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Este artigo apresenta os métodos utilizados para a sondagem espacialmente correlacionada propriedades mecânicas da escala de várias camadas de Atractosteus espátula (A. espátula) utilizando nanoindentação química, estrutural, e, transformada de Fourier no infravermelho (FTIR), microscopia eletrônica de varredura (MEV), e X- ray tomografia computadorizada (CT de raio-X). Os resultados experimentais têm sido utilizados para investigar os princípios de concepção de materiais biológicos protectores.
A arquitetura hierárquica de materiais biológicos de proteção, como escamas de peixe, mineralizados conchas de gastrópodes, chifre de carneiro, galhadas, cascos de tartaruga e fornece os princípios de design únicas com potencial para orientar a concepção de materiais e sistemas de protecção no futuro. Compreender as relações estrutura-propriedade para estes sistemas materiais em microescala e nanoescala, onde a falha inicia é essencial. Atualmente, as técnicas experimentais tais como nanoindentação, CT de raios-X, e SEM fornecer aos pesquisadores uma maneira de correlacionar o comportamento mecânico com microestruturas hierárquicos desses sistemas materiais 1-6. No entanto, um procedimento padrão bem definido para a preparação de amostras de biomateriais mineralizados não está disponível no momento. Neste estudo, os métodos de sondagem espacialmente correlacionado propriedades mecânicas da escala de várias camadas de A. química, estrutural, e espátula utilizando nanoindentação, FTIR, SEM, com casaergy dispersivo microanálise de raios-X (EDX) e CT de raios-X são apresentados.
Os pesquisadores estão investigando biomateriais estruturais e estão tentando elucidar os princípios de design, que oferecem biomateriais estruturais com melhores propriedades mecânicas, tais como muito maior tenacidade e força quando comparado com os seus constituintes individuais. As investigações sobre os princípios de design de escamas de peixe blindados para Pagrus major 7, Polypterus senagalus 2,6, Arapaima gigas 3, Cyprinus carpio 4 e Atractosteus espátula 1 demonstraram a necessidade de ampliar a aplicação de métodos experimentais existentes para estudar as respostas estruturais e características microestruturais, desde procedimentos padrões detalhados não estão disponíveis para esses tipos de materiais e experiências.
Entre as diferentes escalas de peixes blindados discutidos, A. espátula é um predador historicamente ápice da central dos EUA 8 e é uma espécie com altoly escalas mineralizadas. As trocas de espécies de massa muscular para a massa de pele para obter um sistema de defesa predador melhorado em comparação com os peixes de tamanho comparável mencionado anteriormente 9. De acordo com a página e Burr 10, A. espátula é a terceira maior peixe de água doce na América do Norte com o esturjão branco (Acipenser transmontanus) e esturjão atlântico (Acipenser oxyrhynchus), sendo as espécies de maior porte. As escamas de peixe altamente mineralizadas de A. espátula são só recentemente está sendo estudado. Thompson e McCune 11 sugeriram que a morfologia das escalas gar ter uma composição de três camadas constituída por uma camada ganoine exterior, uma camada de osso difusa, e uma camada de osso lamelar. A pesquisa atual sobre o A. escalas espátula não distinguiram a camada óssea em regiões do osso lamelar ou difusa, mas tem apenas estudados região do osso como uma única camada interna 1,12.
Neste estudo, os procedimentos para avestigating a microestrutura, nanoestrutura, composição química, e as distribuições espaciais das propriedades mecânicas das escalas de A. espátula com base nos resultados da espectroscopia FTIR, SEM, X-ray CT, e as técnicas de nanoindentação são apresentados.
1. Fish Scale Preparação da Amostra
Para este estudo, as escalas foram obtidos do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento (ERDC) Laboratório Ambiental em meados de comprimento (29 ª coluna caudal) Engenheiro Exército dos EUA a partir de uma gar cerca de 600 mm de comprimento (A. espátula). As escamas de peixe foram obtidos de acordo com o Instituto de Saúde (NIH) diretrizes de cuidados de animais ERDC e Nacional.
Imagens Figura 1. CT de raios-X de A. escala espátula representando a seção transversal do eixo curto examinadas neste estudo de A. espátula utilizando nanoindentação e FTIR [A (anterior), P (posterior), D (dorsal), V (ventral)].
