Caracterização de escamas de peixe multi-camadas (<em&gt; Atractosteus espátula</em&gt;) Usando Nanoindentação, X-ray CT, FTIR, e SEM

Resumo

Este artigo apresenta os métodos utilizados para a sondagem espacialmente correlacionada propriedades mecânicas da escala de várias camadas de Atractosteus espátula (A. espátula) utilizando nanoindentação química, estrutural, e, transformada de Fourier no infravermelho (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV), e X- ray tomografia computadorizada (CT de raio-X). Os resultados experimentais têm sido utilizados para investigar os princípios de concepção de materiais biológicos protectores.

Resumo

A arquitetura hierárquica de materiais biológicos de proteção, como escamas de peixe, mineralizados conchas de gastrópodes, chifre de carneiro, galhadas, cascos de tartaruga e fornece os princípios de design únicas com potencial para orientar a concepção de materiais e sistemas de protecção no futuro. Compreender as relações estrutura-propriedade para estes sistemas materiais em microescala e nanoescala, onde a falha inicia é essencial. Atualmente, as técnicas experimentais tais como nanoindentação, CT de raios-X, e SEM fornecer aos pesquisadores uma maneira de correlacionar o comportamento mecânico com microestruturas hierárquicos desses sistemas materiais ^1-6. No entanto, um procedimento padrão bem definido para a preparação de amostras de biomateriais mineralizados não está disponível no momento. Neste estudo, os métodos de sondagem espacialmente correlacionado propriedades mecânicas da escala de várias camadas de A. química, estrutural, e espátula utilizando nanoindentação, FTIR, SEM, com casaergy dispersivo microanálise de raios-X (EDX) e CT de raios-X são apresentados.

Introdução

Os pesquisadores estão investigando biomateriais estruturais e estão tentando elucidar os princípios de design, que oferecem biomateriais estruturais com melhores propriedades mecânicas, tais como muito maior tenacidade e força quando comparado com os seus constituintes individuais. As investigações sobre os princípios de design de escamas de peixe blindados para Pagrus major ^7, Polypterus senagalus ^2,6, Arapaima gigas ^3, Cyprinus carpio ⁴ e Atractosteus espátula ¹ demonstraram a necessidade de ampliar a aplicação de métodos experimentais existentes para estudar as respostas estruturais e características microestruturais, desde procedimentos padrões detalhados não estão disponíveis para esses tipos de materiais e experiências.

Entre as diferentes escalas de peixes blindados discutidos, A. espátula é um predador historicamente ápice da central dos EUA ⁸ e é uma espécie com altoly escalas mineralizadas. As trocas de espécies de massa muscular para a massa de pele para obter um sistema de defesa predador melhorado em comparação com os peixes de tamanho comparável mencionado anteriormente ^9. De acordo com a página e Burr ^10, A. espátula é a terceira maior peixe de água doce na América do Norte com o esturjão branco (Acipenser transmontanus) e esturjão atlântico (Acipenser oxyrhynchus), sendo as espécies de maior porte. As escamas de peixe altamente mineralizadas de A. espátula são só recentemente está sendo estudado. Thompson e McCune ¹¹ sugeriram que a morfologia das escalas gar ter uma composição de três camadas constituída por uma camada ganoine exterior, uma camada de osso difusa, e uma camada de osso lamelar. A pesquisa atual sobre o A. escalas espátula não distinguiram a camada óssea em regiões do osso lamelar ou difusa, mas tem apenas estudados região do osso como uma única camada interna ^1,12.

Neste estudo, os procedimentos para avestigating a microestrutura, nanoestrutura, composição química, e as distribuições espaciais das propriedades mecânicas das escalas de A. espátula com base nos resultados da espectroscopia FTIR, SEM, X-ray CT, e as técnicas de nanoindentação são apresentados.

Protocolo

1. Fish Scale Preparação da Amostra

Para este estudo, as escalas foram obtidos do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento (ERDC) Laboratório Ambiental em meados de comprimento (29 ^ª coluna caudal) Engenheiro Exército dos EUA a partir de uma gar cerca de 600 mm de comprimento (A. espátula). As escamas de peixe foram obtidos de acordo com o Instituto de Saúde (NIH) diretrizes de cuidados de animais ERDC e Nacional.

