Lokal ve sistemik Yer de patojen kaynaklı kronik enflamasyon Fare Modeli

Özet

Hayvan modelleri kronik inflamasyon gelişimine katkıda konak ve patojen spesifik mekanizmaları tanımlarken paha biçilmez araçlardır olduğu kanıtlanmıştır. Burada, lokal ve sistemik inflamasyon bölgelerinde ilerlemesini değerlendirmek için insan patojeni Porphyromonas gingivalis ve detay metodolojileri ile ağızdan enfeksiyondan bir fare modeli tarif eder.

Özet

Kronik inflamasyon patolojik doku hasarı ve neoplastik, otoimmün ve kronik iltihaplı hastalıklar, insanlarda pek çok kronik hastalıkların bir birleştirici özelliği önemli bir sürücüdür. Delil gelişen klinik belirtilerin çok çeşitli geliştirme ve kronik hastalıkların ilerlemesinde patojen kaynaklı kronik inflamasyon implicates. Kronik hastalığı karmaşık ve çok faktörlü etiyolojisi, nedensellik kanıtı ve mekanik bağlantıların kurulması için deney tasarlama insanlarda neredeyse imkansız. Hayvan modelleri kullanmanın bir avantajı özel bir hastalığın seyrini etkilediği, her ikisi de, genetik ve çevresel faktörler kontrol edilebilir olmasıdır. Böylece, enfeksiyon ilgili hayvan modelleri tasarlarken kronik inflamasyona katkıda konak ve patojen spesifik mekanizmaları belirlemede önemli bir adımı temsil etmektedir.

Burada patojen kaynaklı kronik Serma bir fare modeli tarifOral patojen Porphyromonas gingivalis, çok insanlarda periodontal hastalık ile bağlantılı bir bakteri ile enfeksiyondan sonra, lokal ve sistemik sitelerde mmation. Özgül patojen içermeyen farelere ağızdan enfeksiyonu alveoler kemik, periodontal hastalık bir işaretidir destek dişin tahribatı ile sonuçlanan bir inflamatuar yanıtı tetikler. P. ile kurulmuş bir fare ateroskleroz modelinde, enfeksiyon gingivalis, vasküler endotel aktivasyonu, artmış bir immün hücre infiltrasyonu ve lezyonlarında iltihap aracılarının yükselen sentezlenmesi ile birlikte aort sinüs ve iliyak arteri içindeki inflamatuar plak birikimini hızlandırır. Biz lokal ve sistemik sitelerinde inflamasyon değerlendirilmesi için ayrıntılı metodolojiler. Transgenik farelerden ve tanımlı bakteriyel mutantlarının kullanımı ana ve hastalığın başlaması, ilerlemesi ve sonuç olarak ilgili mikrobiyal faktörlerini tanımlamak için bu model özellikle uygun hale getirir. Additionally modeli aşı ve farmakolojik müdahale dahil, yeni tedavi stratejileri, taranması için de kullanılabilir.

Giriş

Kronik inflamasyon patolojik doku hasarı ve insanlarda birçok kronik hastalıkların bir birleştirici özelliği önemli bir sürücüdür. Bu hastalıklar neoplastik, otoimmün ve kronik enflamatuar hastalıklar ¹ içerir. Birçok kronik hastalığın etyolojisi bilinmemektedir ama genetik yatkınlık ve çevresel faktörlerin de tanışmasını içeren, karmaşık ve çok faktörlü olduğu anlaşılmaktadır. Enflamasyon ettiricileri zor olmaya devam ederken immün aktivasyon hücresel ve moleküler profilleri patojenlere karşı ev sahibi tepkilerin ² gözlenen desenleri ile önemli ölçüde üst üste gelir.

Montaj kanıt mikrobiyal gelişme patojenler ve kronik inflamasyon ilerlemesi ve onun çeşitli klinik belirtiler ^2,3 ile enfeksiyon implicates. Patojenler neden ve kalıcı enfeksiyonlar konak bağışıklık sistemini yıkarak ve kurarak kronik enflamasyonu doğrudan sürdürmek ^{4. Mikrobiyal kalıcılık yokluğunda, enfeksiyon, self-antijenlere moleküler taklidin tetiklenen oto-bağışıklık tepkilerinin, imünojenik hale getirmek, self-antijenlere ya da daha önce maskeli ana antijenleri açıklamaları zarar değişikliklerden kaynaklanan kronik enflamasyonu hızlandırabilir. Nadiren, ancak spesifik patojenler özel bir kronik hastalık evrensel nedeni olarak tanımlanmıştır. Aksine, mevcut verilerin çoğunluğu patojenler genetik olarak yatkın konak 3 klinik belirtileri ve hastalık sonuçları geniş bir yelpazede ile kronik inflamasyon ortaya çıkarmak için farklı mekanizmaları kullandığını iddia. Böylece, spesifik patojenler önemli bir halk sağlığı etkileri yanı sıra, pek çok kronik hastalıkların tedavisi ve önlenmesi olabilir kronik enflamasyona neden olan mekanizmaların ayrıntılı bir anlayış.}

Kronik inflamasyon indüksiyon ve bakım katkıda konak ve patojen spesifik mekanizmalar olmasına rağmenkötü patojen kaynaklı kronik inflamasyon modellemede gelişmeler bu süreçlerin anlayışımızı ilerletmek için başladı, anladım. S. gingivalis oral enfeksiyon modeli konak ve patojen lokal (oral kemik kaybı) kronik enflamasyon katkıda özgü mekanizmaları ve sistemik siteleri (ateroskleroz) ^5,6 analizi izin verir patojen kaynaklı kronik inflamasyon eşsiz, iyi karakterize fare modelidir.