Figura 2. Imagem de um polido-eixo curto seção transversal A. escala espátula montados em epóxi.
2. Teste Nanoindentação
3. Spatially Resolvido ATR-FTIR Spectroscopy
A utilização de um acessório deslizante no ATR ligado a um microscópio de FTIR é um método sugerido para recolher espacialmente resolvida com transformada de Fourier de infravermelhos (FTIR) do layers em uma amostra de escama de peixe. O acessório de ATR permite a recolha de espectros de alta qualidade, com muito pequeno (~ 10 m 2) resolução espacial, o que não é atingível com qualquer outra técnica de FTIR. A mesma amostra polida (Figura 2) preparado para experiências nanoindentação foi utilizada nestas experiências.
4. X-ray tomografia computadorizada (TC)
5. SEM imagem e análise EDX
As amostras preparadas por polimento para nanoindentação e micro-/nano-structure caracterização foram examinadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Modo de baixo vácuo, foi utilizado para minimizar a desidratação dos espécimes e a necessidade de aplicação de revestimentos condutores. A análise química local foi realizada em amostras polidas em conjunto com a imagem de SEM utilizando espectroscopia de raios-X de energia dispersiva (EDX). Análise EDX foram realizadas na mesma linha / grade que foi analisado por nanoindentação, a fim de fornecer as correlações entre as propriedades mecânicas e químicas. Superfícies fraturadas recentemente também foram examinados por MEV para fornecer melhores informações sobre a morfologia e orientação das estruturas biomineralized presentes nas escamas de peixe. Para melhorar a resolução para a observação da estrutura de nano-escala em superfícies fraturadas, os espécimes foram pulverização catódica revestido com ouro (Au) e fotografada no modo de alto vácuo. A seguirfornece detalhes adicionais sobre os procedimentos utilizados.
A Figura 3 mostra os resultados médios dos espacialmente correlacionados nanoinidentation / SEM / EDX análises realizadas em toda a aproximadamente 800 um longo eixo curto secção transversal. Na camada ganoine aproximadamente 60 mm de espessura, o nanoindentador calculado um módulo média de 69,0 GPa e a dureza de 3,3 GPa. O nanoindentador determinado um módulo de elasticidade média de 14,3 GPa e a dureza de 0,5 GPa para a camada de cerca de 740 mM de espessura do osso.
EDX determinado carbono, oxigênio, cálcio e fósforo, que são normalmente encontrados em escalas mineralizados. No entanto, as camadas ganoine e osso continha diferenças quantificáveis no composições químicas. O pico observado de carbono na camada de osso pode ser atribuído a que a região de não ser tão altamente mineralizado, o que resulta num ligeiro aumento no carbono que também causou o decréscimo observado no brilho total da imagem de BSE. Especificamente, a camada ganoine ', S significa taxa de concentração atômica de Ca: P de 1,71 apareceu semelhante à hidroxiapatita com uma relação teórica de 1,67. Ca média da camada de osso: P diminuiu para 1,51 representando uma diminuição na quantidade de mineralização da camada ganoine.
Os espectros de FTIR na Figura 4 para a camada de osso e camada ganoine identificados os principais grupos funcionais como amida, carboxílico, fosfato, e carbonilo. Especificamente, FTIR confirmaram a observação visual de assinaturas de hidroxiapatita nas exterior (ganoine) e camada de colágeno na camada de assinaturas (osso) interior. Picos de 3,500-3,000 cm -1 devido ao alongamento e NH NH dobrar entre 1550 e 1500 cm-1 representam grupos amida na camada óssea. Picos na região do número de onda 1,470-1,365 cm -1 representam grupos alquilo substituído de amida. Além disso, um distintivo C = O alongamento em 1641 centímetros -1 foi observada sobre a camada de osso. Ervilhaks de 3,000-2,500 cm -1 representam grupos carboxílicos. Espectros camadas Tanto o osso e ganoine 'produziu um pico característico próximo 1,079.33 cm -1 indicativos de alongamento fosfato.