1. Materiais
   Registar a localização espacial sobre os peixes das escalas obtidas para o estudo. Certifique-se a aderir à organização adequada ou diretrizes governamentais para a obtenção de amostras biológicas, tais como as diretrizes de cuidados de animais do NIH. Armazenar as escalas em um meio adequado, tais como solução salina tamponada com fosfato de preservar e manter a hidratação do conteúdo mineral, uma vez que são removidos a partir do peixe. Evitar a armazenagem prolongada que pode resultar na perda de minerais, que podem influenciar os dados nanoindentação. Use uma escova de cerdas médias e tweezers para remover qualquer tecido mole das escalas duras.
2. Espécime de montagem e secção
   Examinando uma secção transversal do eixo curto da escama de peixe (Figura 1) com FTIR e nanoindentação requer primeiro a montagem da escala num meio dura, tal como uma epoxi de duas partes constituído por uma resina e endurecedor. Uso geral RT epóxis cura com temperaturas de pico baixo, tais como o epóxi de uso geral comercial utilizado neste estudo que teve um pico de temperatura de menos de 55 ° C.

Imagens Figura 1. CT de raios-X de A. escala espátula representando a seção transversal do eixo curto examinadas neste estudo de A. espátula utilizando nanoindentação e FTIR [A (anterior), P (posterior), D (dorsal), V (ventral)].

2. 1. Segure a escama de peixe em um molde de 32 milímetros de diâmetro da amostra utilizando um suporte de amostras de plástico disponíveis no mercado. Isso mantém a amostra orientada corretamente durante a montagem no epóxi.
   2. Uma vez que a amostra é colocada no molde, derramar o epóxi não curada sobre a amostra e, em seguida, permitir que o epoxi de cura de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Após o epóxi é curada, a seção da amostra montado usando uma lâmina de diamante de alta precisão de corte viu na linha média da amostra.
   4. Sonicate em água destilada por 15 min para remover qualquer resíduo da amostra.
3. Polimento para Nanoindentação e FTIR
   Para obter uma superfície lisa e plana para nanoindentação, conforme ilustrado na Figura 2, o seguinte procedimento de polimento e os parâmetros são sugeridas a partir de discussões com o fabrico polidor e amostras de teste. No entanto, os parâmetros podem necessitar de ser ajustada para diferentes biomateriais com base nas respostastais como taxas de remoção de material. Ultra-som de amostras em um banho de água destilada entre as etapas de polimento é vital para garantir partículas mais grosseiras polimento passo não são introduzidos em um fino polimento etapa subseqüente.

Figura 2. Imagem de um polido-eixo curto seção transversal A. escala espátula montados em epóxi.

4. 1. Polonês grosseiro com uma almofada de 15 mm de SiC e água como lubrificante até que a amostra é plano usando a força da cabeça de polimento automático de 7 lbf e velocidade de 200 revoluções por minuto (rpm).
   2. Sonicar a amostra em um banho de água destilada por 15 min.
   3. Intermediário polonês com uma almofada de 6 um SiC usando lubrificante água a uma velocidade de 130 rpm cilindro e uma força de 7 lbf para5 min.
   4. Sonicate amostra em um banho de água destilada por 15 min.
   5. Polonês com uma almofada de 1 um SiC usando lubrificante de água a uma velocidade de rolo de 130 rpm e uma força de 7 lbf por 5 min.
   6. Sonicar a amostra em um banho de água destilada por 15 min.
   7. Polonês final com um nm suspensão sílica coloidal 50 usando uma almofada de polimento adequado, como um de alta densidade, não-tecidos, baixa-nap poliuretano poroso que um fabricante sugere para 50 suspensões nm. Polonês a uma velocidade de 130 rpm, com uma força de 7 lbf por 5 min.
   8. Sonicar a amostra em um banho de água destilada por 15 min.