S. gingivalis insan periodontal hastalık, doku ^{7 nolu} destekleme dişin tahribatı ile karakterize edilen bir enfeksiyon kaynaklı kronik enflamatuar hastalıkta rol oynayan bir gram-negatif anaerob ağızdan patojendir. Enfeksiyonun başlangıç ​​yerinde patoloji ek olarak, artan kanıtlar P. implicates gingivalis aterosklerozun gelişiminde ve ⁵ dahil sistemik hastalıkların ilerlemesinde kronik inflamasyon -sebepli, bir hastalık kronik iltihabın özelliği, arter damar duvarının: n. P. olan spesifik patojensiz farelerde ağızdan enfeksiyonu gingivalis alveoler kemik ⁸ destek dişin tahribatıyla sonuçlanan bir inflamatuar yanıtı tetikler. P. gingivalis 42 gün Enfeksiyondan ⁸ ve farenin patogene-özgü serum antikor titrelerinin yüksek seviyelerini ⁹ geliştirmek için, enfekte edilmiş farelerin ağızlarından elde edilebilir. ^{- / -} Apo-E kullanılarak aterosklerozun yerleşmiş fare modelinde farenin (Apo ^{- / -),} P. ile ağızdan enfeksiyondan gingivalis aort sinüs ¹⁰ ve innominat arter ¹¹ inflamatuar plak birikimini sürücüler kronik enflamasyona neden olur. P. innominat arter içinde ilerici inflamasyon gingivalis farenin in vivo MRG kullanılarak canlı hayvanlarda izlenebilir ğında. Histolojik olarak, P., arter lezyonlar gingivalis farenin lipidler accompa artmış birikimini sergilemek ğındavasküler endotel aktivasyonu, artmış bir immün hücre infiltrasyonu ve iltihap aracılarının ¹² artmış ekspresyonu ile reddedilmiş. Nakavt farelerde, bu modelin kullanımı, ana sinyal parçalan ve iltihaplanma aracılan rolü, hem de hücre S. sürücü spesifik etkileşimler açıklamıştır ^{14 -} gingivalis immünopatoloji ¹² -kaynaklı. Buna ek olarak, tarif bakteriyel mutantlar kullanılarak deneyler önemli S. belirledik gingivalis lokal ve sistemik sitelerinde ¹⁵ kronik enflamasyon katkıda bulunan faktörleri virülansa.

Bu makale P. değerlendirilmesi için yöntemler detayları gingivalis lokal ve sistemik sitelerinde kronik inflamasyon -kaynaklı. Bu Witt yazılımı kullanılarak mikroBT alveol kemiği kaybı analizi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Ayrıca, biz ilerici değerlendirmesinde vivo, canlı hayvan MRG serial yararını tanımlamakinnominat arter içinde inflamasyon. Biz görselleştirme ve arteriyel lezyonlarda inflamatuar plak ölçümü için yöntemler içerir ve histolojik karakterizasyonu açıklar. Transgenik farelerden ve tanımlı bakteriyel mutantlarının kullanımı ana ve hastalığın başlaması, ilerlemesi ve sonuç olarak ilgili mikrobiyal faktörlerini tanımlamak için bu model özellikle uygun hale getirir. Buna ek olarak, model, aşı ve farmakolojik müdahale dahil, yeni tedavi stratejileri, taranması için de kullanılabilir.

Protokol

1. Büyüme ve Bakterilerin Yetiştirme

1. P. alınan şerit dondurulmuş stoklar Anaerobik kan agar plakaları üzerine gingivalis 381 ve 3 inkübe - 37 ° C'de havasız odadan (10 H% _2/10% CO _2/80, N% ₂₎ 5 gün.
2. 5 ml beyin kalp infüzyon besleyici sıvı ortamı maya ekstraktı (% 0.5), hemin (10 ug / ml) ve menadoin (1 ug / ml) ile takviye edilmiş (BHI) sıvı kültür için plaka yetişen organizmalar kullanın. O / N büyüme sonrasında, BHI 45 ml 5 mi kültürleri aktarın.
3. Bir additional18 için anaerobik 50 ml sıvı kültürler inkübe - Geç log fazı orta ila 24 saat ve hasat. Kültür NOT saflığı her zaman hayvanların içine bakteri tanıtan önce Gram boyama tarafından kontrol edilmelidir.
4. 10 dakika boyunca 7000 x g'de santrifüj ile bakteriler hasat edilir. Süpernatan aspire edin ve iyice serolojik bir pipet kullanılarak 5 ml PBS içinde bakteriyel hücre pelletini. Ilave bir ekleme10 dakika boyunca 7000 x g'de santrifüj PBS ve 45 mi. Üç yıkar toplam iki kez bu adımı tekrarlayın.
5. Son yıkamadan sonra, kültürün bir 1:10 seyreltme 660 nm (1 ₆₆₀ 10 ⁹ CFU / ml 'ye eşit olan bir OD) ile 1.0' lik bir optik yoğunluğa sahip olacak şekilde PBS ile hücre pelletini. % 2 w / v solüsyonu elde etmek için yeterli karboksimetil selüloz (viskozite orta) tartın (örneğin, kültür içinde 5 ml 0.1 g) eklenmiştir. Topaklaşmayı önlemek için vorteks edilirken yavaşça bakteriyel süspansiyona karboksimetil selüloz ekleyin.

