-160
1,200 grit (15 μm) SiC paper	Struers	40400012
4,000 grit (6 μm) SiC paper	Struers	40400014
50 nm colloidal silica	Buehler	40-10075
Chemomet polishing pad for 50 nm suspension	Buehler	40-7918
Nanoindenter	MTS	G200
FTIR continuum microscope	Thermo Nicollet	6700
X-ray computed tomography	Skyscan	Skyscan 1173
SEM	FEI	NovaNanoSEM 630
EDX	Bruker	AXS Xflash detector 4010
Sputter coater	Denton	Desk II