2. Teste Nanoindentação

1. Calibre o sistema de nanoindentação antes de cada lote de testes de acordo com a fabrica diretrizes. A calibração deve incluir a determinação da função área do sistema para a ponta de Berkovich e rigidez do quadro. Além disso, realizar uma calibração microscópio-to-penetrador nesta etapapara garantir que os travessões correlacionar para os locais escolhidos microscópio.
2. Coloque a amostra no nanoindentador e usar os controles do microscópio óptico na nanoindentador para levar a amostra em foco.
3. Use os controles de software para mover a amostra para o local para o primeiro travessão. Idealmente, este é, aproximadamente, 10 um no epoxi a partir da aresta da camada de ganoine ao longo da linha central da secção transversal da escala.
4. Executar quatro linhas paralelas de travessões espaçadas 15 mm para além de se obter um conjunto de dados estatisticamente significativos definido começando neste local. Defina o nanoindentador para uma carga máxima de cinco doses de Mn, carga e descarga de 0,1 mN / s, um tempo de espera de 30 segundos, e um espaçamento mínimo travessão de 5 m para cada linha. A fila de travessões deve ser configurado para executar ortogonal à superfície de ganoine, e deve ser especificado um número suficiente de travessões de viajar através de seção transversal da escala ao percorrer aproximadamente 10 m na epoxy passado a camada óssea.
5. Quando o lote é terminada, têm o nanoindentador criar travessões fiduciais com uma carga máxima de 100 mN no primeiro e no último parágrafo, que deve ser no epoxi antes de a camada ganoine e depois a camada do osso, respectivamente. Estes se correlacionam com os pontos inicial e final de cada linha de travessões.
6. Depois de nanoindentação, colocar a amostra de volta na solução PBS para evitar mais desidratação.
7. Usar o software nanoindentação para determinar o módulo de elasticidade e dureza com base no método de Oliver-Pharr ¹³ se uma resposta de material independente do tempo é observado. Caso contrário, o tempo de espera pode ter que ser aumentado para superar a fluência observado de descarga demasiado rapidamente.

3. Spatially Resolvido ATR-FTIR Spectroscopy

A utilização de um acessório deslizante no ATR ligado a um microscópio de FTIR é um método sugerido para recolher espacialmente resolvida com transformada de Fourier de infravermelhos (FTIR) do layers em uma amostra de escama de peixe. O acessório de ATR permite a recolha de espectros de alta qualidade, com muito pequeno (~ 10 m ²⁾ resolução espacial, o que não é atingível com qualquer outra técnica de FTIR. A mesma amostra polida (Figura 2) preparado para experiências nanoindentação foi utilizada nestas experiências.

1. Escolha de uma amostra com uma superfície e dimensões apropriadas para o microscópio FTIR ser utilizado para a análise de garantir espectros de alta qualidade é obtido a partir de ATR-FTIR spectromicroscopy.
2. Prepare o microscópio FTIR para coletar dados. FTIR microespectroscopia requer calibragem do sinal de FTIR sob as mesmas condições de amostragem como irá ser utilizados para a medição da amostra. Tipicamente, este inclui o detector de arrefecimento e que haja tempo para que a estabilizar, bem como a recolha de todos os espectros de base e os espectros da amostra sob as mesmas condições ambientais. Isso pode ser especialmente importante, porque o CO ₂ e vapor de água no ar pode dafetar ramatically espectros FTIR. É também importante assegurar que a óptica do instrumento estão alinhados.
3. Colete um espectro de fundo adequado para subtrair a amostra contra. Para estas experiências, um polido, lâmina de microscópio revestida a ouro foi usado como uma base para FTIR spectromicroscopy.
4. Usando um objetivo adequado, concentrar-se na amostra e selecione uma área de interesse para análise.
5. Uma vez que uma área de interesse é encontrada, coloque o acessório ATR para a objetiva do microscópio FTIR, aumentar a amostra até que ele entra em contato íntimo com o elemento de reflexão interna ATR, e coletar um espectro de amostra.
6. Após a coleta dos espectros de FTIR, executar o processamento de dados necessário padrão exigido.