2. Sözlü Enfeksiyon

NOT: Şekil 1'de gösterildiği gibi, uygun fare modeli ve oral enfeksiyon rejimi, S. kullanılarak gingivalis kronik inflamasyon ve Immunopathology yerel (oral kavite) de ve sistemik siteleri (arter) neden olur.

1. Sülfametoksazol yönetme (0,87 mg / ml) ve trimetoprim (0.17 mg / mL) (Sulfatrim) 8-hafta-o kadar altı2 hafta boyunca, içme suyundaki istenildiği miktarda ld erkek fareler normal florasına azaltmak için. Amber cam şişelerde antibiyotik çözüm tutun ve bozulmasını önlemek için ışıktan korumak.
2. Antibiyotik çözeltisinin tortulaşmasını önlemek için, (sabah ve öğleden sonraları, örneğin) bir kere ya da günde iki kez şişe çalkalanır. 5 gün - her 3 yeni hazırlanmış bir solüsyonu ile değiştirin.
3. İki hafta sonra, içme suyu ile, geleneksel antibiyotik çözeltisi yerine. Önce oral enfeksiyona 2 günlük antibiyotik dinlenme süresi tanıyın.
4. P. yükleyin bağlı bir besleme iğnesi ile 1 ml tüberkülin şırınga içine gingivalis / taşıt süspansiyon. Elle onların boynunun arkasındaki ense kapma fareyi dizginlemek. Kavrama fare başının hareketliliğini kısıtlamak için yeterli sağlam olduğundan emin olun.
5. P. topikal uygulama ile enfekte fareler maxillae bukkal yüzeyinde gingivalis. Besleme iğne gibi tha yerleştirint sağ maksiller azı dişlerinin yanak yüzeyi ile hizalanmış ve bakteriyel süspansiyonun 50 ul çıkarma edilir. Besleme iğnesi topu kullanılarak 1 dakika boyunca diş eti boyunca yavaşça çözelti içinde dağıtılır.
6. Fare sol üst çene üzerinde tekrarlarken 30 saniye ile 1 dakika arasında bir süre boyunca dinlenmeye bırakın. Kontrol fareleri antibiyotik tedavi öncesi ve ağızdan lastik sonda ile araç ile tek başına (PBS içerisinde% 2, karboksi metil selüloz), alır.
7. 2 gün aralıklarla farelere 3 kez enfekte alveol kemik kaybı kaynaklı yerel bölgelerde patojen kaynaklı kronik inflamasyonu incelemek için. MikroBT kemik kaybının değerlendirilmesi için 6 hafta sonra fareler kurban.
8. 3 hafta boyunca farelere 5 kez bir hafta ^{- / -} lokal ve sistemik sitelerinde patojen kaynaklı kronik inflamasyon incelemek için, ateroskleroz eğilimli Apo bulaştırmak.
   Not: Kalça arter hastalığın ilerlemesi vivo seri MR ile izlenir. Resim değişik zaman noktalarında tutulan farelerin ve 6-16 geç wks kurbanr. Kurban zamanda, yüz analizi tr küresel aterosklerotik yükü değerlendirmek ve mikroBT tarafından alveol kemik kaybını belirler. Histoloji ve immünhistokimya aterosklerotik lezyon karakterize eder.