Imagética CT de raios-X na Figura 5 que a camada de captura ganoine não cobre a camada de osso onde a balança se sobrepõem um ao outro. As camadas mais brilhantes ganoine cinza indicam fases mais densas, mais difícil e mais duras, enquanto as camadas mais escuras osso cinza indicam fases menos densas e menos rígidos. Além disso, a imagem de raios-X CT auxiliado na identificação da falta de uniformidade na camada de espessura ganoine. Na verdade, os poços claras são observados perto do centro da camada de ganoine, que não cobrem a camada de osso em todos.
A imagem de SEM na Figura 6A da superfície de fratura gravado com H 3 PO 4 revelou nanoestruturas organizadas em um padrão em camadas para a camada ganoine. Este organizou-nanorodestrutura correlaciona-se com as assinaturas de hidroxiapatita obtidos a partir do FTIR para a área do ganoine.
Figura 6A mostra um típico menor ampliação SEM micrografia de uma superfície de fratura identificando claramente a transição entre as camadas ganoine e osso com a linha tracejada. Figura 6B retrata as imagens de alta ampliação SEM da superfície de fratura após condicionamento com H 3 PO 4. Após o condicionamento, nanorods orientados na camada exterior ganoine são claramente identificáveis enquanto uma nanoestrutura fibra como é observado na camada óssea.
Figura 3. Modulus e os dados de dureza de nanoindentação espacialmente correlacionados à composição química SEM / EDX.
Figura 4. Espectros FTIR coletadas a partir do exterior (ganoine) e interno (ósseo) camadas.
Figura 5. Raios-X que mostram imagens de TC corrosão no exterior (ganoine) camada que cobre o (ósseo) camada interna.
Figura 6. (A) imagem de baixa ampliação de SEM da superfície de fractura normal, (B), as imagens de ampliação maiores de nanorods no exterior (ganoine) e fibras no interior (bony) camadas .. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Do ponto de vista experimental, os pesquisadores precisam se lembrar que quando se trabalha com ocorrência natural de materiais biológicos, como escamas de peixe mineralizadas, relatando a localização espacial da escala em que o peixe é crítico desde que a pesquisa anterior mostrou propriedades mecânicas de escamas de peixe mineralizadas são dependentes para onde as escalas foram localizados no peixe 4.
As propriedades mecânicas dos materiais biológicos mineralizados também demonstrou ser dependente do estado de hidratação das amostras 4. Isso limita a utilidade desta técnica quando se tenta comparar amostras frescas que foram devidamente hidratados com os resultados publicados na literatura aberta, que utilizam amostras fossilizadas secos. Portanto, os tempos de ensaio prolongadas precisam ser evitadas para minimizar os efeitos da desidratação sobre as propriedades mecânicas de uma amostra durante nanoindentação. Estudos-piloto específicas do material são recomendadas para garantir a experimento de execução é mínimo o suficiente para não alterar o comportamento mecânico do material. Nanoindentação célula húmida, seria um método preferido para manter um estado de hidratação constante do material, se o equipamento de teste permite.
O método nanoindentação utilizado no presente estudo, o qual calculado o módulo de elasticidade da curva de descarga assume o material comporta-se como um material isotrópico elástico linear. A técnica pode ser usada com uma variedade de pontas de penetrador. No entanto, a ponta de Berkovich três lados com um semi-ângulo de 65,35 ° foi usado neste estudo. Dicas alternativas, como o canto cubo (meia ângulo = 35.36 °) são adequados para o procedimento apresentado neste manuscrito, mas, desde a ponta canto de cubo é mais aguda do que a ponta Berkovich rachaduras podem ser gerados na amostra muito menor do que com cargas a ponta Berkovich.
O polimento é uma etapa essencial para obter uma superfície lisa e plana, com um surfac minimizadae rugosidade para não afetar os resultados de nanoindentação. As etapas de polimento apresentados no texto são um procedimento sugerido que talvez precise ser modificado, dependendo do tipo de polidor de ser utilizado. No entanto, o passo crítico para assegurar que os dados nanoindentação preciso é que a rugosidade da superfície é minimizado, e por este material em particular foi necessário um 50 nm polonês final para a obtenção de uma superfície lisa e plana nas profundidades de entalhe ser sondadas.