4. X-ray tomografia computadorizada (TC)

1. Obter e preparar escala como discutido na Seção 1.1
2. Configuração do scanner
   1. A fonte de raios-X Warm-up de acordo com as especificações do fabricante.
   2. Raios-X Set tensão e corrente de 50 kV e 160 mA, respectivamente.
   3. Defina o tempo de exposição a 1.450 ms.
   4. Selecione um filtro de 1,0 milímetros de alumínio.
   5. Antes de amostra de carga, fazer uma correção de campo plano, quando a fonte de raios-X está fora (de campo escuro) e (-campo brilhante).
3. Montagem e carga Specimen
   Escalas deve ser montado de uma maneira tal que eles não mudar ou se mover ao longo do comprimento da mesma. Estas amostras podem ser igualmente montados usando materiais que são quase transparente aos raios-X. Uma combinação de Styrofoam e Parafilm pode ser utilizado para fixar a escala para a fase de CT.
   1. Montar rigidamente a amostra de forma que a dimensão mais longa é paralelo ao detector.
   2. Fixar a amostra montada para a fase do scanner.
   3. Posicionar a amostra de modo a que ele vai ser no centro de rotação durante todo o exame.
   4. Seleccione a mais alta resolução que permite que a escala inteira de ser, no campo de visão (FOV), neste caso7,5 mM.
4. Configurações de Aquisição
   Executar verificações neste estudo, com uma fase de rotação de 0,25 ° e um valor de quadro de média de 15. Se baixas resoluções são aceitáveis, aumentar o tamanho do passo e / ou diminuir a armação média para reduzir o tempo total de verificação.
5. Parâmetros de Reconstrução
   Uma vez que um conjunto de dados é obtido, reconstruir as imagens de projeção de raios-X para criar um conjunto de dados contendo imagens transversais. Selecione as configurações padrão de software NRecon de SkyScan exceto para o seguinte.
   1. Altere a correção Anel Artefato para 20.
   2. Altere a correção Boca Endurecimento para 25%.
   3. Ajuste o CS estática de rotação para fazer nível de imagem transversal.
6. Processamento de Imagem
   Use um software de CTAN Skyscan obter a imagem final em escala de cinza 3D. Ajuste o intervalo de tons de cinza em um nível apropriado para remover os artefatos do isopor e Parafilm.

5. SEM imagem e análise EDX

As amostras preparadas por polimento para nanoindentação e micro-/nano-structure caracterização foram examinadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Modo de baixo vácuo, foi utilizado para minimizar a desidratação dos espécimes e a necessidade de aplicação de revestimentos condutores. A análise química local foi realizada em amostras polidas em conjunto com a imagem de SEM utilizando espectroscopia de raios-X de energia dispersiva (EDX). Análise EDX foram realizadas na mesma linha / grade que foi analisado por nanoindentação, a fim de fornecer as correlações entre as propriedades mecânicas e químicas. Superfícies fraturadas recentemente também foram examinados por MEV para fornecer melhores informações sobre a morfologia e orientação das estruturas biomineralized presentes nas escamas de peixe. Para melhorar a resolução para a observação da estrutura de nano-escala em superfícies fraturadas, os espécimes foram pulverização catódica revestido com ouro (Au) e fotografada no modo de alto vácuo. A seguirfornece detalhes adicionais sobre os procedimentos utilizados.