3. Tomografi (MikroBT'lerin) Mikro-bilgisayarlı

1. Numune Hazırlama
   1. Istediğiniz zaman noktası sonrası enfeksiyon fareler kurban. CO ₂ asphyxation veya kurumun hayvan tesis tarafından onaylanan başka bir yöntemle fareler Euthanize.
      Not: başka bir yerde tarif edildiği gibi ^anti-9 P.gingivalis IgG analizi için -80 ° C 'de, kalp ponksiyonu, ayrı serum ve mağaza tarafından kan toplamak.
   2. Kafatasının dibinde şiddetli fare kafasına dekapitasyondan makas büyük bir çifti kullanmak. Forseps bir çift eti çıkarın ve sonra% 4 tampon paraformaldehit 30 ml içeren 50 ml'lik konik bir tüp içine kafatası yerleştirin. 4 ° C'de 48 saat - 24 için örnek sabitleyin.
   3. Sabitleme, rins ardındanPBS ile iyice örnek e.
   4. Maksiller blok biyopsiler oluşturun.
   5. MikroBT değerlendirmesine kadar, 4 ° C 'de histolojik notu% 70 EtOH içinde yarı-maksilla saklayın.
2. Görüntü Alma
   1. Bir masaüstü MikroBT'lerin tarayıcı kullanarak görüntü satın almalar gerçekleştirin. 114 uA bir akımı ve 70 kV gerilim için X-ışını kaynağı ayarlayın. Görüntüleme kabına bireysel hemi-maxillae yükleyin ve her üç mekansal boyutları 12 mikron çözünürlükte tarayın.
      NOT: görüntüleme geminin içinde aynı anda birkaç hemi-maxillae yükleyin.
   2. Kullanıcı sistemini kullanarak görüntü elde etmek için sınırlarını belirler ve faiz (ROI) bölgeye tarama kısıtlamak sağlayan bir ön düşük çözünürlüklü tarama gerçekleştirin.
      NOT: Minenin yoğunluğu maksiller molar dişlerin taç kolayca ayırt yapar. Üç azı dişi ve çevresindeki alveol bon kapsayacak bir rehber olarak görüntüleme sınırları azılarını gevşek set kullanmaör. Bu işlev, aynı kabı içinde çok sayıda örneğin tararken, bağımsız, yarı-maxillae ayırt etmek için kullanılır.
   3. Tarama tamamlandığında, ham görüntü dosyalarını yüksek kaliteli dicoms içine (.ISQ) (.DCM) dönüştürmek.
3. Görüntü Analizi
   Bu protokol, görüntü analizi, bir veri görselleştirme, işleme ve analizi yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. İlk olarak, sement (CEJ) için en uygun bir düzlemi oluşturmak için morfolojik işaretlerini kullanın. Sonra alveol kemik hacmi sonraki ölçümü için standart bir yönelim içine hemi-maksilla dönüştürmek için kullanın.
   1. Yazılımını açın ve Havuz sol üst köşesinde bulunan "Open Data" simgesini tıklatın. Alternatif olarak,> Aç veri dosyasını kullanabilirsiniz.
   2. DICOM görüntü yığını seçin ve Yükle'yi tıklatın. DICOM Yükleyici penceresi görüntülenir. Tamam'a tıklayın.
   3. Havuzda yeşil simgesi olarak belirlenen verileri dikkate alınmalıdır. Veri nesnesi tıklayarak ek neden dikkat edin amaton Havuz üstündeki düğme alanında görüntülenecek. Simgesini seçerek de Properties Alanında görüntülenecek veri kaydının hakkında bazı bilgiler neden olur.
   4. Havuz Her ikon farklı modülleri seçilebilir hangi bir açılır menü sağlar. Veri simgesinin sağ köşesinde beyaz oka tıklayarak açılan menüsünü etkinleştirin. Ekran modülü altında, Isosurface (Ekran> Isosurface) seçeneğini seçin. Isosurface Simge Havuz alanı görünecektir. Seçildiğinde, ek ayarlar Özellikleri Bölgesindeki görünür.
   5. Şeffaf Çiz Stil ve 2,000 Eşiği ayarlayın. Emin compactify olun ve altörnekleyebilirsiniz düğmeleri seçenekleri altında seçilir. Ortalama altında, x, y ve z, her isosurface oluşturmak için uygulama 2. tıklayın ayarlanır emin olun.
      NOT: 3B görüntüleyici hemi-maksilla şeffaf bir 3 boyutlu rekonstrüksiyon gözlemleyin. Görüntü rekonstrüksiyonu için şeffaf bir beraberlik tarzı kullanarak yararı olduğunu azı dişlerinin kökleri olabilirkolayca tespit edilebilir. Standart yönelim içine numune koyarak bu önemli olacaktır.
   6. Yeşil veri simgesini seçin ve Özellikler Alanında kırpma simgesini seçin. Boyutları ve verilerin koordinatlarını içeren bir pencere dikkate alınmalıdır. Şimdi kenara bu ayarlayın. Bir sınırlayıcı kutu her köşesinde yeşil sekmeleri ile 3B görüntüleyicide dikkat edin.
   7. Izleyici araç çubuğundaki Etkileşim düğmesini seçin. Tıklayarak ve yeşil köşeleri sürükleyerek sınırlayıcı kutunun boyutunu değiştirin. Kutu faiz (ROI) bölgesini kapsar ve mümkün olduğunca fazla ölü alan ve kalıntıları ortadan kaldırır emin olun. Bu bilgisayardaki hesaplama talebi azaltacaktır.
   8. Tamamen sınırlayıcı kutusu tarafından kapsanır ROI sağlanması 3D görüntüleyicisi içinde nesneyi döndürmek için izleyici araç çubuğundaki Trackball düğmesini kullanın. Memnun olduğunuzda, 8. adımda kenara kırpma penceresinde Tamam 'ı tıklatın.
   9. (OB veri simgesini seçin ve ekran modülü altında Eğik Slice seçinS). (Ekran> OBS)
   10. OBS seçin. Özellikleri alanında, güzeline haritalama doğrusal türü, -200 ila 10,000 veri penceresi aralığı, ve örnekleme ayarlayın. Şimdi seçenekleri seçin altında döndürün. OBS merkezinde bir döndürme durumlu dikkate alınmalıdır.
   11. Izleyici araç çubuğundaki etkileşim düğmesini seçin ve dilimin kesme düzlemini ayarlamak için mafsallı kolları kullanın. Dişlerin oklüzal yüzeyine diş köklerine ve paralel çalışan dikey bir sajital düzlem oluşturma. Şekil 2'de gösterildiği gibi, uçak, üç molar (M1-M3) ikiye bölmek gerekir.
   12. Döndürme kapatın ve OBS (object> yinelenen nesne) yinelenen. Yeni OBS OBS 2 OBS döndürmek üzerine 2. açın adında görünür.