O espaçamento dos travessões também assegura que os dados nanoindentação preciso que não é influenciado pela deformação do material que ocorre a partir de travessões anteriores. O manual do usuário nanoindentador para o equipamento neste estudo sugeriu que espaçamento do recuo deve ser de pelo menos 20 a 30 vezes a profundidade máxima de penetração para Berkovich penetradores 15. Para materiais alternativos, o espaçamento de recuo necessária terá de ser determinado com base na carga aplicada e a profundidade máxima de recuo, como discutido anteriormente em abertoliteratura 16,17. Além disso, o tempo de espera para este material foi escolhido para superar qualquer deformação observada para as diferentes fases de material sondadas para permitir método de análise Oliver-Pharr do software nanoindentador para ser utilizado. No entanto, como discutido por Oyen 18 métodos de análise de alternativas estão disponíveis para materiais biológicos quando as respostas materiais dependentes do tempo não podem ser superados com o tempo de espera adequados.
Para alcançar resultados de alta resolução de Ray-X CT, várias configurações devem ser otimizados. Este documento descreve um conjunto muito específico de parâmetros para o uso em uma escala de peixes com um tamanho único e espessura em camadas. Com diferentes tamanhos de amostra, estas definições terão de ser ajustados para obter um conjunto de dados da mais alta qualidade. O processo de seleção de cada parâmetro devem ser claramente definidas no manual do usuário que vem com a máquina que está sendo usada. As configurações de digitalização (tensão, corrente, exposição, seleção de filtro) e configurações de reconstrução(artefatos de anel, endurecimento do feixe) talvez precise ser modificado para acomodar uma variedade de outros tamanhos de amostra e geometrias.
De raios-X CT fornecida uma imagem da morfologia escala inteira identificando uma camada ganoine cobrindo a camada óssea do material quando as escalas não se sobrepõem uns aos outros. As imagens CT de raios-X também identificou que a camada ganoine consistia em uma espessura não uniforme ao longo da escala, e poços ainda exibiram que faltaram a camada ganoine completamente.
Curiosamente, os dados nanoindentação espacialmente correlacionadas com a análise química SEM / EDX identificada uma transição discreta nítida entre as duas camadas em vez de uma transição mais gradual observada para as escamas de peixe mineralizados do p senagalus (em Bruet et al. 2).
Uma combinação de nanoindentação, FTIR, EDX e SEM fornecido propriedade mecânica, análise química e estrutural para confirmar informaçõesa camada exterior como ganoine com morfologia e química de esmalte. Além disso, estas técnicas confirmou a camada interna como a camada óssea do material.
Em conclusão, os métodos descritos neste estudo identificou o procedimento e os resultados correspondentes para examinar a escama de peixe mineralizado de A. espátula a partir da estrutura de grandes quantidades para baixo para a nanoestrutura e composição química.
Os autores não têm nada a revelar.
Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro para este trabalho fornecido pelo 6.1 Programa de Pesquisa do Exército dos EUA ERDC Militar de Engenharia Básica e do Centro ERDC para o Programa de Pesquisa Dirigida. Os autores também gostariam de agradecer o pessoal e as instalações do ERDC Geotecnia e Concreto e Materiais Filial da Estrutural Laboratório de apoio ao trabalho experimental. A permissão para publicar foi concedida pelo Laboratório Diretor, Geotecnia e Estruturas.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Epoxy resin | Buehler | 701-501512 | |
Epoxy hardener | Buehler | 703-501528 | |
Samplkups | Buheler | 20-8180 | |
SamplKlips I | Buehler | 20-4100-100S | |
High precision cut-off saw | Buehler | Isomet | |
UltraMet 2002 sonic cleaner | Buehler | B2510R-MT | |
Polisher | Buehler | 49-1750-160 | |
1,200 grit (15 μm) SiC paper | Struers | 40400012 | |
4,000 grit (6 μm) SiC paper | Struers | 40400014 | |
50 nm colloidal silica | Buehler | 40-10075 | |
Chemomet polishing pad for 50 nm suspension | Buehler | 40-7918 | |
Nanoindenter | MTS | G200 | |
FTIR continuum microscope | Thermo Nicollet | 6700 | |
X-ray computed tomography | Skyscan | Skyscan 1173 | |
SEM | FEI | NovaNanoSEM 630 | |
EDX | Bruker | AXS Xflash detector 4010 | |
Sputter coater | Denton | Desk II |
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