1. SEM imagem de superfícies polidas
   1. Coloque espécime polido em SEM câmara e da câmara de bomba no modo de baixo vácuo com pressão da câmara de 0,1-0,5 mbar.
   2. Ajuste de distância de trabalho com cerca de 5,0 mm.
   3. Ative alta tensão (HV) e navegue até a região de juros sobre o espécime, que inclui a zona de transição entre ganoine e ósseas subcamadas ou outras áreas de interesse.
   4. Obter imagens em 15 kV HV e corrente do feixe de aproximadamente 3,9 nA.
   5. Concentre-se imagem e executar todas alinhamentos necessários e ajustes stigmation.
   6. Capturar imagens de pelo menos três regiões de interesse em ampliações relevantes (normalmente 250X a 10.000 X) usando o baixo vácuo de elétrons retroespalhados (BSE) detector para auxiliar na identificação de alterações no conteúdo biomineral e densidade (ou seja, osso denso vs osso poroso ).
2. SEM imagem de fraturados Superfícies
   1. Apor espécime recém-fraturadas para um esboço de 90 ° SEM utilizando fita dupla face de carbono com superfície de fratura para cima.
   2. Por pulverização catódica, com casaco de Au para fornecer um sub-nm camada condutora de espessura sobre a superfície da fratura.
   3. Coloque espécime em SEM câmara e da câmara de bomba em modo de alto vácuo.
   4. Ajuste a distância de trabalho para entre 3,0 e 5,0 mm.
   5. Ative HV e navegue até as regiões de interesse na amostra. Principais áreas de interesse, neste caso, foram a estrutura presente nas camadas ganoine e ósseas.
   6. Obter imagens entre 5 kV e 15 kV HV e corrente do feixe menor de 0,24 nA para melhorar a resolução.
   7. Inicialmente concentrar amostra e realizar alinhamentos preliminares.
   8. Aumentar ampliação para mais de 5.000 X e mudar de lente normal de emissão de campo em (UHR) lente de imersão / ultra-alta resolução.
   9. Realizar UHR alinhamentos e ajustes stigmation.
   10. Capturar imagens de pelo menos três regiões Sf interesse em ampliações relevantes (tipicamente 5.000 X 250.000 X) usando o detector através da lente (TLD) operado em modo de elétrons secundários (SE).
3. Análise EDX de superfícies polidas (realizada em conjunto com a imagem MEV). Estes parâmetros são dependentes de material e terá de ser ajustada de modo que o volume de interacção EDX é semelhante em tamanho ao volume interacção nanoindentação como discutido por Moser ^14.
   1. Navegue até a região de interesse em amostras polidas que inclui grade nanoindentação indicado por pontos de referência, no final de cada linha de travessões.
   2. Assegurar HV é pelo menos de 15 kV, a corrente do feixe é de pelo menos 3,9 nA, e distância de trabalho é maior do que 5,0 mm.
   3. Capturar imagem da região a ser analisados ​​por meio de EDX BSE.
   4. Usando o software de análise de EDX, capturar a mesma imagem para auxiliar na localização de áreas para realizar análise química ao longo da linha de travessões.
   5. Usando a "Análise Line" técnica, poção de uma linha para realizar análise química ao longo da linha de interesse de travessões começando no primeiro travessão e terminando no último travessão.
   6. Especifique o número de pontos de análise para ser colocado ao longo da linha. É preferível usar o mesmo número de pontos de análise e travessões que estão presentes para proporcionar uma correlação espacial directa entre a composição química e as propriedades mecânicas.
   7. Quando a linha está posicionada e pontos especificados corretamente, inicie a análise de linha usando o software EDX.
   8. Quando a análise de linha é completada, a identificar elementos de interesse a serem quantificados a partir dos espectros ponto obtido ao longo da linha indicada na superfície polida do espécime.
   9. Uma vez que os elementos de interesse são identificados, realizar uma calibração de fundo para explicar a radiação Bremsstrahlung e outros efeitos.
   10. Escolha a opção de análise de deconvolução do software para obter uma análise quantitativa em cada ponto ao longo da linha especificada para quantificartificar a composição química de cada ponto.
   11. Salve os resultados quantitativos de análise química, juntamente com a imagem de linha especificado que foi analisado para ajudar na correlação espacial com propriedades mecânicas medidas através de nanoindentação.

Resultados

A Figura 3 mostra os resultados médios dos espacialmente correlacionados nanoinidentation / SEM / EDX análises realizadas em toda a aproximadamente 800 um longo eixo curto secção transversal. Na camada ganoine aproximadamente 60 mm de espessura, o nanoindentador calculado um módulo média de 69,0 GPa e a dureza de 3,3 GPa. O nanoindentador determinado um módulo de elasticidade média de 14,3 GPa e a dureza de 0,5 GPa para a camada de cerca de 740 mM de espessura do osso.

EDX determinado carbono, oxigênio, cálcio e fósforo, que são normalmente encontrados em escalas mineralizados. No entanto, as camadas ganoine e osso continha diferenças quantificáveis ​​no composições químicas. O pico observado de carbono na camada de osso pode ser atribuído a que a região de não ser tão altamente mineralizado, o que resulta num ligeiro aumento no carbono que também causou o decréscimo observado no brilho total da imagem de BSE. Especificamente, a camada ganoine ', S significa taxa de concentração atômica de Ca: P de 1,71 apareceu semelhante à hidroxiapatita com uma relação teórica de 1,67. Ca média da camada de osso: P diminuiu para 1,51 representando uma diminuição na quantidade de mineralização da camada ganoine.