   13. Bu OBS 1 ile dik olacak şekilde OBS 2 yeniden yönlendirmek için döndürme kolu kullanın (Şekil 2).
   14. Dönüş OBS 2 kapalı döndürmek ve 3 yinelenen dilimler oluşturabilir. Bu OBS 3, 4, ve 5 isim olacak.
4. En Fit Plane Puan Toplama
   NOT: CEJ iyi bir uyum düzlem oluşturur boyunca Adımlar 8 puan yerini tarif 3.4.1-3.4.5. Sagital dilimleri ve koronal kesitlerden diğer dördünden puan dört seçin (bakınız Şekil 3). 3.4.6 sagital dilimleri üzerinde bulunan noktaları seçerken, bu OBS 1 ayarlamak gerekebilir.
   1. Sagital düzlemde M1 en mesial kök merkezi ile OBS 1 hizalayın. Koronal düzlemde M1 en mesial kök merkezi ile OBS 2 hizalayın.
   2. Koronal düzlemde M1 bukko-distal kökünün merkezi ile OBS 3 hizalayın. Gerekirse, Adım 20 puan seçerken yaklaşık saggital düzlemde M1 bukko-distal kök merkezlensin böylece OBS 1 ayarlayın.
   3. M2 bukkal kökleri Furkasyon ile OBS 4 hizalayın. OBS 4 M2 bukko-mesial ve bukko-distal kökleri arasındaki merkezli olmalıdır. Gerekirse, gözlenen yaklaşık 1 ortalanacak böylece wit ayarlamaksagital düzlemde M2 ​​h bukko-distal kök Adım 20 noktaları seçerek
   4. Bu koronal düzlemde M3 merkezini aşağı çalışır, böylece OBS 5 ayarlayın. Gerekirse, Adım 20 puan seçerken yaklaşık sagital düzlemde M3 en distal kökü merkezli böylece OBS 1 ayarlayın.
   5. OBSS (OBS 6) herhangi birini çoğaltın ve özellikleri penceresinde puan uygun seçin. Noktaları değiştirmek için uygun 2D veya 3D 3 veya daha fazla puan almak için araştırmacı izleyiciye içindeki nesneleri ve sonra iyi bir uyum düzlemi hesaplar verir. Bu durumda, önceki adımlarda açıklanan 2B OBSS CEJ boyunca 8 sayı seçmek için kullanılır.
   6. Veri simgesinin sağ köşesinde turuncu kutuya tıklayarak 3B izleyiciden OBS 6 gizle. Tüm 2D dilimler CEJ görünür hale getirmek için 3D görüntüleyici gelen isosurface gizle. Shift-tıklatın ve yukarıda açıklandığı gibi CEJ boyunca 8 puan seçin.
      NOT: seçerken Shift tuşuna basılı değilsenoktaları, bir uçak otomatik olarak ilk üç puandan sonra hesaplanacaktır.
   7. Tüm 8 puan seçtikten sonra, OBS 6 görünür hale. Bu yaklaşık olarak okluzal düzlemine paralel olan bir eksen dilim olduğuna dikkat edin.
5. Dönüşüm ve yönlendirilmesi NOT: en uygun düzlemi daha sonra hacim ölçümleri için standart bir konuma getirilmesi verileri dönüştürmek için kullanılır.
   1. Veri Simgesi> Compute> ApplyTransform tıklayın. ApplyTransform simgesi Pool Area görünür. ApplyTransform simgesi seçin referans köşesinde beyaz kareyi tıklatın ve OBS 6 tıklayın.
   2. Özellikler Alanında seçin enterpolasyon yöntemi standart ve modu için genişletilmiş. Dönüşüm uygulayın.
   3. Bir isosurface ve yeni veri dosyası için bir koronal OBS oluşturun. O (Şekil 2'de gösterilmiştir) M1 ile yaklaşık olarak dik olacak şekilde eksenel yönde OBS döndürün. Molar dişçiklidir ve okluzal c kullanınBir kılavuz olarak urvatures.
   4. Adımlar 3.5.1 ve 3.5.2 gibi verileri dönüştürmek için bu uçağı kullanın. Dönüştürülmüş veri dosyasını kaydedin.
6. Segmentasyon ve Kemik Hacim Ölçümü
   NOT: Aşağıdaki adımlar, alveol kemiğinin segmentasyon ve ölçüm açıklar. CeJ için en uygun olan düzlemine karşılık gelen dilim Tanımlanmış olan ve bir referans düzlemi seçilir. CeJ ve azı dişlerinin yanak yüzünde referans düzlemine alveolar kemik bölümlere ve ölçülür. M1 en mesial kökü ve M3 en distal kök olarak bitiş yerlerinden hizmet. 15-20 dilim CEJ altında referans düzlemini ayarlanması optimum sonuçlar verir. Ek dilimler İçerme olduğunu maskeleri tedavi grupları arasında kemik hacmi farklılığının değişkenliği tanıttı.
   1. Segmentasyon Düzenleyicisi'ni açın ve dönüştürülmüş verileri için yeni bir etiket oluşturun.
   2. Yeni bir malzeme yaratmak ve bunu alveol kemiği isim.
   3. Yakınlaştırma ve Veri Pencere altında veri fro aralığını ayarlayınm 10.000 -200.
   4. Display ve Gizlemenin altında 2D crosshair, 3D MPR ve 3D ses render simgeleri seçin. 2,500 ila 8,000 veri aralığını ayarlayın. Veri maskeleme etkinleştirin.
   5. Görüntüleyicisi araç çubuğunda ayarını dört İzleyiciler ekranı seçin. Ekran sajital ve koronal ve aksiyel görüntü yığınlarının eşzamanlı muayene, hem de 3D render hacmi sağlayan dört parçaya ayrılır.
   6. Emaye M1 ve M3 bukkal yüzlerinde görünür son dilim tanımlamak için dört kadran kullanın. Bu konum CeJ için en uygun olan düzleme karşılık gelir. Eksenel dilim numarasını kaydedin.
   7. Aksiyel planda, alveol kemiği tepeye doğru 15-20 dilimleri devam ediyor. Bu referans düzlemini temsil etmektedir.
   8. CEJ ve referans düzlemi arasındaki azı dişlerinin yanak yüzünde alveol kemiği seçmek için segmentasyon araçları herhangi bir kombinasyonunu kullanın. M1 en mesial kök ve uç noktalara gibi M3 en distal kök kullanın.
   9. Memnun olduğunuzda, malzeme listesinin altında Alveoler Bone seçim eklemek.
   10. Nesne havuzu dönün. Uzantısı ".Labels" ile yeni bir simge görüntü verisi simgesi eklenmelidir. Etiketler simgesini seçin ve açılan menüde> MaterialStatistics Malzemeleri seçin.
   11. Özellikleri alanında, Malzeme seçin ve uygulayın vurdu. Bir tablo malzemeler listesinde her malzeme için çeşitli parametreler görüntülenir:. Alveoler Kemik hacmini kaydedin.

Ateroskleroz 4. Değerlendirme

1. Aort diseksiyonu
   1. Istediğiniz zaman noktası sonrası enfeksiyon CO ₂ boğulma fare Kurban.
   2. Aşağı dorsal yüzü, bant üzerinde fare yerleştirin ve% 70 EtOH ile fare silin. Sadece xiphoid Yukarıda belirtilen işlem, karın ortasından ventral tarafında deri kesin.
   3. Xiphoid süreç görünür oluncaya kadar karın cildi kesin. Küçük bir pa ile xiphoid sürecini kaldırınforseps ir, göğüs kafesinin her iki tarafında kesimler yapmak ve diyaframı kesti. Sonra kalp maruz göğüs kafesinin iki tarafında aşağı iki kesim yapmak.
   4. Sağ ventrikül apeks içine yerleştirilen 27 G insülin şırınga kullanarak fareyi asıl bulbus olfaktoryusları alındı. Kan toplama sırasında periyodik olarak ventriküler duvar açıklığının tıkanmasını önlemek için, iğne döndürün. Tipik olarak, 0.8 - 1 ml kan, bu yöntem kullanılarak elde edilebilir.
   5. destek> Not: anti-IgG P.gingivalis analizi için -80 ° C'de ayırın ve serum deposu ⁹ başka bir yerde tarif edildiği gibi
   6. Sağ atrium kaldırmak için makas kullanın.
   7. Kalbin arka tarafında sol ventrikül bulun. Haznenin merkezine bakan iğne eğim ile, sol ventrikül içine, bir tepe 21 G iğne tanıtılması ve yavaş yavaş 3 ile birlikte dolaşım sistemini yıkayın - doku fiksatif 5 ml.
   8. Kalbi çevreleyen Trim yağ ve timus.
   9. Lu çıkarınNGS.
   10. Üç şube ile aort arkı bulun ve iyi poz için çevredeki yağ katmanları temizlemek.
   11. Diyaframın tabanına arktan aort diseksiyon devam edin.
   12. Karaciğer çıkarın ve inen aorta maruz bağırsak dokusu yerinden. Renal arter dalları aşağı uzak aortu disseke.
   13. Renal arterler kesin ve ileal bifurkasyon aşağı diseksiyonu devam edin.
   14. Aort en bağ dokuları arınmış sonra, aort üst dönmek ve kalp üzerinde aorta kapalı üç şube çok üst kısmını snip.
   15. Soyma kalp yukarı, vücuttan kalp ayırmak için Altındaki yağ dokuları sıkıştırılması.
   16. Forseps ile kalp tutun ve hala bağlı olabilir bağ dokusunun kesilmesi, yukarı doğru çekin, ve böbrekler aşağı devam ve bacakları aşağı takip ve mümkün olan en düşük noktada snip.
   17. Bir subse ile, 1 saat boyunca% 10 formalin içinde aorta saptamakquent PBS 1 saat boyunca yıkayın. Alternatif olarak,% 10 formalin O / N mağaza aort, ertesi gün PBS ile durulayın ve diseksiyon ile devam edin.
   18. PBS içeren 10 cm petri içine yerleştirin aort.
   19. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak, dikkatli aortadan adventisyal doku kaldırmak.
   20. Aort aşırı yağ ve doku serbest olduğunda, kalbin alt üçte ikisini kesti. Uzakta aort kavsi kalp ters sonunda kalp kasını soyulması başlayacak. Aort ampul yavaş yavaş renklenmeye beyaz olacak, görünmelidir.
   21. Aort ampuller kalp kas dokusunun özgür olana kadar iki forseps kullanarak dikkatli diseksiyon devam edin.
   22. Siyah Diseksiyon tepsiye temizlenmiş aorta yerleştirin ve PBS ile kaplayın.
2. Aort İğneleme
   1. Iğneleyerek boyunca PBS kaplı aort tutun.
   2. Sol aort ampuller ile anatomik pozisyonda aort yatıyordu.
   3. Üçte aşağıda 1'den başlayarak 5 yerlerde) aortun üst, 2) de geçici minutien işaretçilerine yerleştirinKemerin şube, femoral arter dalı yukarıda aorta 5) inen alt ucuna yakın aorta 4) inen 3) yarıda.
   4. Ekstra ince yaylı makas kullanılarak, çıkan aorta aşağıda düşük şubesine aorta kadar tüm yol femoral arter sol dalı başlayan, aort sol tarafını kesti.
   5. Çatlak olan en düşük aort ampul sola tarafında kesilmiş ve aort dikey kesim boyunca kesme kavşak ulaşmak için kesim devam ediyor.
   6. Aorta kesen yatay çıkan aortun düşük dalının noktasına ulaşmak için
   7. Aort yukarıda yüksek dalına sağ tarafta yukarı kesti.
   8. Iç yüzeyini açığa çıkarmak için, her dal kesin.
   9. Geçici pinlerinin bazı kaldırmak ve katlama olmadan anatomik konumda bütün aortu aşağı bağlantılarını aort germe amacı ile kalıcı iğneler ile değiştirin. Hedef aortun iç yüzeyini açığa çıkarmaktır.
   10. Aort tüm iç yüzey görsel int serbest maruz kalan ve yukarıda açıkça görülebilir ve kadar iğneleyerek Devampimleri erference.
3. Lipid Boyama ve Lezyon Quantification
   1. Sudan IV boyama çözeltisi (5 mg / ml izopropanol içinde% 70) hazırlayın. İyice karıştırın ve hiçbir kristalleri mevcut olduğundan emin olmak için filtre.
   2. 50 dakika boyunca Sudan IV çözeltide Kapak tutturulmuş aorta.
   3. 5 dakika - 1 70% izopropanol ile yıkayınız. Aort geliyor su artık kırmızı kadar yavaşça ddH20 ile aort durulayın.
   4. PBS ile aort kapağı. Bir mikroskop bağlı bir yüksek çözünürlüklü kamera ile aort görüntüleri yakalayabilir ve kaydedebilirsiniz gibi dijital görüntü dosyaları (TIFF). Kalibrasyon yardımcı her görüntünün yanında bir cetvel yerleştirin.
   5. Lezyonların intima ve alan alanı belirlemek için ImageJ yazılımı kullanarak. Manuel alanı belirlemek için intimal yüzey iz. Lezyon alanı otomatik renk eşikleme kullanılarak hesaplanabilir. Bu, normal bölgelerden lezyonları ayrımcılık bir renk yoğunluğunu tanımlamak için bir eşik ayarı gerektirir.
   6. Yüzdesini hesaplayınaterosklerotik lezyonlar kapsadığı intimal yüzeyi.