Os espectros de FTIR na Figura 4 para a camada de osso e camada ganoine identificados os principais grupos funcionais como amida, carboxílico, fosfato, e carbonilo. Especificamente, FTIR confirmaram a observação visual de assinaturas de hidroxiapatita nas exterior (ganoine) e camada de colágeno na camada de assinaturas (osso) interior. Picos de 3,500-3,000 cm ^-1 devido ao alongamento e NH NH dobrar entre 1550 e 1500 ^cm-1 representam grupos amida na camada óssea. Picos na região do número de onda 1,470-1,365 cm ^-1 representam grupos alquilo substituído de amida. Além disso, um distintivo C = O alongamento em 1641 centímetros ^-1 foi observada sobre a camada de osso. Ervilhaks de 3,000-2,500 cm ^-1 representam grupos carboxílicos. Espectros camadas Tanto o osso e ganoine 'produziu um pico característico próximo 1,079.33 cm ^-1 indicativos de alongamento fosfato.

Imagética CT de raios-X na Figura 5 que a camada de captura ganoine não cobre a camada de osso onde a balança se sobrepõem um ao outro. As camadas mais brilhantes ganoine cinza indicam fases mais densas, mais difícil e mais duras, enquanto as camadas mais escuras osso cinza indicam fases menos densas e menos rígidos. Além disso, a imagem de raios-X CT auxiliado na identificação da falta de uniformidade na camada de espessura ganoine. Na verdade, os poços claras são observados perto do centro da camada de ganoine, que não cobrem a camada de osso em todos.

A imagem de SEM na Figura 6A da superfície de fratura gravado com H ₃ PO ₄ revelou nanoestruturas organizadas em um padrão em camadas para a camada ganoine. Este organizou-nanorodestrutura correlaciona-se com as assinaturas de hidroxiapatita obtidos a partir do FTIR para a área do ganoine.

Figura 6A mostra um típico menor ampliação SEM micrografia de uma superfície de fratura identificando claramente a transição entre as camadas ganoine e osso com a linha tracejada. Figura 6B retrata as imagens de alta ampliação SEM da superfície de fratura após condicionamento com H ₃ PO _4. Após o condicionamento, nanorods orientados na camada exterior ganoine são claramente identificáveis ​​enquanto uma nanoestrutura fibra como é observado na camada óssea.

Figura 3. Modulus e os dados de dureza de nanoindentação espacialmente correlacionados à composição química SEM / EDX.

Figura 4. Espectros FTIR coletadas a partir do exterior (ganoine) e interno (ósseo) camadas.

Figura 5. Raios-X que mostram imagens de TC corrosão no exterior (ganoine) camada que cobre o (ósseo) camada interna.

Figura 6. (A) imagem de baixa ampliação de SEM da superfície de fractura normal, (B), as imagens de ampliação maiores de nanorods no exterior (ganoine) e fibras no interior (bony) camadas .. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Do ponto de vista experimental, os pesquisadores precisam se lembrar que quando se trabalha com ocorrência natural de materiais biológicos, como escamas de peixe mineralizadas, relatando a localização espacial da escala em que o peixe é crítico desde que a pesquisa anterior mostrou propriedades mecânicas de escamas de peixe mineralizadas são dependentes para onde as escalas foram localizados no peixe ^4.

As propriedades mecânicas dos materiais biológicos mineralizados também demonstrou ser dependente do estado de hidratação das amostras ^4. Isso limita a utilidade desta técnica quando se tenta comparar amostras frescas que foram devidamente hidratados com os resultados publicados na literatura aberta, que utilizam amostras fossilizadas secos. Portanto, os tempos de ensaio prolongadas precisam ser evitadas para minimizar os efeitos da desidratação sobre as propriedades mecânicas de uma amostra durante nanoindentação. Estudos-piloto específicas do material são recomendadas para garantir a experimento de execução é mínimo o suficiente para não alterar o comportamento mecânico do material. Nanoindentação célula húmida, seria um método preferido para manter um estado de hidratação constante do material, se o equipamento de teste permite.

O método nanoindentação utilizado no presente estudo, o qual calculado o módulo de elasticidade da curva de descarga assume o material comporta-se como um material isotrópico elástico linear. A técnica pode ser usada com uma variedade de pontas de penetrador. No entanto, a ponta de Berkovich três lados com um semi-ângulo de 65,35 ° foi usado neste estudo. Dicas alternativas, como o canto cubo (meia ângulo = 35.36 °) são adequados para o procedimento apresentado neste manuscrito, mas, desde a ponta canto de cubo é mais aguda do que a ponta Berkovich rachaduras podem ser gerados na amostra muito menor do que com cargas a ponta Berkovich.

O polimento é uma etapa essencial para obter uma superfície lisa e plana, com um surfac minimizadae rugosidade para não afetar os resultados de nanoindentação. As etapas de polimento apresentados no texto são um procedimento sugerido que talvez precise ser modificado, dependendo do tipo de polidor de ser utilizado. No entanto, o passo crítico para assegurar que os dados nanoindentação preciso é que a rugosidade da superfície é minimizado, e por este material em particular foi necessário um 50 nm polonês final para a obtenção de uma superfície lisa e plana nas profundidades de entalhe ser sondadas.

O espaçamento dos travessões também assegura que os dados nanoindentação preciso que não é influenciado pela deformação do material que ocorre a partir de travessões anteriores. O manual do usuário nanoindentador para o equipamento neste estudo sugeriu que espaçamento do recuo deve ser de pelo menos 20 a 30 vezes a profundidade máxima de penetração para Berkovich penetradores ^15. Para materiais alternativos, o espaçamento de recuo necessária terá de ser determinado com base na carga aplicada e a profundidade máxima de recuo, como discutido anteriormente em abertoliteratura ^16,17. Além disso, o tempo de espera para este material foi escolhido para superar qualquer deformação observada para as diferentes fases de material sondadas para permitir método de análise Oliver-Pharr do software nanoindentador para ser utilizado. No entanto, como discutido por Oyen ¹⁸ métodos de análise de alternativas estão disponíveis para materiais biológicos quando as respostas materiais dependentes do tempo não podem ser superados com o tempo de espera adequados.

Para alcançar resultados de alta resolução de Ray-X CT, várias configurações devem ser otimizados. Este documento descreve um conjunto muito específico de parâmetros para o uso em uma escala de peixes com um tamanho único e espessura em camadas. Com diferentes tamanhos de amostra, estas definições terão de ser ajustados para obter um conjunto de dados da mais alta qualidade. O processo de seleção de cada parâmetro devem ser claramente definidas no manual do usuário que vem com a máquina que está sendo usada. As configurações de digitalização (tensão, corrente, exposição, seleção de filtro) e configurações de reconstrução(artefatos de anel, endurecimento do feixe) talvez precise ser modificado para acomodar uma variedade de outros tamanhos de amostra e geometrias.

De raios-X CT fornecida uma imagem da morfologia escala inteira identificando uma camada ganoine cobrindo a camada óssea do material quando as escalas não se sobrepõem uns aos outros. As imagens CT de raios-X também identificou que a camada ganoine consistia em uma espessura não uniforme ao longo da escala, e poços ainda exibiram que faltaram a camada ganoine completamente.

Curiosamente, os dados nanoindentação espacialmente correlacionadas com a análise química SEM / EDX identificada uma transição discreta nítida entre as duas camadas em vez de uma transição mais gradual observada para as escamas de peixe mineralizados do p senagalus (em Bruet et al. ^2).

Uma combinação de nanoindentação, FTIR, EDX e SEM fornecido propriedade mecânica, análise química e estrutural para confirmar informaçõesa camada exterior como ganoine com morfologia e química de esmalte. Além disso, estas técnicas confirmou a camada interna como a camada óssea do material.

Em conclusão, os métodos descritos neste estudo identificou o procedimento e os resultados correspondentes para examinar a escama de peixe mineralizado de A. espátula a partir da estrutura de grandes quantidades para baixo para a nanoestrutura e composição química.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy resin	Buehler	701-501512
Epoxy hardener	Buehler	703-501528
Samplkups	Buheler	20-8180
SamplKlips I	Buehler	20-4100-100S
High precision cut-off saw	Buehler	Isomet
UltraMet 2002 sonic cleaner	Buehler	B2510R-MT
Polisher	Buehler	49-1750-160
1,200 grit (15 μm) SiC paper	Struers	40400012
4,000 grit (6 μm) SiC paper	Struers	40400014
50 nm colloidal silica	Buehler	40-10075
Chemomet polishing pad for 50 nm suspension	Buehler	40-7918
Nanoindenter	MTS	G200
FTIR continuum microscope	Thermo Nicollet	6700
X-ray computed tomography	Skyscan	Skyscan 1173
SEM	FEI	NovaNanoSEM 630
EDX	Bruker	AXS Xflash detector 4010
Sputter coater	Denton	Desk II