Aterosklerotik lezyonların 5. histolojik değerlendirilmesi

1. Kalp dokusu ile aort arkı hasat ve tek bir baz kalıp OKT batırmayın.
2. 5 um Seri halinde kriyoseksiyonlar -17 ° C 'ye ayarlanmış bir kriyostat kullanarak aort sinüs ve iliyak arteri her 50 um toplamak ve mikroskop lamları üzerine doku bölümleri monte edin. Mağaza bir sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de kayar.
3. Hematoksilen & eozin uygun prosedürleri kullanarak histolojik değerlendirilmesi, leke.

Aterosklerotik lezyonların 6. immünohistokimyasal Karakterizasyonu.

Genel bir antikor bazlı protokol rutin istihdam Aşağıdaki adımlar P. aterosklerotik lezyonları değerlendirmek için gingivalis fareler ğında. Bu protokol, her bir antikorun veya reaktifin için optimizasyon gerektirir.

1. Dondurucu slaytları çıkarın ve düzeltmekbuz soğukluğunda fiksatif (aseton ya da sabitleyici madde) olarak 2 dakika boyunca karıştırılır.
2. Slaytlar RT gelip bir çözücü dayanıklı kalem ile etiketlemek için izin ver.
3. Durulama doku dondurma matrisini PBS içinde 3 x slaytlar
4. 10 dakika boyunca% 0.3 H PBS ₂ O ₂ çözeltisi slaytlar kuluçkaya tarafından, endojen peroksidaz aktivitesini engellemek.
5. Durulayın 2 dakika her zaman için PBS 3x slaytlar.
6. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tamponu (PBS içinde% 10 tavşan serumu) içinde inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma bloke eder.
7. % 10 tavşan serumu birincil antikor 1:50 seyreltin.
8. Slayt üzerinde doku kesitlerine seyreltilmiş antikor uygulayın.
9. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
10. Durulayın 2 dakika her biri için PBS içinde 3x slaytlar.
11. 100,% 10 tavşan kanı: ikincil antikor 1 biyotinlenmiş anti-sıçan seyreltin.
12. Slayt üzerinde doku bölümleri için de geçerlidir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
13. Durulayın 2 dakika her biri için PBS içinde 3x slaytlar.
14. DAB alt-tabaka eklenmesi ile bir çözelti hazırlayınHer 1 ml DAB tampon DAB kromojeninin 1 damla.
15. Slaytlar PBS boşaltın ve DAB substrat çözümü uygulayın. Kayar parçalar 5 dakika boyunca ya da istenen renk yoğunluğu elde edilene kadar inkübe izin verin.
16. 2 dakika her biri için suda yıkayın 3x.
17. Hematoksilen ile Sayaç leke.
18. Alkol 4 değişimi (% 95 1 dakika,% 95 1 dakika,% 100, 1 dakika ve% 100 5 dakika) yoluyla kurutmak.
19. Ksilen 3 değişiklikleri Temizle.
20. Montaj çözümü kullanarak lamel ve mikroskop ile kalitatif analiz. Kantitatif analiz için, görüntü elde ve otomatik bir eşik kullanılarak ImageJ ile boyama alanı hesaplamak.

7. MRG

1. MRG için Hayvan Hazırlık
   1. MR deneyler önce fareler anestezi. Indüksiyon odasında 2-3 dakika boyunca% 4 buharlaşmış izofloran ile anestezi ilk uyarılmasını gerçekleştirin. 0,5 sürekli bir akışı kullanarak görüntüleme süresi boyunca anestezi bakımı -% 2 izofloran delivere buharlaşmışBir burun konisi kurulumu ya da maske yoluyla d.
   2. Anestezi (yani, ayak tutam cevap) ameliyatın ulaştıktan sonra, bir burun hunisi yerleştirilmiş sivri ucu ile bir hayvan tutucuya fare. Görüntüleme sırasında olası hareketini en aza indirmek için kullanılabilir piyasada mevcut hayvan sahiplerinin çeşitli türleri vardır. Biz bir lokma bar ile özel tasarlanmış tutucu kullanın.
   3. Solunumu ve kalp döngüsü izlemek ve görüntü alma, küçük bir hayvan izleme ve yolluk sistemi ile donatılmış (mouse karnına yerleştirilen) bir solunum yastık kullanarak senkronize.
   4. Laboratuvar film ile hayvan sahibinin üzerine fare ve izleme sistemi sabitleyin.
2. MR veri toplama
   1. 30 mm dikey prob (Mikro 2.5) içine sırtüstü pozisyonda ilk fare kafası hayvan tutucu yerleştirin 23 ° C'de muhafaza ve içine 11.7 T MRG tarayıcısı dikey taşıyordu.
   2. T merkezi ile tutucu hizalayıno bobin rf.
   3. Tek bir darbe dizisi kullanarak bir layneri süreci yürütüyoruz.
   4. Bir NADİR dizisi kullanarak, eksenel koronal ve sagital görüntüler oluşturmak için üç ortogonal yönelimleri boyunca izci görüntü kazanır.
   5. Bir düşük çözünürlüklü Manyetik Rezonans Anjiyografi (MRA) aşağıdaki parametreleri ile bir ungated 3D gradyan eko sekansı kullanılarak gerçekleştirin: döşeme kalınlığı = 1,5 cm; Flip açısı = 45 °; tekrarlama süresi = 20 ms; eko zamanı = 2.2 ms; görüş alanı = 1.5 × 1.5 × 1.5 cm; matris = 64 × 64 × 64; Ortalama = 1. Toplam tarama zamanı sayısı: 2~3 Min. Bu tarama amacı görüntüleri, hedef bölgesine (Kalça arter) 'da olduğu sağlamaktır.
   6. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir ungated 3D gradyan eko sekansı ile innominat arterin yüksek çözünürlük MRA gerçekleştirin: döşeme kalınlığı = 1.5 cm; Flip açısı = 45 °; tekrarlama süresi = 20 ms; eko zamanı = 2.2 ms; görüş alanı = 1.5 × 1.5 × 1.5 cm; Matris = 128 ve# 215; 128 × 128; Ortalama = 4. Toplam tarama zamanı sayısı ~ 25 dk.
   7. Subklavyan bifurkasyonunda altında innominat arter 0.5mm sürekli eksenel görüntüler elde.
3. MR veri analizi
   1. Tarayıcı ile ilişkili görüntüleme yazılımı kullanarak görüntü rekonstrüksiyon ve analiz gerçekleştirin. Maksimum Yoğunluk Projeksiyonu tarafından MRA görüntülerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon ulaşmak.
   2. Farklı küçük farelerden veya farklı zaman noktalarında aynı fareden alınan veri hizalamak anatomik bir markeri olarak subklavyen çatallanma kullanın. Subclavianbifurcation altında 0,5 mm mesafeye 0.3- de innominat arterin hedef kesiti seçin.
   3. Tanımlayın ve ImageJ ile seçilen kesitin lümen alanını hesaplamak. Ölçümler iki bağımsız gözlemci tarafından kör bir şekilde yapılmalıdır. Içi korelasyon katsayıları hesaplanarak ölçüm tekrarlanabilirliği doğrulayın.
   4. Seri imag ile uzunlamasına çalışmalar içinmuamele, her bir fare için taban (çalışmada ilk kutu) elde edilen lümen alanına lümen alanını normalleştirmek. Zamanla lümen alanında değişim olarak sonuçlarını ifade.
   5. Uygun istatistiksel analizler gerçekleştirmek (yani, öğrenci t testi) deney grupları arasında anlamlı farklılıkları belirlemek.

Sonuçlar

Uygun fare modeli ve oral enfeksiyon rejimi, S. kullanma gingivalis kronik inflamasyon ve Immunopathology yerel (oral kavite) seviyesinde ve sistemik the (atardamar) (Şekil 1) indükler.

Farelerde, P. ile ağızdan enfeksiyondan gingivalis alveoler kemik ⁸ destek dişin yok edilmesini sağlayan bir inflamatuar yanıtı tetikler. P. gingivalis farenin ağırlıklı IgG izo ⁹ vardır, bu organizma için, serum...

Tartışmalar

S. gingivalis ağızdan enfeksiyon modeli lokal ve sistemik siteleri patojen kaynaklı kronik enflamasyon çalışma için değerli bir araç sağlar. Bu benzersiz model, kronik inflamasyon ve İmmünopatolojiye katkıda hem ev sahibi ve patojen spesifik mekanizmaların karakterizasyonu izin verir. Buna ek olarak, bağışıklık kazandırma ve model farmakolojik müdahale dahil, yeni tedavi stratejileri, taranması için de kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen adımlar P. başlamasını, ilerleme...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira analysis software	Visualization Sciences Group
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500	Microbiology International
BHI	Becton-Dickinson	211059
Hemin	Sigma-Aldrich	51280-5G
Menadione (Vitamin K)	Sigma-Aldrich	M5625-25G
Yeast Extract	Becton-Dickinson	212750
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity)	Sigma-Aldrich	C-4888
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml	Hi-Tech Pharmacal	NDC 50383-823-16
μCT 40	Scanco
HistoChoice Tissue Fixative	Sigma-Aldrich	H2904
Sudan IV	Sigma-Aldrich	S4261-25G
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH
Rat anti-mouse F4/80	Serotec	MCA497R
Rat anti-mouse TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 dissecting scope	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm